Photoactivated التعريب المجهري مع ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC-PALM)

Summary

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Abstract

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Introduction

تفاعلات البروتين البروتين (مثبطات مضخة البروتون) هي الأساسية لعلم الأحياء ¹ وينظم بإحكام عبر آليات الزمانية المكانية عبر العديد من جداول زمنية والطول. دراسات على الخلايا مما يدل على غشاء الخلية، على سبيل المثال، قد كشف، مقصورات المكانية النانو الحيوية التي تسهل مثبطات مضخة البروتون محددة والعمليات الخلوية ^2. وبالتالي، فإن القدرة على تحقيق مثبطات مضخة البروتون في النظم البيولوجية لقرارات كافية المكانية والزمانية، خصوصية عالية، وحساسية عالية هو المفتاح لتحقيق فهم الآلية البيولوجيا.

ثنائي الجزيء مضان تكامل (BiFC) هي واحدة من عدد قليل من الأدوات الموجودة لتصور مثبطات مضخة البروتون في زنزانة مع قرار التحت خلوية والتوافق تعيش خلايا ^3-5. هذه التقنية بسيطة نسبيا وتتضمن تقسيم البروتين مضان إلى قسمين شظايا غير الفلورسنت. عندما الموسومة راثيا لاثنين من البروتينات التفاعل وجلبت الى القرب، ويمكن أن شظايا بإعادة تشكيل لتشكيل بروتين فلوري كامل، مما أسفر عن إشارة الفلورسنت. عندما تكون مصممة بشكل صحيح، يجب تحقيقات BiFC لا إعادة تكوين تلقائيا في حالة عدم وجود مثبطات مضخة البروتون. على هذا النحو، فإن إشارة مضان في مقايسة BiFC تنشأ إلا في وجود مثبطات مضخة البروتون، والتي تمكن رؤية مباشرة من مثبطات مضخة البروتون مع خصوصية عالية. فوائد إضافية لاستخدام مضان كما قراءات هي حساسية عالية، وقرار التحت خلوية، والتوافق مع سرعة عالية وعالية المقايسات فحص المحتوى وغيرها. لهذه الفوائد، وقد وضعت عددا من تحقيقات BiFC على أساس مختلف البروتينات الفلورية الأم. كما هو الحال في جميع التقنيات الكشف الأخرى على أساس المجهر الضوئي التقليدية، ومع ذلك، فإن القرار المكانية من BiFC يقتصر على ~ 250 نانومتر من حيود الضوء. وهذا يجعل من التحدي لدراسة تنظيم مثبطات مضخة البروتون على مقياس النانو، والتي، كما ألمح في وقت سابق والتي تجسدت الطوافات الدهنية ⁶ لالثاني nanoclusters رأس ^7، هو مقياس طول بالغ الأهمية لفهم العديد من العمليات الخلوية مثل الإشارات.

وقد تم الجمع بين BiFC مع photoactivated المجهر توطين (PALM) ^8،9 للتغلب على هذا الحد في التحليل المكاني لتصوير مثبطات مضخة البروتون ^10. PALM هو أسلوب superresolution المجهر الأخيرة التي تلتف حول الحد حيود في مجال التصوير مضان من خلال تفعيل العشوائية وتوطين subdiffractive من جزيئات الفلورسنت واحدة. في كل دورة التنشيط، جزيء فلوري تنبعث بضع مئات إلى بضعة آلاف من الفوتونات ويثير صورة جزيء واحد على كاشف. عندما تكون الصورة محدودة حيود (~ 250 نانومتر في العرض)، ويمكن تحديد النقطه الوسطى مع أعلى بكثير من الدقة، عادة في حدود 10-50 نانومتر اعتمادا على عدد من الفوتونات الكشف عنها. من خلال تفعيل وتوطين كل جزيء فلوري في العينة، يمكن إعادة بنائها على صورة عالية الدقة. Performeد على الخلايا الحية، جزيء واحد تتبع (smt-) PALM مزيد من تصاريح اقتناء الآلاف من مسارات البروتين نشرها من خلية واحدة ^(11). الأهم من ذلك، يستخدم PALM تحقيقات الفلورسنت المتخصصة مثل البروتينات الفلورية photoactivatable (PA-FPS) لتحقيق تفعيل مؤشر ستوكاستيك. لأن كلا BiFC وPALM البروتينات استخدام الفلورسنت، وكانوا جنبا إلى جنب عن طريق تقسيم PAmCherry1، وهي تستخدم عادة PA-FP لPALM، إلى قسمين شظايا بين الأحماض الأمينية 159 و 160.

نظام BiFC على أساس PAmCherry1 الانقسام يظهر إشارة خلفية منخفضة من إعادة عفوية من شظايا اثنين. عندما الموسومة راثيا لزوج من البروتينات التفاعل، شظايا اثنين (RN = بقايا 1-159؛ RC = الأرصاد + بقايا 160-236) أعيد بكفاءة لتشكيل البروتينات PAmCherry1 كاملة حتى عند 37 درجة مئوية وبدون يحتضنها عند انخفاض درجات الحرارة، والتي ليس هذا هو الحال للأزواج BiFC أخرى ¹² مثل الوالد mCherry ^13. Furthermoإعادة، والبروتين PAmCherry1 أعيد الاحتفاظ خصائص بالفوتونات من PAmCherry1 الأم، مثل نسبة عالية النقيض من ذلك، العائد الفوتون المتوسط، وتنشيط ضوئي سريع، من بين أمور أخرى، التي هي حيوية لدقيقة توطين جزيء واحد وعالية الدقة التصوير PALM.

