Immagini dal vivo del ependimale Cilia nei ventricoli laterali del cervello di topo

Riepilogo

Utilizzando ad alta risoluzione di contrasto di interferenza differenziale (DIC) microscopia, un ex vivo osservazione del battito di ciglia motile ependimale situato all'interno il mouse ventricoli cerebrali è dimostrata dal live-imaging. La tecnica consente una registrazione della frequenza battito ciliare unico e battendo angolo come pure i loro calcio intracellulare proprietà oscillazione stimolazione.

Abstract

Cellule ependimali Multiciliated linea i ventricoli del cervello adulto. Funzione o la struttura di ciglia ependimali anormale è associata con vari deficit neurologici. L'attuale ex vivo imaging dal vivo di motilità tecnica cilia ependimale consente per uno studio dettagliato delle dinamiche ciliari dopo diversi passaggi. Questi passaggi sono: topi eutanasia con anidride carbonica secondo i protocolli della University of Institutional cura di Toledo degli animali e del Comitato uso (IACUC); craniectomy seguita dalla rimozione del cervello e sagittale dissezione del cervello con un vibratomo o lama affilata di ottenere sezioni molto sottili attraverso i ventricoli laterali del cervello, dove le ciglia ependimale possono essere visualizzati. L'incubazione delle fette del cervello in una lastra di vetro-bottom personalizzata contenente Modified Eagle Medium (DMEM) / High-Glucosio Dulbecco a 37 ° C in presenza di 95% / 5% O ₂ / CO miscela ₂ è essenziale per mantenere vivo il tessuto durantel'esperimento. Un video del pestaggio cilia viene registrato utilizzando un microscopio a contrasto di interferenza differenziale ad alta risoluzione. Il video viene poi analizzato fotogramma per fotogramma per calcolare la frequenza ciliare pestaggio. Questo permette la classificazione distinta delle cellule ependimali in tre categorie o tipi in base alla loro frequenza di battito ciliare e l'angolo. Inoltre, questa tecnica permette l'uso dell'analisi fluorescenza ad alta velocità per caratterizzare le proprietà uniche intracellulari oscillazione calcio di cellule ependimali, nonché l'effetto di agenti farmacologici sulle oscillazioni di calcio e la frequenza di battito ciliare. Inoltre, questa tecnica è adatto per immunofluorescenza di imaging per studi di struttura ciliare e localizzazione della proteina ciliare. Ciò è particolarmente importante in studi diagnosi della malattia e fenotipo. Il limite principale di questa tecnica è attribuita alla diminuzione in vivo movimento cilia motilità come il tessuto cerebrale inizia a morire.

Introduzione

Cilia sono organelli basato microtubuli sensoriali che si estendono dalla superficie cellulare per l'ambiente extracellulare. A seconda della loro organizzazione dei microtubuli, ciglia possono essere classificati in due tipi - "9 + 0" o "9 + 2". Funzionalmente, sulla base della loro motilità, questi possono essere classificati come motile o non mobili cilia ^1. Cilia primaria è un termine comunemente usato per indicare "9 + 0" cilia non mobili. Questi hanno nove microtubuli doppietto parallele (indicati con '9') e una coppia centrale di microtubuli è presenta all'interno della guaina centrale (indicato con '0'). Tuttavia, alcuni "9 + 0" cilia, come cilia nodale, che regolano embrione lateralità sono mobili ^2. D'altra parte, cilia motile sono caratterizzati, oltre alle nove doppietti microtubuli parallele, da una coppia centrale supplementare di doppietti microtubuli e associata con proteine ​​motrici dynein per facilitare la motilità. Inoltre, alcuni "9+2 "Cilia come ciglia olfattive sono non mobili ^3. Cellule ependimali rivestono i ventricoli cerebrali e il canale centrale del midollo spinale sono caratterizzati da cilia motile che spingono il liquido cerebrospinale (CSF) lungo i ventricoli cerebrali ^4.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di facilitare lo studio della motilità dinamiche ciglia e anomalie strutturali. Salute e lo sviluppo del cervello dipendono fortemente efficiente circolazione del liquor nei ventricoli cerebrali. Ad esempio, il normale flusso di CSF e l'equilibrio dei fluidi richiedono battito normale e funzionale delle ciglia ependimali ^5,6, che a sua volta gioca un ruolo critico nella regolazione del movimento direzionale delle cellule neuronali e la migrazione delle cellule staminali ^7. Come tale, anormale funzione cilia ependimali o la struttura può portare a flusso CSF ​​anormali, che è associato con idrocefalo, una condizione medica in cui vi è un accumulo anomalo di CSF nei ventricoli del bpioggia. Ciò può di conseguenza causare un aumento della pressione intracranica e progressivo ampliamento della testa, convulsioni, visione a tunnel, e disabilità mentale ^8.

I vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che ha permesso per la prima volta a segnalare tre distinti tipi di cellule ependimali: I, II, e III, sulla base della loro frequenza battito ciliare unica e l'angolo battendo. Queste cellule ependimali sono localizzati in alcune regioni nei ventricoli cerebrali. Inoltre, gli effetti dell'età e agenti farmacologici come alcol e cilostazolo sulla modifica i tipi di cellule ependimali o loro localizzazioni possono essere dimostrati, che non era possibile prima questa classificazione delle cellule ependimali. Cilostazolo è un inibitore della fosfodiesterasi-3, un enzima che metabolizza cAMP di AMP e regola anche il calcio intracellulare ^9. Usando l'analisi di imaging di fluorescenza ad alta velocità permette l'imaging e la quantificazione del intracellulare unicoproprietà di oscillazione di calcio delle cellule ependimali. Ad esempio, alcol e cilostazol alterato significativamente la frequenza ciliare pestaggio ependimale nonché le oscillazioni intracellulari di calcio proprietà, che a sua volta, potrebbe portare a un cambiamento del volume del liquido cerebrospinale di sostituzione da ciglia ependimali ^10. In sintesi, questa tecnica è stato fondamentale per fornire la prima prova di tre diversi tipi di cellule ependimali con diverse proprietà di oscillazione calcio.

Nella sezione seguente, una panoramica dettagliata passo-passo della procedura è prevista, prestando molta attenzione alla preparazione e la manipolazione dei tessuti.

Protocollo

Le procedure per l'uso degli animali sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) della University of Toledo in conformità con le linee guida della cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso il National Institutes of Health e della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Estrazione del cervello, Sezioni e Preparazione del tessuto

1. Sacrifica ceppo selvatico topo C57BL / 6 da profondamente eutanasia con CO ₂ asfissia per 5 min. Assicurare la morte per dislocazione cervicale.
2. Pulire la testina del mouse con il 70% di etanolo.
3. Eseguire craniectomy con le forbici sterili e pinze tirando prima la pelle di dosso, a partire dalla parte superiore della testa per esporre il cranio.
4. Poi, quando il cranio è esposto, rimuovere il cranio mediante pelatura pezzo per pezzo di osso, partendo dal lato posteriore e lo spostamento verso il lato anteriore. Fare attenzione a non distruggere i ventricoli del cervello.
5. Raccogliere tutto il cervello.
6. Mettere il cervello in un piatto da 100 millimetri di Petri contenente DMEM / High-glucosio addizionato con siero fetale bovino 10% (FBS) e 1% di soluzione di penicillina / streptomicina contenente 10.000 unità / ml di penicillina e 10.000 ug / ml di streptomicina e pre-riscaldato a 37 ° C.
7. Tagliare il cervello sul piano sagittale mediana a mano con una lama affilata, e di ottenere la prima sezione 100-200 mm da ciascuna metà con un vibratome.
8. Sciacquare il tessuto cerebrale con una soluzione pre-riscaldato a 37 ° C tampone fosfato (PBS 1x).
9. Porre immediatamente la sezione cervello in DMEM / media-alta glucosio pre-riscaldato a 37 ° C.

2. Immagini dal vivo Configurazione e impostazione

1. Posizionare le sezioni di tessuto cerebrale in 30 millimetri con fondo di vetro piatti della cultura contenenti 1 ml di DMEM / supporti ad alta glucosio. Regolare ambiente camera chiusa del microscopio a 37 ° C, 95% / 5% O ₂ / CO ₂ contenuto (Figura 1 ).
2. Utilizzando un obiettivo 60X immersione in olio obiettivo, raccogliere le cellule ependimali / immagini ciglia dapprima mettendo un goccia di olio sulla lente dell'obiettivo 60X e concentrandosi sulle cellule con regolare DIC trasmessa luce.
3. Quindi, seguire la direzione del movimento bolla DMEM come guida per la posizione delle ciglia ependimali motilità come percosse ciliari creano una sorta di movimento bolla nella zona. Scegli una zona che contiene le cellule sane con cilia motile nel ventricolo laterale del cervello utilizzando il filtro DIC. Una volta che le ciglia ependimali si trovano, regolare la luce e messa a fuoco per ottenere un'immagine soddisfacente.
4. Impostare i parametri di imaging dal vivo secondo uno scopo specifico utilizzando software di imaging Metamorph. Nel presente manifestazione, acquisire venti immagini a quattro bit con il set di binning fotocamera a 1 x 1 combinato con 60X obiettivo e 5-10 il tempo di esposizione msec.
5. Raccogliere le immagini DIC aprendo il diaframma microscopio ad un livello ottimale per avere un exp minimatempo osure. Osservare le immagini in diretta streaming per la fotocamera per fornire l'acquisizione delle immagini veloce e immediato senza indugio. Calcolare la velocità delle ciglia battere sulla base dei requisiti dei tempi di esposizione minima per ottenere il contrasto dell'immagine sufficiente.

