JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Аннотация

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Введение

Белок-белковые взаимодействия (ИПП) являются основой для биологии 1 и жестко регулируется с помощью пространственно-временных механизмов по многим длины и времени масштабах. Исследования клеточной сигнализации на клеточной мембране, например, показали, динамические, наноразмерные пространственные отсеки, которые облегчают конкретных ИЦП и клеточные процессы 2. Следовательно, возможность проверки ИЦП в биологических системах с достаточным пространственным и временным разрешением, высокой специфичностью и высокой чувствительностью является ключом к достижению механическое понимание биологии.

Бимолекулярные флуоресценции комплементации (BiFC) является одним из немногих существующих инструментов для визуализации ИЦП в клетке с субклеточном разрешение и совместимости жить-клеток 3 - 5. Техника достаточно проста и включает в себя расщепление флуоресценции белка в двух нефлуоресцентных фрагментов; когда генетически привязаны к двух взаимодействующих белков иприведены в близости, фрагменты могут восстановить, чтобы сформировать полный флуоресцентный белок, с получением флуоресцентного сигнала. При правильном проектировании BiFC зонды не должны самопроизвольно восстановить в отсутствие ИПП. Таким образом, сигнал флуоресценции в анализе BiFC будет возникать только в присутствии ИПП, который позволяет прямой визуализации ИПП с высокой специфичностью. Дополнительные преимущества использования флуоресценции как отсчеты высокой чувствительностью, субклеточных разрешение, а также совместимость с высокой пропускной способностью и высоким содержанием скрининга, среди других. Для этих льгот, были разработаны ряд BiFC зондов, основанных на различных белков родитель люминесцентных. Как и во всех других методов обнаружения на основе обычной световой микроскопии, однако, пространственное разрешение BiFC ограничено ~ 250 нм с помощью дифракции света. Это делает его вызов изучить регулирование ИПП на наноуровне, который, как упоминал ранее, и на примере липидов плоты 6 Aй Ras нанокластеры 7, является критическим масштаб длины к пониманию многих клеточных процессов, таких как сигнализации.

BiFC была объединена с фотоактивируемой локализации микроскопии (PALM) 8,9 преодолеть этот предел в пространственного разрешения для визуализации ИЦП 10. PALM является новый метод микроскопии сверхразрешения, что обходит дифракционный предел в флуоресценции через стохастической активации и subdiffractive локализации отдельных флуоресцентных молекул. В каждом цикле активации, флуоресцентная молекула излучает нескольких сотен до нескольких тысяч фотонов и приводит к одной молекуле изображения на детекторе. В то время как изображение дифракционной (~ 250 нм в ширину), его центр тяжести может быть определена с гораздо более высокой точностью, как правило, порядка 10-50 нм в зависимости от числа фотонов, зарегистрированных. При активации и локализации каждый флуоресцентный молекулу в пробе, высокое разрешение изображения может быть восстановлена. Performeд на живые клетки, одна молекула отслеживания (СМТ) ПАЛМ дальнейшие разрешения приобретение тысяч диффузии белка траекторий из одной клетки 11. Важно отметить, что PALM использует специализированные флуоресцентных зондов, таких как фотоактивируемых флуоресцентных белков (ПА-FPS), чтобы достичь стохастический активации. Так как BiFC и PALM использование флуоресцентных белков, они были объединены путем разделения PAmCherry1, обычно используемый PA-FP для PALM, в двух фрагментов между аминокислотами 159 и 160.

Система основана на BiFC разделенного PAmCherry1 показывает низкий фоновый сигнал от спонтанных восстановление двух фрагментов. При генетически привязаны к паре взаимодействующих белков, два фрагмента (РН = остатки 1-159; RC = Met + остатки 160-236) восстанавливали эффективно формировать полные PAmCherry1 белки, даже при 37 ° С и без инкубации при более низких температурах, что это не так для других пар 12 BiFC, таких как родителя mCherry 13. FurthermoRe, восстановленный белок PAmCherry1 сохранил фотофизические свойства родительского PAmCherry1, такие как высокая контрастность, выход среднего фотона, и быстро фотоактивации, среди других, которые имеют решающее значение для точной локализации одной молекулы и PALM изображений с высоким разрешением.