في هذا البروتوكول، واستخدام BiFC-PALM لتصوير التفاعلات رأس راف في خلايا U2OS باستخدام PAmCherry1 تقسيم (الشكل 1A) يوصف. الخطوة الأولى هي لتصميم بنيات للتعبير عن البروتينات الانصهار بين شظايا PAmCherry1 (أي RN وRC) والبروتينات المثيرة للاهتمام. من الناحية النظرية، لكل زوج من البروتينات مرشح (A و B)، هناك ثمانية أزواج من البروتينات الانصهار لفحصها: RN-A / RC-B. RN-A / B-RC. RC-A / RN-B. RC-A / B-RN. A-RN / RC-B. A-RN / B-RC. A-RC / RN-B. وA-RC / B-RN. كثيرا ما يمكن تبسيط هذه العملية من خلال الأخذ بعين الاعتبار الخصائص الهيكلية أو البيوكيميائية للبروتينات مرشح. في حالة رأس، والبروتينبعد translationally تعديل المربع CAAX-C محطة (C = السيستئين؛ A = الأليفاتية، X = أي)، وبعد ذلك يتم المشقوق عزر AAX خارج. وبالتالي، RN أو RC لا يمكن إلا أن تنصهر إلى N-محطة رأس. وهذا يقلل من عدد من أزواج البروتين الانصهار إلى أربعة (الشكل 1B). لسلاح الجو الملكي البريطاني، المجال رأس ملزم (RBD، بقايا 51-131) يستخدم ويمكن الموسومة على حد سواء. تم إنشاؤها هذه التكوينات الانصهار أربعة: RN-KRAS / RC-راف RBD. RN-KRAS / راف RBD-RC. RC-KRAS / RN-راف RBD. وRC-KRAS / راف RBD-RN.

بالإضافة إلى ذلك، سوف رابط بين الشظايا والبروتينات ذات الاهتمام تحتاج إلى النظر فيها. وغالبا ما يستخدم رابط مرونة من حوالي عشرة الأحماض الأمينية، حيث أنه يوفر الحرية الكافية للتكامل تحدث. واحدة من هذه رابط هو (GGGGS) X2، على الرغم من أن هناك العديد من الآخرين التي تم تطبيقها بنجاح، بما في ذلك تسلسل عشوائي ولدت من موقع استنساخ متعددة (MCS) ^14. قد تحتاج طول linkers أن يكون الأمثل dependinز على حجم البروتينات من الفائدة وتوجهاتها عند التعامل.

وترد شظايا PAmCherry1 في العمود الفقري استنساخ صغير مع المرافقة MCSS (انظر قائمة المواد). يمكن إدراج الجينات ذات الاهتمام عبر المواقع تقييد أو مع طريقة ربط مستقل. بعد استنساخ وتسلسل التحقق، يتم تحويل الكاسيت تعبر عن ناقلات التعبير باستخدام رد فعل recombinase، وهي عملية الاستنساخ مع الدقة العالية وكفاءة عالية.

بعد ذلك، و transfected بنيات التعبير مما أدى إلى خط الخلية المستهدفة، أو إذا كان المطلوب هو خط الخلية مستقرة، وتعبئتها في الفيروسة البطيئة لتصيب خط الخلية المستهدفة. ترنسفكأيشن عابر يسمح للمصادقة سريع للتكوينات BiFC، ولكن يجب أن يكون لاحظت المشاكل المحتملة. ترنسفكأيشن استخدام المواد الكيميائية غالبا ما يشدد الخلايا، مما أدى إلى تألق ذاتي عالية. في حين أن استخدام مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) microscoالحمر يمكن أن تخفف هذه إشارة الخلفية عن طريق الحد من حجم الإضاءة، TIRF مثالية عندما تأخذ مثبطات مضخة البروتون مكان على غشاء الخلية. بالإضافة إلى ذلك، transfections عابرة غالبا ما تؤدي إلى مستويات عالية من بروتين تعبير، تتجاوز بكثير تلك التي من البروتينات الذاتية، والتي قد تسبب القطع الأثرية في الكشف عن مثبطات مضخة البروتون. وبالتالي، فمن المستحسن أن يتم إنشاء خطوط الخلايا مستقرة بعد أن تم تحديد تكوين BiFC المناسب من خلال الاختبارات الأولية. لديها خطوط الخلايا مستقرة أيضا إمكانية للتعبير الانضباطي عبر الدوكسيسيكلين تحريض ^15.

بعد الإصابة، يتم تحديد الخلايا مع المضادات الحيوية، وعادة بوروميسين والنيوميسين، واحد لكل بناء. وسيتم وصف الخطوات اللاحقة لإعداد العينات، والحصول على الصور، وتحليل البيانات بالتفصيل في البروتوكولات.

مع هذا النهج، لوحظ تشكيل مجموعات النانو في الصور BiFC النخيل من رأس راف RBD بشكل روتيني (الشكل 2A </ قوي>). باستمرار، مسارات SMT-PALM من رأس راف RBD تظهر التوزيع غير المتجانس في دول الانتشار (الشكل 2B-D). هذه النتائج تشير إلى أن المجمعات رأس راف موجودة في دول متعددة على غشاء الخلية، ويفترض كما أحادية والتجمعات، مع الآثار البيولوجية المحتملة. يوضح هذا العمل قوة BiFC النخيل في التصوير الانتقائي لمثبطات مضخة البروتون في الخلايا مع نانومتر القرار المكانية وحساسية جزيء واحد، والتي سيكون من الصعب الحصول مع BiFC التقليدية، مضان شارك في التعريب، أو مضان بالرنين نقل الطاقة (الحنق).

عند تصميم التجارب BiFC وتفسير النتائج، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن عملية BiFC لا رجعة فيه في معظم الحالات، بما في ذلك PAmCherry1 الانقسام. مرة واحدة شظايا اثنين والجمع بين لتشكل البروتين PAmCherry1 الكامل، والربط بين أجزاء اثنين، وبالتالي PPI يصبح دائم. وهذا يحد من استخدام BiFC وBiFC-PALM لرصد ديناميات مثبطات مضخة البروتون (أي حركية ملزم وليس ديناميكية انتشار مجمع البروتين فور تشكيلها)، وأحيانا يمكن أن تؤدي حتى إلى mislocalization من المجمعات PPI.

