Живая съемка в эпендимных ресничек боковых желудочков головного мозга мыши

Резюме

Использование высокого разрешения дифференциальный интерференционный контраст (DIC) микроскопии, экс естественных условиях наблюдение избиения подвижных ресничек эпендимных расположенном в желудочки головного мозга мыши демонстрируют живого изображения. Методика позволяет запись уникальной частотой цилиарного размола и угол бил, а также их внутриклеточный кальций свойства колебаний стимуляции.

Аннотация

Multiciliated эпендимные клетки выстилают желудочки во взрослом мозге. Нарушение функции или структуры эпендимных ресничек связана с различными неврологическими дефицита. Тока экс естественных условиях живут изображений подвижных ресничек эпендимных техники позволяет для детального изучения динамики цилиарных после нескольких шагов. Эти шаги включают в себя: мыши эвтаназии диоксидом углерода в соответствии с протоколами университета Уходу за животными Толедо и использование комитета (IACUC); удаление фрагментов костей черепа с последующим удалением головного мозга и сагиттальном вскрытия головного мозга с vibratome или острым лезвием, чтобы получить очень тонкие срезы через боковые желудочки головного мозга, где эпендимных реснички могут быть визуализированы. Инкубация ломтиками мозга в индивидуальных стеклянным дном пластины, содержащие модифицированные Игла среды (DMEM) / High-глюкоза Дульбекко при 37 ° С в присутствии 95% / 5% O ₂ / CO ₂ смеси важно, чтобы ткань живых в течениеэксперимент. Видео ресничек избиения затем записываются с использованием высокого разрешения дифференциального интерференционного контрастного микроскопа. Видео затем анализируют кадр за кадром, чтобы вычислить частоту цилиарного биение. Это позволяет отличный классификацию эпендимных клеток в трех видов или категорий в зависимости от их частоты мерцательная избиения и угла. Кроме того, этот метод позволяет использовать высокоскоростной анализа флуоресцентной томографии для характеристики уникальные внутриклеточные колебаний кальция свойства эпендимных клеток, а также влияния фармакологических агентов на колебания кальция и частоту цилиарного избиение. Кроме того, этот метод подходит для иммунофлуоресценции изображений для структуры цилиарного и локализации белка мерцательная исследований. Это особенно важно в диагностике болезни и фенотипа исследований. Основным ограничением методики связано с уменьшением в живом подвижных ресничек, как движения ткани мозга начинает умирать.

Введение

Реснички сенсорные микротрубочек на основе органеллы, которые простираются от поверхности клетки во внеклеточную среду. В зависимости от их микротрубочек организации, реснички могут быть классифицированы на два типа - "9 + 0" или "9 + 2". Функционально, в зависимости от их подвижности, они могут быть классифицированы как подвижных или неподвижных ресничек ^1. Первичная ресничек термин обычно используется для обозначения "9 + 0" неподвижные реснички. Они имеют девять параллельных микротрубочек дублетные (обозначается '9') и центральная пара микротрубочек отсутствует в центральной оболочкой (обозначение «0»). Тем не менее, некоторые "9 + 0" реснички, такие как узловой ресничек, которые регулируют эмбриона латерализацию подвижны ^2. С другой стороны, подвижные реснички характеризуется, в дополнение к девяти параллельных дублетов микротрубочек, дополнительным центральной пары микротрубочек дублетов и связанные с динеин моторных белков, чтобы облегчить подвижность. Кроме того, некоторые "9+2 »Реснички, такие как обонятельные реснички неподвижны ^3. Эпендимных клетки, выстилающие желудочки мозга и центральный канал спинного мозга характеризуются подвижных ресничек, которые продвигают спинномозговой жидкости (ликвора) вдоль желудочков головного мозга ^4.