В этом протоколе, использование BiFC пальма для визуализации Рас-Raf взаимодействий в клетках U2OS с помощью разделения PAmCherry1 (фиг.1А) описан. Первым шагом является разработка конструкции, для выражения слитые белки между PAmCherry1 фрагментов (т.е., RN и RC) и белков, представляющих интерес. В теории, для каждой пары кандидатов белков (А и В), существует восемь пар слитых белков, которые будут проверены: РН-А / RC-B; РН-A / B-RC; RC-А / РН-В; RC-A / B-РН; А-РН / RC-Б; А-РН / B-RC; А-RC / РН-В; и А-RC / B-РН. Этот процесс часто может быть упрощена с учетом структурных или биохимических свойств белков-кандидатов. В случае Ras, белокпосттрансляционно изменен на CAAX коробке С-концевой (C = Cys; А = алифатический, X = любое), после чего AAX мотив отщепляется. Следовательно, Р. или RC может быть слит только N-конца Ras; это снижает количество пар слитый белок четырех (фиг.1В). Для Raf, Рас-то связывающего домена (RBD; остатки 51-131) используется и может быть помечены на любом конце. Были получены эти четыре конфигурации слияния: РН-Крас / RC-Раф РосБР; РН-Крас / Раф РосБР-RC; RC-Крас / РН-Раф РосБР; и RC-Крас / Раф РосБР-РН.

Кроме того, линкер между фрагментами и представляющих интерес белков необходимо будет учитывать. Гибкий линкер около десяти аминокислот часто используется, поскольку он обеспечивает достаточную свободу для комплементации происходят. Одним из таких линкер (GGGGS) х2, хотя есть много других, которые были успешно применены, в том числе случайных последовательностей, генерируемых из множественного клонирования (MCS) 14. Длина линкеров может должны быть оптимизированы в зависимг от размера белков интерес и их ориентации при взаимодействии.

Фрагменты PAmCherry1 содержатся в небольшом клонирования позвоночника с фланговые MCSS (см список материалов). Гены интерес может быть вставлен с помощью сайтов рестрикции или лигирования с независимым методом. После клонирования и последовательности проверки, кассета экспрессии передается в вектор экспрессии с использованием реакции рекомбиназы, процесс клонирования с высокой точностью и высокой эффективностью.

Затем полученный экспрессирующие конструкции трансфицировали в клетки-мишени линии или, если стабильной клеточной линии желательно, упаковывают в лентивирусов для инфицирования линии клеток-мишеней. Временная трансфекция позволяет быстро проверки конфигураций BiFC, но потенциальные проблемы должны быть отмечены. Трансфекция с использованием химических веществ, часто подчеркивает клетки, что приводит к высокой флуоресценции; в то время как использование общей флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) microscoру может смягчить эту фоновый сигнал путем ограничения объема освещения, TIRF идеал, когда ИПП состоится на клеточной мембране. Кроме того, переходные трансфекции часто приводят к высоким уровням экспрессии белка, что значительно превышает те из эндогенных белков, которые могут привести к появлению артефактов в обнаружении ИЦП. Следовательно, рекомендуется, чтобы стабильных клеточных линий, будут созданы после соответствующей конфигурации BiFC была определена с помощью начального тестирования. Стабильные клеточные линии также имеют потенциал для перестраиваемого выражения с помощью доксициклина индукции 15.

После заражения, клетки отбирают с помощью антибиотиков, как правило, пуромицин и неомицин, по одному для каждой конструкции. Последующие шаги для подготовки образца, получения изображений и анализа данных будет подробно описан в протоколах.

При таком подходе, наблюдается формирование наноразмерных кластеров в BiFC-PALM изображений Рас-Raf РосБР регулярно (2А </ STRONG>). Последовательно, SMT-PALM траектории Рас-Raf РосБР показать неоднородность распределения в диффузионной государств (2В-D). Эти результаты показывают, что существуют Рас-Raf комплексов в нескольких штатах на клеточной мембране, по-видимому, как мономеры и кластеры, с потенциальными биологических последствий. Эта работа демонстрирует силу BiFC-PALM в избирательном изображений ИПП в клетках с нанометровым пространственным разрешением и чувствительностью одной молекулы, которая будет трудно получить с обычными BiFC, флуоресценции совместной локализации, или флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET).

При проектировании BiFC эксперименты и интерпретации результатов, важно иметь в виду, что процесс необратим BiFC в большинстве случаев, в том числе сплит PAmCherry1. После того, как два фрагмента объединить и образуют полную PAmCherry1 белок, связь между двумя фрагментами, и, таким образом PPI становится постоянным. Это ограничивает использование BiFC и BiFC-PALМ для мониторинга динамики ИЦП (т.е. обязательные кинетики и динамики не диффузии белкового комплекса, когда он формируется), а порой может даже привести к mislocalization ИЦП комплексов.