عاملا إضافيا في الاعتبار عند تصميم التجارب BiFC-PALM هو التأخير في النضج حامل اللون المتأصل في البروتينات الفلورية. مرة واحدة اثنين من البروتينات تتفاعل وشظايا FP معا، فإنها refold عادة بناء على أمر من ثانية (نصف الوقت من 60 ثانية لEYFP ^3). ومع ذلك، لاحقا النضج حامل اللون وإشارة الفلورسنت تطوير بناء على أمر من دقيقة. في حين مضان قد يكون كشفها في غضون 10 دقيقة بعد إعادة تشكيل تقسيم الزهرة، وهي قابلة للطي بسرعة YFP البديل، والوقت غير الشقيق لنضج بشكل عام في كثير من الأحيان حوالي 60 دقيقة ^16. ولوحظ انقسام PAmCherry1 لدينا أسعار مماثلة. وبالتالي، BiFC BiFC والنخيل وسوء الاختيارات حاليا لرصد الوقت الحقيقي حركية PPI. لي الآخرينthods، مثل الحنق وdimerization وضعت مؤخرا الفلورسنت تعتمد البروتين ^17، قد تكون أكثر ملاءمة لهذا الغرض.

Protocol

1. الاستنساخ

1. تحديد تكوينات لاستنساخ واختيار رابط. البروتينات العلامة مع شظايا على N- أو C-المحطة كما هو موضح أدناه حتى لا يعطل التعريب على نحو سليم. استخدام رابط مرنة مثل (GGGGS) X2.
2. وراثيا علامة البروتينات التي تهم شظايا PAmCherry1. كما خيار واحد، استخدام البلازميدات استنساخ المدرجة في قائمة المواد التي تحتوي على شظايا RN (بقايا PAmCherry1 1-159) وRC (الأرصاد بالإضافة إلى بقايا PAmCherry1 160-236) مع المرافقة MCS متواليات.
   1. خطي البلازميدات تحتوي على شظايا RN وRC مع معكوس PCR (أو تقييد هضم) عند نقطة الإدراج. يتم سرد الاشعال للمعكوس PCR في الجدول 1. وفيما يلي مثال بروتوكول PCR المستخدمة في المختبر المؤلف (انظر قائمة المواد للمواد الدقيقة المستخدمة في هذا البروتوكول).
      1. خلط رد فعل PCR معا، ترعرعت على الحجم النهائي من 50 ميكرولتر مع الماء: إلى الجدار رقيقةأنبوب إد PCR، إضافة الماء، 25 ميكرولتر من 2X مزيج الرئيسي، 0.5 ميكرولتر كل من الاشعال إلى الأمام وعكس (20 ميكرومتر الأسهم المخفف و 0.2 ميكرومتر تركيز النهائي)، و 1 نانوغرام من القالب. استخدام الدراجات الظروف التالية: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 30 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 7 ثانية و 68 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، والتمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
   2. PCR الجينات التي تهم الإدراج إلى البلازميدات خطي تحتوي على RN وRC شظايا. أداء PCR كما في الخطوة 1.2.1 مع تمديد الوقت في 68 ° C. استخدام الاشعال مع يتدلى التي تحتوي على تسلسل رابط مرونة، مثل GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT ل(GGGGS) X2، و 15 قاعدة الزوج التماثل إلى أقاصي RN خطي والبلازميدات RC لإعادة التركيب.
      ملاحظة: يتم عرض يتدلى التمهيدي للبروتينات الفائدة في الجدول 2 إذا باستخدام بادئات في الجدول 1 إلى خطي العمود الفقري البلازميد.
   3. هضم PCRرد الفعل مع Dpn1 للقضاء على قالب PCR. إضافة 0.5 ميكرولتر من Dpn1 (20 U / ميكرولتر) مباشرة إلى 50 ميكرولتر من رد فعل PCR. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة والحرارة تعطيل في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. إذا استمر قالب الخلفية في خطوات لاحقة، وزيادة كمية الإنزيم أو إطالة وقت الهضم.
   4. تنقية المنتجات PCR عن طريق عمود الدوران كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
   5. إجراء تفاعل ربط مستقل للجمع بين البلازميد خطي يتضمن RN أو جزء RC مع الجينات في المصالح. قياس تركيز من المنتجات PCR المنقى: الجمع بين 50 نانوغرام من البلازميد خطي و 50 نانوغرام من الجينات في المصالح مع 1 ميكرولتر من انزيم بريمكس وجلب الحجم الإجمالي إلى 5 ميكرولتر مع الماء منزوع الأيونات. احتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ومكان على الجليد، وإضافة 20 ميكرولتر من TE العازلة.
   6. تحويل البلازميدات المؤتلف في البكتيريا المختصة ^18.
   7. حدد 4/2 + (حسب الرغبة) مستعمرات لO / N الثقافة. إضافة 5 ملمن LB مرق و 5 ميكرولتر من كانامايسين (50 ملغ / مل الأسهم) إلى 14 مل أنبوب البولي بروبلين جولة القاع، وإضافة البكتيريا مستعمرة المحدد مع حلقة بتلقيح تعقيمها. احتضان عند 37 درجة CO / N حين تهتز في 225 دورة في الدقيقة.