Общая цель этого метода заключается в содействии изучению подвижных динамика реснички и структурные аномалии. Здоровье и развитие мозга в значительной степени зависят от эффективной циркуляции ликвора в желудочках головного мозга. Например, нормальный поток CSF и баланс жидкости требует нормальной избиения и функциональный эпендимных реснички ^5,6, который, в свою очередь сыграть решающую роль в регулировании направленное движение нервных клеток и клеточной миграции ^{7 Шток.} В качестве такого, ненормального эпендимных функции ресничек или структуры может привести к ненормальной потока CSF, который связан с гидроцефалией, медицинское состояние, в котором есть ненормальное накопление спинномозговой жидкости в желудочках бдождь. Это может привести к увеличению, следовательно, внутричерепное давление и прогрессивное увеличение головы, судороги, туннельное зрение, и психической инвалидности ^8.

Преимущества этого метода по сравнению с существующими методами, что она позволила впервые через три различных видов клеток: эпендимных I, II, III и, в зависимости от их уникальной частоте мерцательная избиения и угол бить. Эти клетки эпендимные локализованы в отдельных регионах в желудочки головного мозга. Кроме того, эффекты возраста и фармакологических агентов, таких как алкоголь и цилостазола на изменении эпендимных типов клеток или их локализации может быть продемонстрировано, что было невозможно ранее этой классификации эпендимных клеток. Cilostazol является ингибитором фосфодиэстеразы-3, фермент, который усваивает цАМФ в АМФ, и это также регулирует внутриклеточный кальций ^9. Использование высокоскоростной анализ флуоресценции позволяет визуализации и количественной оценки уникального внутриклеточногоколебаний кальция свойства эпендимных клеток. Например, как алкоголь и цилостазол значительно изменили эпендимных частоту цилиарного биение, а также внутриклеточные свойства колебаний кальция, который, в свою очередь, может привести к изменению в цереброспинальной жидкости замещения объема по эпендимных ресничек ^10. В целом, этот метод является ключевым, чтобы обеспечить первое доказательство трех различных типов клеток эпендимных с различными свойствами колебаний кальция.

В следующем разделе, детальное шаг за шагом обзор процедуры обеспечивается, обращая особое внимание на подготовку ткани и обработки.

протокол

Процедуры для использования животных были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) из Университета Толедо в в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу и использованию животных Институциональная в Национальных институтах здравоохранения и Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Мозг Добыча, Секционирование и тканей Подготовка

1. Жертвоприношение штамма дикого типа мыши C57BL / 6 с глубоко эвтаназии с СО ₂ удушья в течение 5 мин. Убедитесь, смерть путем смещения шейных позвонков.
2. Почистите головку мыши с 70% этанола.
3. Выполните удаление фрагментов костей черепа, используя стерильные ножницы и пинцет, сначала потянув шкуру, начиная с верхней части головы, чтобы выставить череп.
4. Затем, когда череп подвергается, удалить череп пилинг костный фрагмент-на-кусок, начиная с задней стороны и движется в сторону передней стороны. Будьте осторожны, чтобы не разрушить желудочки мозга.
5. Соберите весь мозг.
6. Поместите мозг в 100 мм чашки Петри, содержащей DMEM / High-глюкоза с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% раствор пенициллина / стрептомицина, содержащий 10000 ед / мл пенициллина и 10000 мкг / мл стрептомицина и подогретого до 37 ° С.
7. Нарежьте мозг на средней сагиттальной плоскости вручную с острым лезвием, и получить первый 100-200 мм раздел из каждой половины, используя vibratome.
8. Промойте ткань мозга с подогретого С фосфатным буферным раствором (PBS) 1x решения 37 °.
9. Сразу же место в разделе мозга в DMEM / высокого Глюкоза СМИ предварительно нагревают до 37 ° С.