Дополнительным фактором, чтобы рассмотреть при проектировании BiFC пальма эксперименты задержка в созревании хромофора, что присуще флуоресцентных белков. После того, как два белка взаимодействуют и фрагменты FP собрались вместе, они, как правило повторно сворачивают порядка секунд (половина времени 60 сек для EYFP 3). Тем не менее, последующее созревание хромофора и флуоресцентный сигнал развивать порядка минут. В то время как флуоресценция может быть обнаружено в пределах 10 мин после восстановления сплит-Венеры, быстро складной YFP вариант, половина времени для созревания в целом часто около 60 мин 16. Сплит-PAmCherry1 наблюдалось, имеют аналогичные ставки. Следовательно, BiFC и BiFC пальма в настоящее время плохой выбор для мониторинга в режиме реального времени PPI кинетики; другой яthods, такие как FRET и недавно разработанный димеризации зависит флуоресцентного белка 17 может быть более подходящим для этой цели.

протокол

1. Клонирование

  1. Определить конфигурации клонировать и выбрать линкер. Тег белки с фрагментами на N- или С-конце, как описано ниже, чтобы они не нарушают их надлежащее локализации. Использование гибкий линкер, такой как (GGGGS) х2.
  2. Генетически пометить белки, представляющие интерес для фрагментов PAmCherry1. Как один из вариантов, используйте клонирования плазмиды в Списке материалов, содержащих фрагменты RN (PAmCherry1 остатки 1-159) и RC (Met плюс PAmCherry1 остатки 160-236) с фланговые MCS последовательности.
    1. Линеаризуем плазмид, содержащих фрагменты RN и RC с обратной ПЦР (или ограничение дайджест) в точке вставки. Грунтовки для обратной ПЦР приведены в таблице 1. Ниже приведен пример ПЦР протокол, используемый в лаборатории автора (см список материалов для точных материалов, используемых в этом протоколе).
      1. Смешайте ПЦР вместе, доведена до конечного объема 50 мкл водой: в тонкостенныхред ПЦР трубки, добавляют воду 25 мкл 2x мастер смеси, 0,5 мкл каждого из прямого и обратного праймеров (20 мкМ разбавляют акции, 0,2 мкМ конечная концентрация) и 1 нг матричной. Используйте следующие условия велосипедные: 98 ° C в течение 30 сек, 30 циклов 98 ° С в течение 7 секунд и 68 ° С в течение 2 мин, и окончательное удлинение при 72 ° С в течение 10 мин.
    2. ПЦР гены, представляющие интерес для вставки в линеаризованных плазмид, содержащих RN и RC фрагменты. Выполните ПЦР, как в шаге 1.2.1 со временем расширение при 68 ° C. Использование праймеров с заходами, которые содержат гибкую линкерную последовательность, например, для GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT (GGGGS) х2, и 15 пар оснований гомологичности к концам линеаризованной RN и RC плазмид для рекомбинации.
      Примечание: праймеров выступы для представляющих интерес белков представлены в таблице 2, если с использованием праймеров в таблице 1 для линеаризации плазмиды основу.
    3. Дайджест ПЦРРеакцию с Dpn1 устранить матрицы для ПЦР. Добавить 0,5 мкл Dpn1 (20 ед / мкл) непосредственно в 50 мкл ПЦР-реакции. Инкубируют при 37 ° С в течение 1 ч и тепловой инактивации при 80 ° С в течение 20 мин. Если фон шаблон сохраняется на последующих этапах, увеличить количество фермента или удлинить время пищеварения.
    4. Очищают с помощью ПЦР-продуктов на ротационную колонку, как описано производителем.
    5. Выполнение набора для лигирования независимые реакции совместить линеаризованной плазмиды, содержащей RN или RC фрагмент с нужным геном. Измерение концентрации очищенных продуктов ПЦР: объединить 50 нг линеаризованной плазмиды и 50 нг интересующего гена с 1 мкл фермента премикса и довести общий объем до 5 мкл деионизированной воды. Инкубируют при 50 ° С в течение 15 мин, место на льду, и добавить 20 мкл ТЕ-буфера.
    6. Transform рекомбинантные плазмиды в компетентные бактерий 18.
    7. Выберите 2-4 + (как требовалось) колоний для O / N культуры. Добавьте 5 млЛ.Б. бульона и 5 мкл канамицина (50 мг / мл фондовом) в 14 мл в полипропиленовый с круглым дном трубы, и добавить выбранный бактерий колонии стерилизованной прививки петли. Выдержите в 37 ° CO / N при встряхивании при 225 оборотах в минуту.