   8. تجميد 1 مل من O / N ثقافة الأسهم الجلسرين ^{19 و} miniprep الباقي كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
   9. أداء التسلسل لتحديد استنساخ جيدة. في حالة استخدام البلازميدات استنساخ في قائمة المواد واستخدام M13 إلى الأمام وعكس الاشعال (في تفاعلات منفصلة) عند الضرورة للحصول على التسلسل الكامل للانصهار بناء. مقارنة مع تسلسل المتوقع باستخدام أداة المحاذاة مثل انفجار من المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
   10. نقل بنيات-التحقق من التسلسل إلى التعبير البلازميد عن طريق تفاعل recombinase.
       1. إضافة 75 نانوغرام من البلازميد جهة & #8212؛ مثل pcDNA لtransfections عابرة أو pLenti لlentiviral التعبئة والتغليف ²⁰ - و 50 نانوغرام من استنساخ البلازميد المؤتلف إلى 1 ميكرولتر من انزيم بريمكس وإحضار الحجم الكلي إلى 5 ميكرولتر مع الماء منزوع الأيونات. احتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ثم إضافة 5 ميكرولتر من TE العازلة.
          ملاحظة: للحصول على التعبئة والتغليف lentiviral وتوليد خط الخلية مستقرة، استخدم البلازميد وجهة مختلفة لكل بناء، على سبيل المثال، واحد مع المقاومة بوروميسين والنيوميسين الآخرين. وهذا يسمح للاختيار مزدوجة من الخلايا transduced. ضع في اعتبارك أيضا المروج لكل منهما، مثل الفيروس المضخم للخلايا المكونة (CMV) مروج لمستويات عالية التعبير، أو CMV مع المشغل TETO لالانضباطي تعبير عن تنظيم الدوكسيسيكلين.
       2. تحويل 5 ميكرولتر إلى البكتيريا المختصة وminiprep البلازميدات كما في الخطوات 1.2.6 إلى 1.2.8، ولكن باستخدام المضادات الحيوية المناسبة (عادة الأمبيسلين).
3. تحديد الأمثلالتكوين BiFC.
   1. شارك في transfect البلازميدات التعبير في خلايا U2OS (أو خلية من خيار).
      1. إضافة 350 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية وخالية من المضادات الحيوية DMEM تستكمل مع 10٪ FBS في كل بئر من 8 جيد # 1.5 زجاج غرفة أسفل الشريحة. لوحة حوالي 7.5 × 10 ⁴ خلايا لكل بئر الخلايا بحيث حوالي 70٪ -90٪ متكدسة في اليوم التالي.
      2. بعد يوم من البلازميدات الطلاء، وشارك في transfect التعبير مع تكوينات مختلفة في كل بئر باستخدام كاشف المفضل وكما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
         1. لكل بئر، إضافة 125 نانوغرام لكل التعبير البلازميد في 50 ميكرولتر من المصل خالية تخفيض وسائل الاعلام في أنبوب 0.6 مل وماصة صعودا وهبوطا إلى المزيج. إضافة 1 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن أسفل وسط الأنبوب ومباشرة في وسائل الإعلام. تستنهض الهمم بلطف لمزج والسماح للرد فعل الجلوس لمدة 30 دقيقة.
         2. الحد من وسائل الإعلام في كل بئر من الشريحة غرفة بمقدار النصف تقريبا. إضافة قطرة قطرة الخليط ترنسفكأيشن إلى الآبار ويهز زمستديم لخلط. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 24-48 ساعة. تغيير وسائل الإعلام اليوم بعد ترنسفكأيشن.
   2. خلايا صورة على المجهر مضان كما هو الحال في بروتوكول 2 بدءا من الخطوة 2.1.4.
      ملاحظة: قد يمكن تصوير العينة على المجهر مضان القياسية إذا كانت مستويات التعبير مرتفعة وكاميرا حساسة بما فيه الكفاية لإخراج الفوتون منخفض نسبيا من PAmCherry1. يمكن تنشيط الجزيئات PAmCherry1 المعاد مع مجموعة فلتر الأشعة فوق البنفسجية (405 نانومتر) قبل التصوير مع الإثارة الخضراء (561 نانومتر) مجموعة التصفية.
4. عند الاقتضاء، إنشاء سيطرة سلبية من قبل، على سبيل المثال، وإدخال طفرة نقطة في واحد من البروتينات ذات الاهتمام الذي يعطل التفاعل. إجراء الطفرات موقع الموجه ²¹ على البلازميد استنساخ البروتين إلى أن تحور والتكوين الذي تم اختياره.
5. إنشاء خط الخلية مستقرة خلال تجميع يبني في الفيروسيةالجسيمات وتصيب الخلايا U2OS (أو خط خلية من خيار). النظر في محرض نظام (التتراسيكلين) التعبير ¹⁵ لذلك التعبير يمكن أن يتسبب قبل التصوير إذا الرجعة لفترات طويلة من BiFC هو المشكلة، أو إذا كان المطلوب هو التعبير الانضباطي.
   تنبيه: يصنف العمل مع الفيروسات كما السلامة الأحيائية المستوى 2. بينما الأجيال الأخيرة من أنظمة التعبئة والتغليف الفيروسية قد تقلص إلى حد كبير من احتمال إنتاج فيروسات النسخ المختصة، بعض المخاطر لا تزال موجودة. مراجع يمكن العثور عليها في http://www.cdc.gov/biosafety/publications/.