3. Visualizzazione e analisi dei dati

1. Calcolare il numero di percosse ciglia contando il numero di pestaggi in 1 min. A tale scopo, diminuendo la velocità del video e contando il numero di battute utilizzando un contatore di cellule o un attrezzo simile.
2. Per calcolare la frequenza di percosse, moltiplicare il tempo di esposizione in cui il video viene registrato dal numero di fotogrammi o time-lapse immagini acquisite per ottenere il numero di sec. (Esempio: tempo di esposizione 5 msec 200 fotogrammi = 1.000 msec o 1 sec).
3. Calcolare il numero di percosse in un secondo per ottenere la frequenza che viene espresso come numero di battere per un secondo. A tale scopo, dividendo il numero di pestaggi ciglia sopra una sola seconda volta traval (Esempio: cilia batte 50 volte in un video 200 fotogrammi registrati al tempo di esposizione di 5 msec cioè 5 msec x 200 frames = 1 sec; ora dividere 50 battiti da 1 sec = 50 Hz).
4. Calcolare l'angolo ciliare pestaggio valutando il percorso intrapreso dalle ciglia ependimale durante entrambe le corse di potenza e di recupero. Eseguire questa secondo un metodo precedentemente descritto, con lievi modifiche ^11. Il movimento preciso delle ciglia individuale si osserva durante il ciclo di battito completo.
5. Su un foglio di acetato posto sopra il monitor, disegnare una linea orizzontale lungo il bordo ependimali e una linea verticale attraverso la posizione mediana delle ciglia all'inizio della corsa di lavoro.
6. Tracciare la posizione precisa del telaio cilium per fotogramma mentre si muove in avanti durante la corsa di alimentazione. In modo simile, tracciare il movimento delle ciglia durante la corsa di recupero.
7. Calcolare l'angolo ciliare pestaggio dalla deviazione massima del cilium dalla linea mediana durante tegli corsa di potenza nonché la corsa di recupero.

4. Calcio di registrazione del segnale

1. Dopo il taglio del cervello, sciacquare brevemente la fetta cervello con 1x PBS o Dulbecco PBS (pH 7,0). Preparare fresco Fluo-2 per evitare estinzione della fluorescenza e avere buon rapporto segnale-rumore.
2. Preparare 1 soluzione madre mM di Fluo-2 soluzione in dimetilsolfossido (DMSO), mescolare e agitare la soluzione per almeno 5 minuti per garantire che Fluo-2 è omogeneamente disciolto in DMSO.
3. Diluire la soluzione Fluo-2 stock in 500 ml di DMEM / High-glucosio addizionato con 2% B27 preriscaldata a 37 ° C ad una concentrazione finale di 20 mg / ml.
   NOTA: B-27 è un integratore senza siero ottimizzato contenenti vitamina A, cocktail antiossidante e insulina utilizzato per sostenere la redditività a breve oa lungo termine di ippocampo e altri neuroni del sistema nervoso centrale.
4. Incubare Immediatamente la fetta cervello con 20 mg / ml Fluo-2 per 30 minuti a 37 ° C in una piastra di fondo di vetro.
5. Per determinare la concentrazione di carico ottimale di calcio fluoroforo Fluo-2 e per evitare la tossicità delle cellule tintura di calcio, le cellule sfida con l'ATP, e verificare la vitalità cellulare determinando il decorso e punta grandezza dei segnali di calcio in risposta a ATP.
6. Registra il video per l'oscillazione di calcio a una velocità di acquisizione di 5 msec per un minimo di 1 secondo (200 fotogrammi al secondo), con eccitazione e di emissione lunghezze d'onda di 488 nm e 515 nm, rispettivamente (Movie 2).
7. Per distinguere il segnale Fluo-2 di calcio da autofluorescenza o movimenti artefatti, accertarsi che le intensità emessi a 515 nm è monitorata separatamente.
   NOTA: Fluo-2 non è il fluoremetric calcio adatto per quantificare calcio intracellulare. Tuttavia, è un ottimo colorante calcio dinamica per rilevare i cambiamenti rapidi di calcio, come oscillazioni calcio. Per la quantificazione di calcio più accurata, è consigliabile Fura-2. Tuttavia, le variazioni dinamiche di Fura-2 sono limitati dal suo raziometricola natura del colorante.
8. Seguire le formule fornite dal produttore per calcolare l'esatto valore di calcio intracellulare libero. Esempio [Ca ^2+] = K _d × (R - R _min) / (R _max - R). Dove K _d è la costante di dissociazione del colorante dal calcio rilasciato, R è la fluorescenza misurata a 488, e R e R _{min max} sono i rapporti di fluorescenza alla minima e massima concentrazione di ioni ^12.