    8. Замораживание 1 мл o / n культуры для глицерина сырье 19 и Miniprep остаток, как описано производителем.
    9. Выполнение последовательности, чтобы определить хорошую клон. При использовании клонирования плазмиды в список материалов, использовать M13 прямого и обратного праймеров (в отдельных реакций) по мере необходимости, чтобы получить полную последовательность слитой конструкции. Сравнить с ожидаемым последовательности, используя инструмент выравнивания, как BLAST, такие из Национального центра биотехнологической информации (NCBI) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
    10. Передача последовательности-проверено конструкции к выражению плазмиды с помощью реакции рекомбиназы.
      1. Добавить 75 нг плазмиды назначения и #8212; таких как рсДНК для переходных трансфекции или Plenti для лентивирусного упаковки 20 - и 50 нг рекомбинантного клонирования плазмиды в 1 мкл фермента премикса и воспитывать общий объем до 5 мкл деионизированной воды. Инкубируют при 25 ° С в течение 1 ч, затем добавляют 5 мкл ТЕ-буфера.
        Примечание: лентивирусов упаковки и стабильной генерации клеточной линии, использовать другую плазмиду назначения для каждой конструкции, например, один с сопротивлением пуромицин и другой неомицина. Это позволяет двойного отбора трансдуцированных клеток. Также учитывать промотор для каждого, например, конститутивный цитомегаловирус (ЦМВ) промотора для высокого уровня экспрессии, или CMV с оператором Teto перестраиваемых доксициклина регулируемой экспрессии.
      2. Преобразование 5 мкл компетентных бактерий в Miniprep и плазмид, как на этапах 1.2.6 до 1.2.8, но с использованием соответствующего антибиотика (обычно ампициллина).
  3. Определить оптимальныйКонфигурация BiFC.
    1. Со-трансфекции плазмиды экспрессии в клетках U2OS (или клетка выбора).
      1. Добавить 350 мкл фенола красного и антибиотиков без DMEM с добавлением 10% FBS в каждую лунку 8-а # 1,5 стеклянным дном камеры слайда. Пластинчатые около 7,5 х 10 4 клеток на лунку так клеток около 70% -90% сливной следующий день.
      2. На следующий день после экспрессии обшивки, со-трансфекции плазмид с различными конфигурациями в каждую лунку с использованием предпочтительным реагентом и, как описано производителем.
        1. Для каждого, добавьте 125 нг каждого выражения плазмиды в 50 мкл бессывороточной сниженным СМИ в 0,6 мл трубки и пипетки вверх и вниз, чтобы смешаться. Добавить 1 мкл реагента для трансфекции по центру трубы и непосредственно в средствах массовой информации. Перемешивают осторожно перемешать и дать реакцию сидеть в течение 30 мин.
        2. Сокращение средств массовой информации в каждую лунку камеры слайд примерно наполовину. Добавьте по каплям смесь для трансфекции в лунки и встряхните гмому перемешать. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 24-48 часов. Изменить МЕДИА день после трансфекции.
    2. Клетки изображение на флуоресцентного микроскопа как в Протоколе 2, начиная с шага 2.1.4.
      Примечание: Образец может быть отображена на стандартном флуоресцентного микроскопа, если уровни экспрессии высоки, и камера достаточно чувствительным для относительно низкой выходной фотонов PAmCherry1. Восстановленные молекулы PAmCherry1 может быть активирована с ультра фиолетовый набор фильтров (405 нм) до визуализации с зеленым возбуждения (561 нм) набор фильтров.
  4. В случае необходимости, создать отрицательный контроль путем, например, введением точечную мутацию в одном из белков, представляющих интерес, что нарушает взаимодействие. Выполнить сайт-направленный мутагенез 21 на клонирования плазмиды белка подлежит мутации и выбранной конфигурации.
  5. Генерация стабильной клеточной линии путем упаковки конструкции в вирусныечастицы и заражают клетки U2OS (или клеточной линии выбора). Рассмотрим систему (индуцируемый тетрациклин) выражение 15 выражение так может быть вызван до визуализации, если продлен необратимость BiFC является проблемой, или если перестраиваемый выражение лучшего.