   1. كرر الخطوة 1.2.10 باستخدام lenti- أو فيروسات ناقلات جهة ^20. زيادة O / N الثقافة إلى 100 مل لmidiprep وزيادة نقاء البلازميدات.
   2. في يوم 1: لوحة حوالي 2 × 10 ⁶ 293T / 17 خلايا في طبق 10 سم لكل بناء ليتم تعبئتها.
   3. يوم 2: إعداد رد فعل ترنسفكأيشن باستخدام هيئة تنظيم الاتصالاتnsfection كاشف الاختيار وكما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
      1. إعداد الخلطة الجاهزة من التعبئة والتغليف البلازميدات مع تركيزات النهائي من 250 نانوغرام / ميكرولتر للتغليف البلازميدات 1 و 2، و 100 نانوغرام / ميكرولتر للتغليف البلازميد 3 في الماء المعقم. إضافة 10 ميكرولتر من بريمكس التعبئة البلازميد و 2.5 ميكروغرام من البلازميد الهدف إلى 1 مل من مصل خالية تخفيض وسائل الاعلام في 5 مل أنبوب البولي بروبلين جولة القاع وماصة صعودا وهبوطا إلى المزيج. إضافة 20 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن أسفل وسط الأنبوب ومباشرة في وسائل الإعلام.
         1. تستنهض الهمم بلطف لمزج واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة. إزالة ما يقرب من نصف وسائل الإعلام من الخلايا وإضافة الخليط ترنسفكأيشن بطريقة قطرة قطرة. يهز بلطف لمزج واحتضان عند 37 درجة مئوية و CO ₂ 5٪. احتضان 10 مل من وسائل الاعلام في لوحة في أنبوب مع غطاء خففت لدرجة الحرارة وCO ₂ موازنة.
      2. يوم 3: بلطف تغيير وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام قبل المحتضنة وreturن الخلايا إلى الحاضنة. احتضان أنبوب آخر من وسائل الإعلام مع غطاء خففت.
         ملاحظة: Syncytia، أو تكوين خلايا الأنوية المتعددة الكبيرة، ويمكن أن يكون علامة على أن التعبئة والتغليف يسير على ما يرام. ومع ذلك، والخلايا في حالة هشة ويمكن فصل بسهولة. عند تغيير وسائل الإعلام، إمالة pipettor بحيث يكون أفقي وإضافة قطرة قطرة وسائل الاعلام الى حافة واحدة من لوحة.
      3. يوم 4: حصاد الفيروس عن طريق إزالة وسائل الإعلام مع حقنة والتصفية من خلال حجم مرشح 0.45 ميكرون المسام نظيفة في أنبوب 50 مل. بلطف استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام قبل المحتضنة.
      4. في يوم 5: حصاد مرة أخرى كما فعلت سابقا في الخطوة 1.5.3.3 والجمع بين الترشيح المشترك في نفس أنبوب 50 مل. إضافة 6 مل من مركزات الفيروس إلى كل أنبوب والمزيج. تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة حتى رواسب الفيروس.
         ملاحظة: اعتمادا على صحة الخلايا، يمكن للفيروس أن تحصد للمرة الثالثة.
      5. تركيز الفيروس عن طريق الطرد المركزي في 1500 x جلمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. نضح طاف و resuspend بيليه في 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام. الفيروس يمكن استخدامها على الفور لعدوى أو تخزينها في 50 مكل في -80 درجة مئوية لمدة سنة واحدة.
      6. لوحة حوالي 3 × 10 ⁵ U2OS (أو الهدف) خلايا لكل بئر في لوحة 6 جيدا (2 مل من DMEM مع 10٪ FBS لكل بئر) للعدوى، والخلايا بحيث حوالي 50٪ متكدسة في وقت الإصابة.
      7. في اليوم التالي، وإزالة ما يقرب من نصف وسائل الإعلام حتى حوالي 1 مل بقايا. Coinfect مع 50 ميكرولتر من فيروس مركزة لكل بناء. إضافة 1 ميكرولتر من polybrene (8 ملغ / مل) إلى كل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية و CO ₂ 5٪. تغيير وسائل الإعلام في اليوم التالي واحتضان لاختيار المضادات الحيوية قبل يوم واحد أكثر من ذلك.
         ملاحظة: كمية الفيروس لإضافة يمكن أن تختلف تبعا لمعدل المطلوب من العدوى. الفيروسات يمكن معاير باستخدام QRT-PCR.
      8. إضافة المضادات الحيوية لتحديد الخلايا المصابة. آبار منفصلة مع الخلايا غير المصابة التي لم تشهد السادسمطلوبة روس كما الكناري لاختبار فعالية التحديد. احتضان لمدة 2-7 أيام، أو حتى اختيار كاملة.
         ملاحظة: يجب معاير تركيزات الفعالة في البداية، ولكنها عادة ما تكون 1.0 ميكروغرام / مل بوروميسين و 1.0 ملغ / مل لالنيومايسين.
      9. توسيع الخلايا في أكبر صحن 10 سم والمضي قدما في البروتوكول 2.