2. Живая съемка Конфигурация и настройка

1. Поместите срезы ткани головного мозга в 30 мм с прозрачным дном культуры блюд, содержащих 1 мл DMEM / высоких-Глюкоза СМИ. Регулировка закрытой камере среду микроскопа до 37 ° С, 95% / 5% _О2 / _СО2 контента (фиг.1 ).
2. Использование 60X объективное масло погружения линзы, собирать эпендимные клеток / реснички изображения, поместив сначала капли масла на 60X объектива и фокусировка на клетках с регулярной ДВС передается свет.
3. Затем выполните направление движения DMEM пузыря в качестве ориентира для расположения подвижных ресничек, как эпендимных цилиарные избиения создать своего рода движения пузырьков в области. Выберите область, содержащую здоровые клетки с подвижных ресничек в боковой желудочек мозга с помощью фильтра ДВС. После эпендимных реснички найдено, отрегулировать свет и фокус, чтобы получить удовлетворительное изображение.
4. Установите живые параметры изображения в соответствии с конкретной целью, используя программное обеспечение обработки изображений Metamorph. В настоящее демонстрации, приобрести двадцать четыре-битных изображений с камеры биннинга набора 1 х 1 в сочетании с объективным и 60X 5-10 мс время экспозиции.
5. Сбор изображений ДИК, открыв отверстие микроскопа до оптимального уровня, чтобы иметь минимальную ехрosure время. Соблюдайте живые изображения потока в камере, чтобы обеспечить быстрый и непосредственный получения изображения без задержки. Рассчитать скорость ресничек избиения на основе требований минимальных времени экспозиции, чтобы получить достаточную контрастность изображения.

3. Визуализация и анализ данных

1. Рассчитать количество ресничек побоев путем подсчета количества побоев в 1 мин. Сделайте это путем уменьшения скорости видео и подсчета количества ударов, используя счетчик клеток или подобный инструмент.
2. Для расчета частоты избиения, умножьте время экспозиции, при котором видео, записанного числа кадров или покадровой изображений, полученных, чтобы получить количество секунд. (Пример: время экспозиции 5 мс 200 кадров = 1000 мс или 1 сек).
3. Рассчитать количество избиений в одну секунду, чтобы получить частоту, которая выражается как число биений на одну секунду. Сделайте это путем деления числа ресничек избиения в течение одного-второго времени междуВал (Пример: реснички бьет 50 раз в 200 кадров при записи видео во время экспозиции 5 мс т.е. 5 мс х 200 кадров = 1 сек, а теперь делят 50 ударов на 1 сек = 50 Гц).
4. Рассчитать угол мерцательная избиение вычисления пути, принятое эпендимных ресничек во время обоих силовых и восстановительных ударов. Выполнение этого в соответствии с описанным ранее способом, с незначительными изменениями ^11. Точное движение индивидуального ресничек наблюдается в течение всего цикла биений.
5. На ацетата листом, помещенным на мониторе, провести горизонтальную линию вдоль края эпендимных и вертикальной линии, проходящей через срединном положении ресничек в начале рабочего хода.
6. Участок точное положение реснички кадр за кадром, как она движется вперед во время рабочего хода. Аналогичным образом, участок движения ресничек в течение обратного хода.
7. Рассчитать угол мерцательная избиение от максимального отклонения реснички от средней линии во время тон рабочий ход, а также ход восстановления.

4. Кальций сигнал Запись

1. После нарезки мозг, кратко промыть срез мозга с 1x PBS или PBS Дульбекко (рН 7,0). Подготовьте свежий Fluo-2, чтобы избежать тушение флуоресценции и получить хорошее соотношение сигнал-шум.
2. Готовят 1 мМ исходный раствор Fluo-2 раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО), перемешивают и вихрь решение, по крайней мере, 5 мин, чтобы обеспечить Fluo-2 однородно растворяли в ДМСО.
3. Развести Fluo-2 маточного раствора в 500 мл DMEM / High-глюкозы, дополненной 2% B27 подогретого до 37 ° С до конечной концентрации 20 мг / мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В-27 оптимизирован бессывороточная добавка, содержащая витамин А, антиоксидантным коктейлем и инсулина, используемого для поддержки кратко- или долгосрочной жизнеспособности гиппокампа и других нейронов ЦНС.
4. Сразу инкубировать срез мозга с 20 мг / мл Fluo-2 в течение 30 мин при 37 ° С в стеклянным дном пластины.
5. Для определения оптимальной концентрации нагрузки флуорофорных кальция Fluo-2 и чтобы избежать токсичности клеток красителя кальция, вызов клетки с АТФ и проверить жизнеспособность клеток путем определения времени курс и пик величины сигналов кальция в ответ на АТФ.
6. Запись видео для колебаний кальция со скоростью захвата 5 мс в течение минимум 1 сек (200 кадров в секунду), с возбуждения и излучения длиной волны 488 нм и 515 нм, соответственно (Movie 2).
7. Чтобы отличить Fluo-2 сигнал кальция автофлюоресценции или движения артефактов, убедитесь, что интенсивности, испускаемые при 515 нм контролируется отдельно.
   Примечание: Fluo-2 не fluoremetric кальция пригодны для количественного внутриклеточный кальций. Тем не менее, это отличный краситель динамического кальция для обнаружения быстрой смены кальция, такие как кальций колебаний. Для более точного количественного кальция, Фура-2 рекомендуется. Тем не менее, динамические изменения Фура-2 ограничены его ЛогометрическийХарактер красителя.
8. Следуйте формулы, предусмотренные заводом-изготовителем для расчета точных бесплатно внутриклеточные значения кальция. Пример [Са ^2+] = К _д × (R - R _мин) / (R _макс - R). Где К _д является константа диссоциации красителя от выпущенного кальция, R является измеренное флуоресценции при 488 и R _мин и _макс R являются отношения флуоресценции при минимальной и максимальной концентрации ионов ^12.