    ВНИМАНИЕ: Работа с вирусами классифицируется как уровень биобезопасности 2. В то время как последние поколения вирусных упаковочных систем значительно снижается вероятность получения репликации компетентных вирусов, некоторые риски все еще присутствуют. Ссылки можно найти на http://www.cdc.gov/biosafety/publications/.
    1. Повторите шаг 1.2.10 помощью lenti- или ретровирусную назначения вектор 20. Увеличьте O / N культуру до 100 мл для midiprep и большей чистоты плазмид.
    2. На день 1: плиты около 2 × 10 6 293T / 17 клеток в 10 см чашку для каждой конструкции должны быть упакованы.
    3. На 2-й день: Подготовка реакцию трансфекции с использованием плаnsfection выбранным реагентом и, как описано производителем.
      1. Готовят премикс упаковки плазмиды с конечной концентрации 250 нг / мкл для упаковки плазмид 1 и 2, и 100 нг / мкл плазмиды для упаковки 3 в стерильной воде. Добавьте 10 мкл плазмиды упаковка премикса и 2,5 мкг плазмиды целевого к 1 мл бессывороточной сниженным сред в 5-мл полипропиленовую круглым дном трубки и пипетки вверх и вниз, чтобы перемешать. Добавить 20 мкл реагента для трансфекции по центру трубы и непосредственно в средствах массовой информации.
        1. Перемешивают осторожно перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин. Удалить около половины средств массовой информации из клеток и добавить трансфекции смесь по каплям. Взболтать слегка смешать и инкубировать при 37 ° С и 5% СО 2. Выдержите 10 мл средствах массовой информации в пластине в трубке с крышкой ослабил температуры и CO 2 для уравновешивания.
      2. На 3-й день: Осторожно изменить СМИ с предварительно инкубировали СМИ и RETURп клетки в инкубатор. Выдержите другую трубу СМИ с крышкой ослабил.
        Примечание: Синцитии, или образование крупных многоквартирных ядерных клеток, может быть признаком того, что упаковка будет хорошо. Тем не менее, клетки находятся в состоянии дефицита и могут быть легко отделены. При установке другого типа носителя, наклонить пипетки так, чтобы она располагалась горизонтально и по каплям добавляют в один медиа кромки пластины.
      3. На 4-й день: Урожай вирус путем удаления носителя с помощью шприца и фильтрации через фильтр размером 0,45 мкм пор в чистую пробирку на 50 мл. Аккуратно поставьте СМИ с предварительно инкубировали СМИ.
      4. На 5-й день: Урожай снова, как это сделано ранее в шаге 1.5.3.3 и объединить общую фильтрат в той же трубке 50 мл. Добавить 6 мл вируса концентратора в каждую пробирку и перемешать. Хранить при 4 ° С в течение по меньшей мере 24 ч до тех пор, вирусных выделений.
        Примечание: В зависимости от состояния здоровья клеток, вирус может быть собран в третий раз.
      5. Концентрат вирус путем центрифугирования при 1500 мкгв течение 15 мин при 4 ° С. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок в 250 мкл среды. Вирус может быть использована немедленно для инфекции или храниться в 50 мкл аликвоты при -80 ° С на срок до одного года.
      6. Пластинчатые около 3 х 10 5 U2OS (или цель) клеток на лунку в 6-луночный планшет (2 мл DMEM с 10% FBS на лунку) в течение инфекции, поэтому клетки около 50% сплошности в момент инфекции.
      7. На следующий день, удалить около половины средств массовой информации, так около 1 мл останков. Coinfect с 50 мкл концентрированной вируса для каждой конструкции. Добавить 1 мкл полибрена (8 мг / мл) в каждую лунку. Инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2. Изменить массовой информации на следующий день и инкубировать в течение еще одного дня до выбора антибиотиков.
        Примечание: количество вируса для добавления может варьироваться в зависимости от желаемой скорости инфекции. Вирусы можно титровать с помощью Qrt-ПЦР.
      8. Добавить антибиотики, чтобы выбрать для зараженных клеток. Отдельные скважины с неинфицированных клеток, которые не видели VIрус требуется, как канарейки, чтобы проверить эффективность отбора. Инкубировать в течение 2-7 дней, или до тех пор, выбор не будет завершена.
        Примечание: Эффективные концентрации следует подбирать изначально, но они, как правило 1.0 мкг / мл для пуромицин и 1,0 мг / мл неомицина для.
      9. Развернуть клеток в большей 10 см блюдо и приступить к Протоколу 2.