2. التصوير الثابتة خلايا

1. إعداد نموذج للتصوير
   1. تنظيف 8 جيد # 1.5 من الزجاج السفلي غرفة الشريحة من خلال إضافة 250 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم لا يقل عن 1 ساعة ويغسل جيدا مع PBS.
      ملاحظة: يؤدي الشرائح غرفة غير المعالجة عادة في ارتفاع إشارة الخلفية. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون خلايا حساسة للالمتبقي هيدروكسيد الصوديوم وفشل لتنظيف شاملة سطح الزجاج (ما يصل إلى 10X يغسل) قد يجعل التصاق الخلايا صعوبة. إذا لزم الأمر، واحتضان الشريحة غرفة تنظيفها مع PBS O / N بعد الغسيل. لخطوط الخلايا الحساسة، والطلاء في مناطق ذات كثافة أعلى(على سبيل المثال، في 50٪ -60٪ confluency الأولي) قد يساعد.
   2. لوحة حوالي 5.5 × 10 ^{4 من} U2OS الخلايا التعبير مستقر لكل بئر في 350 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية DMEM مع 10٪ FBS بحيث الخلايا السليمة ولم تنته متموجة عند التصوير.
   3. أداء العلاجات اللازمة لهذه التجربة، مثل إضافة التتراسيكلين للحث على البروتين التعبير.
   4. إصلاح الخلايا مباشرة قبل التصوير.
      1. قبل التثبيت، وإعداد امتصاص العرق النقي (PFA) حل - 3.7٪ PFA في 1X PHEM بنسبة 0.1٪ غلوتارالدهيد (GA). لمدة 10 مل PFA حل، تزن 0.37 غرام من PFA ونقل إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. إضافة 1 مل من الماء المقطر و 30 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم ودوامة. الحرارة عند 70 درجة مئوية والدوامة كل 1-2 دقائق حتى يذوب تماما PFA.
      2. نقل حل PFA إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل وإضافة 3.8 مل من الماء المقطر، 5 مل 2X العازلة PHEM، 20 ميكرولتر من 25٪ غلوتارالدهيد، ودوامة لخلط. الأسهم، 2X العازلة PHEM 120 أنابيب ملي و 50 ملي HEPES 20 ملي EGTA، و 16 ملي MgSO _4، مع تعديل درجة الحموضة إلى 7.0 مع 10 M KOH. ويمكن تخزين هذا الحل تثبيتي في 4 درجات مئوية لعدة أيام.
         تنبيه: PFA وGA كلاهما الخطرة. إعداد الحل في غطاء الدخان وارتداء معدات الوقاية المناسبة عند التعامل مع كل من المواد الكيميائية. تجنب استنشاق أو ملامسة الجلد مباشرة.
      3. إزالة المتوسطة النمو. يغسل بسرعة مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وإضافة 250 ميكرولتر من تثبيتي PFA لكل بئر. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة في RT.
   5. إزالة تثبيتي PFA من العينة وإضافة 350 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني أو عازلة التصوير (100 ملي تريس مع 30 ملي كلوريد الصوديوم، و 20 ملي MgCl _2، ودرجة الحموضة 8.5) لكل بئر.
   6. دوامة 100 نانومتر جزيئات الذهب لتفريق المجاميع وإضافة 35 ميكرولتر لكل بئر (10X التخفيف النهائي) لتتبع مرحلة الانجراف أثناء التصوير.
2. الحصول على صور
   1. بدوره على المجهر. السلطة على 405 و 561 نانومتر الليزر، ولكن يبقى مصاريع(داخلي أو خارجي) أغلق عند هذه النقطة. تشغيل الكاميرا EMCCD واتركه ليبرد. ضمان 561 مرشحات نانومتر في مكانها الصحيح.
   2. فتح برنامج الحصول على وتعيين وقت التعرض إلى 100 مللي ثانية وكسب EMCCD إلى 300 (مجموعة 1 - 1000).
   3. إضافة زيت الغمر للهدف وتأمين العينة إلى مرحلة المجهر.
   4. مع أي حقل مشرق أو الليزر 561 نانومتر على (~ 1 كيلو وات / سم ^2)، وجلب العينة إلى التركيز.
   5. لتصوير رأس وبروتينات غشاء أخرى، استخدم الهدف TIRF 60X امزيغ مع 1.49 الفتحة العددية وتقديم المجهر في التكوين TIRF. ضبط الليزر الإثارة بحيث يكون خارج تركزت عندما تصل إلى الفتحة الخلفي من الهدف TIRF. هذا يسبب الليزر ليصرف على الوصول إلى عينة. الحفاظ على ضبط الليزر حتى يتم الوصول إلى الزاوية الحرجة ويجري تعكس الليزر الظهر. بحث عن خلية لصورة مع العديد من جزيئات الذهب في الرأي. تحديد المنطقة ذات الاهتمامان يرفق الخلية (أو منطقة داخل الخلية) وجزيئات الذهب.
      ملاحظة: TIRF يقلل من عمق الاختراق من الليزر الإثارة ويقلل من الخروج من إشارة الخلفية التركيز. بالإضافة إلى ذلك، من المرجح أن يكون أكثر دقة عندما مزيد من جزيئات الذهب هي في رأي تصحيح الانحراف.
   6. إذا كانت متوفرة، والانخراط في نظام ضبط تلقائي للصورة لتصحيح انحراف العينة في ض الاتجاه. خلاف ذلك، وضبط التركيز يدويا في جميع أنحاء اكتساب إذا كانت الصورة يخرج من التركيز.
   7. بدء استحواذ مع 405 نانومتر ليزر قبالة والليزر 561 نانومتر على (~ 1 كيلو وات / سم ²⁾ في حالة تفعيل كاف هو ما يحدث بالفعل (عادة إذا كانت مستويات التعبير مرتفعة). خلاف ذلك، بدوره على نانومتر ليزر 405 في وضع أدنى طاقة المصنع (0.02 ميغاواط أو 0.01 W / سم ²⁾ وزيادة تدريجيا (0.1 ميغاواط في وقت واحد) حسب الضرورة حتى هناك عدة عشرات من الجزيئات في الإطار أو حتى جزيئات واحدة يتم فصل جيدا.
   8. مع استمرار الحصول على البيانات، غرادزيادة مثير جنسيا 405 نانومتر قوة الليزر للحفاظ على كثافة بقعة ثابتة تقريبا.
      ملاحظة: في أقل 405 نانومتر قوة الإثارة، يمكن بالفعل تنشيط بعض PAmCherry1. حيث أن هذه الجزيئات photobleach، فإن عدد سكان المتبقية جزيئات PAmCherry1 photoactivatable يتناقص، الأمر الذي يتطلب تدفق الفوتون العالي للحفاظ على نفس كثافة الجزيئات التي ينبعث منها مضان في كل إطار.