5. immunofluorescenza Microscopia

1. Fissare le sezioni di cervello con fosfato soluzione salina tamponata contenente 4% paraformaldeide (PFA) e 2% di saccarosio per 10 min. In alternativa, fissare tutto il cervello con il 4% PFA e poi la sezione in 50 sezioni mm utilizzando un criostato.
2. Lavare il tessuto tre volte con PBS 1x per 5 minuti ogni volta.
3. Incubare la fetta cervello con un solutisu 0,1% Triton-X in 1x PBS per 5 minuti, quindi risciacquare tre volte con PBS 1x per 5 minuti ogni volta.
4. Incubare la fetta cervello con anticorpo di topo primaria, antiacetylated a-tubulina, utilizzato ad una diluizione di 1: 5000 in 10% FBS in 1x PBS per un'ora a temperatura ambiente (RT) o per una notte a 4 ° C.
5. Lavare il tessuto tre volte con PBS 1x per 5 minuti ogni volta.
6. Incubare la fetta cervello anticorpo secondario, fluoresceina anti-topo IgG ad una diluizione di 1: 500 in 10% FBS in soluzione PBS 1x per 1 ora a RT.
7. Prima osservazione al microscopio a fluorescenza, controcolorazione la sezione con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 5 minuti per macchiare il nucleo (o DNA) ^13. Per ridurre al minimo photobleaching, immagine delle sezioni subito con il tempo di esposizione minima possibile.

Risultati

Misurare funzione cilia ependimale nel cervello di topo vivo

Il metodo descritto in questo protocollo viene utilizzato per monitorare la funzione cilia ependimali e struttura nel tessuto fresco sezionato dal cervello di topo e di monitorare e studiare cilia frequenza battito. La procedura seguita per realizzare un esperimento completo vengono rappresentati in un diagramma di flusso schematico (figura 1). Si consiglia vivamente che l'esperimento è condotto entro un breve...

Discussione

Qui descritto è un protocollo per la preparazione di tessuto cerebrale topo sia per live-imaging e microscopia a fluorescenza che fornisce un rapido e sensibile osservazione delle ciglia ependimali nei ventricoli cerebrali. Questa tecnica non è limitato solo al ventricolo laterale; potrebbe essere utilizzata per osservare le ciglia in altre ventricoli cerebrali. Questa tecnica di imaging fornisce un flusso dal vivo che assomiglia al movimento del CSF battito ciliare in un ambiente ex vivo. Inoltre, essa conse...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/HIGH GLUCOSE	Cellgro Mediatech Inc.	10-013-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30088-03
Penicillin/Streptomycin	Thermo Scientific	SV30010
Phosphate buffered saline	Thermo Scientific	SH30256-01
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-SP
Sucrose	Sigma-Aldrich	S-2395
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284
Fluo-2	TEF Labs	#0200
DMSO
B27	Gibco	17504044
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI	Vector Labs	H-1500
Anti-acetylated a-tubulin antibody	Sigma-Aldrich	T7451	clone 6-11B1
FITC Anti-mouse antibody	Vector Labs	FI-2000
Cell Culture plate	VWR Vista Vision	30-2041
Cover Slip (18 x 18)	VWR Vista Vision	16004.326
Vibratome	Leica Biosystems	Leica VT1200S
Cryostat	Leica Biosystems	Leica CM1860
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon	Nikon TE2000	60X oil
Microscope cover glass 24 x 60 mm2	VWR Vista Vision	16004-312
Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
DAPI filter cube	Chroma Technology