2. Исправлена ​​визуализации Клетки

  1. Подготовка образца для визуализации
    1. Очистить 8-а # 1,5 прозрачным дном камеры слайд добавлением 250 мкл 1 М NaOH в течение 1 ч и тщательно промыть PBS.
      Примечание: Необработанные камеры скользит обычно приводит к высокой фонового сигнала. Кроме того, клетки могут быть чувствительны к остаточному NaOH и неудачи, чтобы полностью очистить поверхность стекла (как многие, как 10x моет) могут сделать клеточной адгезии трудно. При необходимости, инкубировать очищенный камеры слайд с PBS O / N после мытья. Для чувствительных клеточных линий, покрытие с более высокой плотностью(Например, при 50% -60% первоначальный конфлюентности) может помочь.
    2. Пластина 5,5 х 10 4 из U2OS стабильной экспрессии клеток на лунку в 350 мкл фенола красного свободной DMEM с 10% FBS, так что клетки здоровы и не более чем сливной при визуализации.
    3. Выполните необходимые процедуры для эксперимента, такие как добавление тетрациклин, чтобы вызвать экспрессию белка.
    4. Fix клетки непосредственно перед визуализации.
      1. До фиксации, подготовить свежие параформальдегида решение (PFA) - на 3,7% PFA в 1x ФЭУ с 0,1% глутарового альдегида (ГА). В течение 10 мл раствора PFA, вес 0,37 г PFA, и переносят в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Добавить 1 мл дистиллированной воды и 30 мкл 1 М NaOH и вихря. Нагревают при 70 ° С и вихрь каждые 1-2 мин до PFA полного растворения.
      2. Передача растворяют PFA в 15 мл коническую пробирку и добавляют 3,8 мл дистиллированной воды, 5 мл 2x буфер ФЭУ, 20 мкл 25% глутарового альдегида и вихрь перемешать. Фото, 2x ФЭУ буфер 120 мм труб, 50 мМ HEPES, 20 мМ ЭДТА, и 16 мМ MgSO 4, с рН доводили до 7,0 с помощью 10 М КОН. Этот фиксатор раствор можно хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких дней.
        ВНИМАНИЕ: PFA Г.А. оба опасным. Приготовьте раствор в вытяжном шкафу и носить соответствующее защитное оборудование при работе обоих химических веществ. Избегайте вдыхания или прямого контакта с кожей.
      3. Удалить ростовой среды. Промыть быстро 500 мкл PBS и добавляют 250 мкл фиксатором PFA в каждую лунку. Инкубируйте клетки в течение 20 мин при комнатной температуре.
    5. Удалить фиксатором PFA из образца и добавить 350 мкл PBS или буфера изображения (100 мМ Трис с 30 мМ NaCl и 20 мМ MgCl 2, рН 8,5) в каждую лунку.
    6. Вихревые 100 нм частицы золота, чтобы разбить агрегаты и добавить 35 мкл на лунку (10x окончательное разведение) для отслеживания стадии дрейф во время съемки.
  2. Получение изображений
    1. Включите микроскопа. Включите нм лазеров 405 и 561, но сохранить ставни(внутренний или внешний) закрыт в этой точке. Включите камеру и EMCCD позволяют ему остыть. Убедитесь, что фильтры нм 561 на месте.
    2. Откройте программное обеспечение сбора и установить время экспозиции до 100 мс, а коэффициент усиления EMCCD до 300 (диапазон 1 - 1000).
    3. Добавить иммерсионное масло с целью обеспечения и образец к столику микроскопа.
    4. При любом светлом поле или 561 нм лазера на (~ 1 кВт / см 2), довести образец в центре внимания.
    5. Для визуализации РАН и других мембранных белков, используйте 60X Apochromat TIRF объектив с числовой апертурой 1,49 и принести микроскоп в конфигурации TIRF. Отрегулируйте лазер возбуждения, так что это не совсем по центру при ударе о заднюю апертуру объектива TIRF; это приводит к лазеру отклоняться при достижении образец. Держите регулировки лазера до критического угла не достигнуто, и лазер отражается обратно. Поиск клетки к изображению с несколькими частицами золота в поле зрения. Установите область интересакоторый охватывает клетки (или регион внутри клетки) и частицы золота.
      Примечание: TIRF уменьшает глубину проникновения лазера возбуждения и снижает в фокусе фонового сигнала. Кроме того, коррекции дрейфа, вероятно, будет более точным, когда больше золота частицы в поле зрения.
    6. Если есть возможность, участвовать систему автофокусировки для коррекции образца дрейфа в г-направлении. В противном случае, отрегулируйте фокусировку вручную в течение приобретения, если изображение выходит из фокуса.
    7. Начало приобретение с нм лазера 405 выходной и 561 нм лазера на (~ 1 кВт / см 2) в случае достаточной активации уже происходит в (обычно, если уровни экспрессии высоки). В противном случае, включите нм лазера 405 на установке низкая завод питания (0,02 мВт или 0,01 Вт / см 2) и постепенно увеличивать (0,1 мВт на время), при необходимости до тех пор, пока несколько десятков молекул в кадре или так, чтобы одиночных молекул хорошо разделены.
    8. Как сбора данных продолжает, градпенно увеличить 405 нм мощность лазера, чтобы сохранить плотность пятна примерно постоянным.
      Примечание: при более низкой мощности возбуждения 405 нм, некоторые PAmCherry1 уже может быть активирован. Поскольку эти молекулы photobleach, население остальные фотоактивируемых молекул PAmCherry1 уменьшается, требуется более высокая поток фотонов для поддержания того же плотность молекул, испускающих флуоресценцию в каждом кадре.
    9. Продолжить захвата изображения до высокого нм власти 405 (2,5 - 10 Вт / см 2), не более активизировать события активации.
      Примечание: Общее время приобретение зависит от уровня экспрессии и эффективности дополнения.
  3. Обработки изображений