   9. مواصلة الحصول على الصور حتى ارتفاع 405 قوة نانومتر (2،5 حتي 10 W / سم ²⁾ لا يتم تنشيط المزيد من الأحداث التنشيط.
      ملاحظة: إجمالي اكتساب الوقت يعتمد على مستوى التعبير وكفاءة تكامل.
3. معالجة الصور
   ملاحظة: هناك العديد من الخيارات البرمجيات مفتوحة المصدر لمعالجة الصور. ومن الأمثلة على ذلك عاصفة رعدية (https://code.google.com/p/thunder-storm/) وQuickPALM (https://code.google.com/ص / quickpalm /). موضحة إجراءات معالجة البيانات النموذجية هنا بإيجاز باستخدام حزمة ماتلاب مخصص يسمى wfiread معالجة البيانات وPALM كمثال على ذلك. ومع ذلك، المراجعات المستقبلية قد لا يتبع بالضبط ما هو موضح هنا. لمعالجة الصور مع البرامج الأخرى، يرجى الرجوع إلى الوثائق المستخدم.
   1. تحميل برامج معالجة الصور (قانون التكميلي ملف) أو الإصدار الأحدث في http://www.ohsu.edu/nan. فتح مطلب وتحميل البرامج wfiread (التي وضعت بالفعل في المسار الافتراضي).
   2. عرض تسلسل الصور الخام وتحديد المنطقة ذات الاهتمام. حدد منطقة المكدس لتتم معالجتها عن طريق النقر على اليسار وسحب مربع حول المنطقة المطلوبة. إذا لم يقل منطقة الفائدة خلال اقتناء (نحو 256x256 بكسل)، حدد مساحة أصغر لتقليل الوقت حساب. لإلغاء منطقة والعمليات الإطار بأكمله، انقر بزر الماوس الأيمن في أي مكان في اله الصورة.
   3. دخول مجموعة من الإطارات لتتم معالجتها.
   4. حدد الجسيمات الذهب (واحد هو أن عزل وموحدة في الشكل) عن طريق النقر الأيسر على الصورة وسحب مربع صغير من حوله. تحت تتبع الجسيمات، انقر فوق الزر المسار. سيظهر رسم بياني يوضح الموقف من الجسيمات الذهب المختارة عبر كومة من الصور، التي تصور مدى الانحراف.
   5. كرر هذه العملية لتعقب العديد من جزيئات الذهب ممكن، وتحديد تلك التي تتبع معا (الجزيئات سوف يكون لون مشفرة). من الناحية المثالية الانجراف الكلي هو بناء على أمر من بكسل واحد على الأكثر.
   6. فردي تحديد جزيئات الذهب التي تعقب معا في وقت واحد وانقر على زر ماركر إضافة إطار تتبع الجسيمات. سيظهر الصليب الأخضر مما يدل على أنه قد تم إضافته كعلامة وسيتم استخدامها لتصحيح الانحراف.
   7. ضبط المدى سيغما، المدى تجانس وعتبة عند الضرورة عن طريق تغيير القيم قليلا. انقر بحث الجسيماتزر لاختبار الإعدادات. سيتم محاصر الجزيئات التي سيتم تجهيزها وتلك التي لن يتم استبعاده. جزيئات PAmCherry1، الجزيئات التي تكون الجولة نسبيا ومشرق، ويجب أن يكون محددا.
   8. بدء معالجة الصور عن طريق النقر على زر الصنع COORD الملف وحفظ الملف.
      ملاحظة: سيقوم البرنامج تذهب من خلال كل إطار في نطاق الإطار المحدد، والعثور على جميع البقع الفلورسنت، وأداء المناسب الضبابي للعثور على إحداثيات النقطه الوسطى. سيتم إنشاء ملف .cor تخزين جميع الإحداثيات والمعلمات المناسب غيرها من الصور جزيء واحد معالجتها.
4. بعد عملية الصور وتجعل الصورة PALM
   ملاحظة: برامج أخرى قد تجعل مباشرة على صورة بعد تنسيق الاستخراج.
   1. في Matlab، وإطلاق حزمة 'نخيل' وتحميل الملف .cor بإنشائها.
   2. قبل تقديم صورة PALM باستخدام الإحداثيات، فرز الإحداثيات الفردية (كل من "localizatiعلى الحدث '). قد تختلف القيم المثلى الفرز حسب الإعداد وfluorophore.
      1. لPAmCherry1، استخدم القيم التالية: الجمع بين الإطار - 8؛ الجمع بين المسافة (نانومتر) - 100؛ الحد الأدنى RMS - 4؛ الحد الأدنى صالح الخير - 0.25. وماكس. الانحراف - 1.4. راجع قسم مناقشة تفسيرا إضافيا لهذه المعايير.
   3. انقر فوق الزر الترتيب لإنشاء مجموعة جديدة من الإحداثيات على استعداد لتقديم صور عالية الدقة.
   4. إدخال قيم لتقديم السليم للصورة النهائية مثل حجم الخام بكسل (نانومتر)، وحجم الميزة المطلوبة (نانومتر) في الصورة المقدمة، وحجم بكسل للصورة المقدمة.
      ملاحظة: يجب أن يتم تحديد حجم بكسل الخام لكل الإعداد. يمكن تعيين حجم الميزة المقدمة بشكل تعسفي، ولكن عادة ما يتم تعيين في قيمة أعلى قليلا من متوسط ​​دقة الترجمة. لPAmCherry1، متوسط ​​الدقة توطين حوالي 18 نانومتر، وذلك على حجم سمة من سمات 20-30 نانومتر هو appropriaالشركة المصرية للاتصالات. من المذكرة، تم احتساب دقة الترجمة عن طريق اتخاذ الانحراف المعياري للتعريب من نفس الجزيء عبر عدة إطارات ²² وليس عن طريق قسمة الحد حيود مع الجذر التربيعي لعدد من الفوتونات الكشف. أما بالنسبة لحجم بكسل من الصورة المقدمة، و10 نانومتر هو نقطة انطلاق جيدة. ووضع هذه القيمة منخفضة جدا ينتج في ملفات صورة كبيرة دون داع لوجهات النظر unmagnified.
   5. انقر على زر التقديم لتوليد صورة PALM. استخدام +/- الرموز المكبرة في شريط الأدوات من النافذة الرقم إلى تكبير والتصغير.
   6. اختياري: إجراء تحليل مجموعة من الصورة PALM بناؤها باستخدام اختبار K ريبلي أو آليات أخرى مثل بمساعدة المحاكاة DBSCAN (SAD) ^23. ملاحظة: في حزمة النخيل المخصصة، يتم بناؤها على حد سواء ريبلي K وتحليل SAD بالفعل في؛ لإحداثيات الناتجة عن البرامج الأخرى، يمكن إجراء نفس التحاليل مع البرامج النصية المخصصة إضافية.