5. Иммунофлуоресценции микроскопия

1. Исправление срезах головного мозга с фосфатным буферным солевым раствором, содержащим 4% параформальдегида (PFA) и 2% сахарозы в течение 10 мин. Кроме того, исправить весь мозг с 4% PFA, а затем раздел в 50 мм секции, используя криостат.
2. Промыть ткань три раза 1x PBS в течение 5 мин каждый раз.
3. Выдержите кусочек мозга с Solutiна 0,1% Triton-X в 1x PBS в течение 5 мин, затем промыть три раза 1x PBS в течение 5 мин каждый раз.
4. Инкубируйте срез мозга мыши с первичным антителом, antiacetylated в-тубулина, используемый в разведении 1: 5000 в 10% FBS в 1x PBS в течение одного часа при комнатной температуре (RT) или в течение ночи при 4 ° С.
5. Промыть ткань три раза 1x PBS в течение 5 мин каждый раз.
6. Инкубируйте срез мозга в вторичными антителами, анти-флуоресцеин мыши IgG в разведении 1: 500 в 10% FBS в 1X PBS растворе в течение 1 ч при комнатной температуре.
7. Перед наблюдения под флуоресцентным микроскопом, контрастное секции с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 5 мин, чтобы окрасить ядро (или ДНК) ^13. Чтобы свести к минимуму фотообесцвечивания, изображение разделы сразу с минимальным временем возможного воздействия.

Результаты

Измерение эпендимных функцию ресничек в живом мозге мыши

Метод, описанный в этом протоколе используется для мониторинга эпендимных функцию ресничек и структуру в свежей ткани расчлененный от мозга мыши, а также для мониторинга и изучения реснички частоту биений. Выпол...

Обсуждение

Описанный здесь протокол для подготовки ткани мозга мыши, как для живого изображения и флуоресцентной микроскопии, который обеспечивает быстрый и чувствительный тщательное наблюдение за эпендимных ресничек в желудочки головного мозга. Этот метод не ограничивается только бокового ж?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/HIGH GLUCOSE	Cellgro Mediatech Inc.	10-013-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30088-03
Penicillin/Streptomycin	Thermo Scientific	SV30010
Phosphate buffered saline	Thermo Scientific	SH30256-01
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-SP
Sucrose	Sigma-Aldrich	S-2395
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284
Fluo-2	TEF Labs	#0200
DMSO
B27	Gibco	17504044
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI	Vector Labs	H-1500
Anti-acetylated a-tubulin antibody	Sigma-Aldrich	T7451	clone 6-11B1
FITC Anti-mouse antibody	Vector Labs	FI-2000
Cell Culture plate	VWR Vista Vision	30-2041
Cover Slip (18 x 18)	VWR Vista Vision	16004.326
Vibratome	Leica Biosystems	Leica VT1200S
Cryostat	Leica Biosystems	Leica CM1860
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon	Nikon TE2000	60X oil
Microscope cover glass 24 x 60 mm2	VWR Vista Vision	16004-312
Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1500
DAPI filter cube	Chroma Technology