    Примечание: Есть много вариантов программного обеспечения с открытым исходным кодом для обработки изображений. Примерами являются гроза (https://code.google.com/p/thunder-storm/) и QuickPALM (https://code.google.com/р / quickpalm /). Типичные процедуры обработки данных кратко показано здесь, используя пользовательский пакет под названием Matlab wfiread для обработки данных PALM в качестве примера. Тем не менее, будущие изменения не могут точно следовать тому, что описано здесь. Для обработки изображений с другим программным обеспечением, пожалуйста, обратитесь к документации пользователя.
    1. Скачать программное обеспечение для обработки изображений (Справочная код файла) или последнюю версию на http://www.ohsu.edu/nan. Откройте Matlab и загрузить программное обеспечение wfiread (который уже положил в пути по умолчанию).
    2. Просмотр последовательности изображений в формате RAW и определить область интереса. Выберите область стека для обработки левой кнопкой мыши и перетащив рамку вокруг нужной области. Если область интереса не уменьшается во время приобретения (до примерно 256х256 пикселей), выберите меньшую площадь, чтобы уменьшить время вычислений на. Чтобы отменить область и обрабатывает весь кадр, щелкните правой кнопкой мыши в любом месте в гое изображение.
    3. Введите диапазон кадров, подлежащих обработке.
    4. Выберите золотую частицу (тот, который изолирован и форму в форме) по левой кнопкой мыши на изображении и перетащив небольшую коробку вокруг него. Под отслеживания частиц, нажмите кнопку Track. График будет казаться, что показывает положение выбранной частицы золота через стопку изображений, изображающие степень дрейфа.
    5. Повторите этот процесс, чтобы отслеживать, как много золотых частиц, как это возможно и определить те, которые отслеживают вместе (частицы будет цветом). В идеале общее смещение составляет порядка одного пиксела в большинстве.
    6. Индивидуально выбрать золотые частицы, которые отслеживаются вместе по одному и нажмите кнопку Добавить маркер в разделе Отслеживание частиц. Зеленый крест появится показывая, что он был добавлен в качестве маркера и будет использоваться для коррекции дрейфа.
    7. Отрегулируйте Sigma диапазон, сглаживание диапазон и порог по мере необходимости изменения значений незначительно. Нажмите Find частицуКнопка для проверки параметров. Частицы, которые будут обрабатываться будет коробку и те, которые не будут опущены. Молекулы PAmCherry1, частицы, которые являются относительно круглый и яркий, должен быть выбран.
    8. Начните обработки изображения, нажав на кнопку коорд сделать файл и сохраните файл.
      Примечание: Программа будет проходить через каждого кадра в пределах определенного диапазона кадров, найти все флуоресцентные пятна, а также выполнять установку Gaussian найти центр тяжести координат. .cor Файл будет создан хранить все координаты и другие подходящие параметры обрабатываемых одиночных изображений молекул.
  4. После обработки изображений и визуализации изображения PALM
    Примечание: Другие программы могут непосредственно оказывать изображение после координировать добычу.
    1. В Matlab, запустить пакет '' пальмовое и загрузите файл .cor только что создали.
    2. Перед рендеринга изображения PALM, используя координаты, сортировать отдельные координаты (каждый из «localizatiна мероприятия "). Оптимальные сортировки значения могут изменяться в зависимости от настройки и флуорофора.
      1. Для PAmCherry1, используйте следующие значения: Объединение Frame - 8; Сочетание Расстояние (нм) - 100; Минимальные RMS - 4; Минимальная Fit Боже - 0,25; и Макс. Эксцентриситет - 1.4. Смотрите раздел Обсуждение на дополнительных объяснений этих параметров.
    3. Нажмите кнопку сортировки для создания нового набора координат готовых для оказания изображения с высоким разрешением.
    4. Введите значения для правильного отображения конечного изображения, например, сырой размером пикселя (нм), желаемого размера элемента (нм) в конечном изображении, и размер пикселя на изображении.
      Примечание: Исходный размер пикселя должен быть определен для каждой установки. Отрендеренный размер функция может быть установлена ​​произвольно, но, как правило, устанавливается на значение немного выше, чем в среднем точности локализации. Для PAmCherry1, средняя точность локализации составляет около 18 нм, так что размер особенность 20 - 30 нм appropriaте. Следует отметить, что точность локализации была рассчитана, принимая стандартное отклонение локализации и той же молекуле в нескольких кадрах 22 и не путем деления дифракционный предел с квадратному корню из обнаруженного числа фотонов. Что касается размера пикселя выводимого изображения, 10 нм является хорошей отправной точкой; установка этого значения слишком низко приведет к неоправданно большие файлы изображений для unmagnified видом.
    5. Нажмите кнопку Render, чтобы создать PALM изображение. Используйте +/- увеличительные иконки на панели инструментов окна цифра увеличения и уменьшения масштаба.
    6. Дополнительно: Выполните кластерный анализ реконструированного PALM изображения, используя либо K тест Рипли или другие механизмы, такие как моделирование автоматизированного DBSCAN (SAD) 23. Примечание: В пользовательский пакет ладони, и Рипли К и САД анализ уже встроены; для координат, полученных от другого программного обеспечения, те же анализы могут быть выполнены с дополнительными пользовательскими скриптами.