3. واحدة تتبع جزيء في الخلايا الحية

1. علاج السطح زراعة الأنسجة والخلايا لوحة كما هو موضح في البروتوكول 2. منذ درجة الحرارة و / أو CO _{2 مرحلة} التحكم قد يحتاج الى صحن ثقافة معينة، وضمان من أن ساترة لديه سمك المناسب (0.17 مم) لإعداد المجهري.
   1. Transfect الخلايا إذا فعل تعبير عابر وتنفيذ أي العلاجات اللازمة لهذه التجربة، مثل التتراسيكلين للحث على التعبير، واحتضان عند الضرورة. وهذا أيضا هو نفسه كما هو موضح في البروتوكول 2.
   2. مكان الطبق الثقافة في حاضنة على المسرح. السماح للطبق يستقر على المسرح لبضع دقائق حتى درجة الحرارة وتركيز CO ₂ تحقيق الاستقرار في كل مرة بعد تركيب الطبق الثقافة أو الانتقال إلى منطقة جديدة من الفائدة. الليزر كتلة في هذه الخطوة. إذا CO ₂ التحكم غير متوفرة، التغيير إلى CO ₂ وسائل الإعلام المستقلة الحق قبل التصوير، مثل LeibovITZ في L-15.
      ملاحظة: يوصى المتوسطة مجانا الفينول الحمراء لمضان خلفية كئيبة.
2. الحصول على صور كما في بروتوكول 2. ومع ذلك، تعيين وقت التعرض المناسب (عادة 25-50 ميللي ثانية لPAmCherry1).
   ملاحظة: يجب أن تكون كثافة جزيء أقل من الخلايا الثابتة بحيث يمكن تسجيل المسارات دون تداخل مع بعضها البعض. عشرات قليلة محددة من الجزيئات هو الحال بالنسبة للاستحواذ 256x256 بكسل في حجم بكسل حوالي 160 نانومتر. تم تعيين كثافة طاقة الليزر 561 نانومتر إلى 0.8 كيلو واط / سم ² للحفاظ على نسبة جيدة إشارة إلى الضوضاء في حين خفض الضيائية إلى الخلايا وزيادة متوسط ​​طول المسار.
3. معالجة الصور.
   1. استخراج إحداثيات جزيئات واحدة مع حزمة wfiread كما هو موضح في بروتوكول 2، أو مع حزمة أخرى.
   2. إعادة بناء مسارات الجسيمات واحدة باستخدام مختلف جسيم واحد تتبع (SPT) حزم على أساس خوارزميات مختلفة وجدتفي أماكن أخرى ^24. ملاحظة: بدلا من ذلك، فإن هذه الخطوة يمكن إنجازه باستخدام حزمة ماتلاب بنيت المنزل (ربما المتاحة في المراجعات المستقبلية في http://www.ohsu.edu/nan.
   3. اختياري: بعد إعادة الإعمار، استخدم حزمة SPT ²⁴ لحساب تشريد ونشرها الثوابت من مسارات. بالإضافة إلى ذلك، استخدم تباين بايز واحد الجسيمات تتبع (vbSPT) ²⁵ لتحديد الدول نشرها من البروتينات المستهدفة. ويمكن الاطلاع على حزمة vbSPT مطلب والوثائق في موقع سورس موقعها الرسمي: http://vbspt.sourceforge.net/.

النتائج

على سبيل المثال BiFC-PALM المبين هو KRAS G12D متحولة التفاعل مع رأس ملزم المجال (RBD) من CRAF (الشكل 1A). كما تمت مناقشته، لم الموسومة RN أو شظايا RC إلى C-محطة رأس لأنه سيعطل توطين الغشاء وبالتالي النشاط البيولوجي للرأس. خفضت هذه التركيبات الممكنة 8-4 (الشكل 1B). وقدم كل...

Discussion

وقد BiFC أسلوب يستخدم عادة للكشف عن وتصور مثبطات مضخة البروتون في الخلايا، في حين PALM هو جزيء واحد superresolution تقنية المجهر الأخيرة التي تمكن التصوير النانو العينات البيولوجية سليمة. مزيج من BiFC مع PALM يتحقق التصوير الانتقائي لمثبطات مضخة البروتون داخل زنزانة مع نانومتر الق...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope frame	Nikon	Ti-U
60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA	Nikon	CFI Apo TIRF 60x H
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 897
561 nm laser	Opto Engine	MGL-FN-561
405 nm laser	Coherent	CUBE-405 50mW
561 nm dichroic mirror	Semrock	Di01-R405/488/561/635-25x36
561 nm filter	Semrock	FF01-525/45-25
405/561 nm notch filter	Semrock	NF01-405/488/568-25
Temperature and CO2 controlled stage	Tokai Hit	INUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS	Addgene	60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS	Addgene	60546
pcDNA3.2-DEST	Life Technologies	12489-019
pLenti-DEST	Addgene		http://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-531
In-Fusion HD Cloning	Clontech	639649
LR Clonase	Life Technologies	11791
Vira Power Lentivirus Packaging	Life Technologies	K497500
X-tremeGENE Transfection Reagent	Roche	13873800
Lab-Tek II Chambered Coverglass	Thermo Scientific	155409	#1.5 glass bottom dishes
U2OS cells	ATCC	HTB-96
293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
DMEM with phenol red	Life Technologies	11995
DMEM no phenol red	Life Technologies	21063
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082
Leibovit's L-15, no phenol red	Life Technologies	21083-027
Reduced serum medium	Life Technologies	31985
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	14040
Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe filter	Millipore	SLHV033RB
Lentiviral concentrator	Clontech	631231
Retroviral concentrator	Clontech	631455
10 cm culture dish	BD Biosciences	353003
6-well culture plate	BD Biosciences	353046
Polybrene	Sigma	107689
Puromycin	Life Technologies	A11138
G-418	Calbiochem	345812	Neomycin
Doxycyline	Fisher	BP2653
Tris base	Fisher	BP152
EDTA	Sigma	EDS
Sodium Hydroxide	Sigma	S5881
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Glutaraldehyde	Sigma	G6257
PIPES	Sigma	P6757
HEPES	Sigma	H4034
EGTA	Sigma	3777
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643
Potassium Hydroxide	Sigma	221473
Sodium chloride	Fisher	BP358
Magnesium chloride	Fisher	M33
100 nm gold particles	BBI Solutions	EM.GC100
Molecular grade water	Life Technologies	10977
Dpn1	New England Biolabs	R0176
PCR purification kit	Qiagen	28104
Miniprep kit	Qiagen	27104
Midiprep kit	Macherey-Nagel	740410
0.6 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-120
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-137
15 ml tubes	Fisher	05-539-12
5 ml polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352063
14 ml polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352059
50 ml tube	BD Biosciences	352070
PCR tube	GeneMate	C-3328-1
SOC medium	Life Technologies	15544
LB broth	BD Biosciences	244610
Kanamycin sulfate	Fisher	BP906
Competent cells	Life Technologies	C4040
Matlab	Mathworks