3. одной молекулы Отслеживание в живых клетках

  1. Обработать поверхность тканевой культуры и пластины клеток, как описано в протокола 2. Поскольку температура и / или СО 2 контролируются стадии может требовать определенного культуральную чашку обеспечить уверенным, что покровного стекла имеет необходимой толщины (0,17 мм) для установки микроскопии.
    1. Трансфекции клеток, если делать временную экспрессию и выполнять любые процедуры, необходимые для эксперимента, таких как тетрациклин, чтобы индуцировать экспрессию, и инкубируют при необходимости. Это также же, как описано в протоколе 2.
    2. Место культуры блюдо на инкубаторе на сцене. Пусть блюдо урегулировать на сцене в течение нескольких минут, пока температура и концентрации СО 2 стабилизируется каждый раз после монтажа культуры блюдо или перемещение в новой области интереса. Блок лазеры на этом этапе. Если СО 2 управления не доступны, перейдите к СО 2 независимых СМИ прямо перед визуализации, таких как ЛейбовИТЗ в L-15.
      Примечание: Фенол-красно-бесплатно среда рекомендуется для удручающей фоновой флуоресценции.
  2. Получение изображений, как в Протоколе 2. Тем не менее, установить соответствующее время экспозиции (как правило, 25-50 мс для PAmCherry1).
    Примечание: Плотность молекула должна быть ниже, чем при фиксированных клеток таким образом, что траектории могут быть записаны без наложения друг с другом. Указанные несколько десятков молекул характерно для приобретения в 256x256 пикселей при размере пикселя около 160 нм. 561 нм плотность мощности лазера был установлен в 0,8 кВт / см 2, чтобы поддерживать хорошее соотношение сигнал-шум, уменьшая фототоксичность к клеткам и увеличение средней длины траектории.
  3. Обработки изображений.
    1. Выписка координаты единичных молекул с wfiread пакета, как описано в Протоколе 2, или с другим пакетом.
    2. Реконструировать траектории одной частицы, используя различные одну частицу слежения (SPT) пакеты на основе различных алгоритмов, найденныхв других местах 24. Примечание: В качестве альтернативы, этот шаг может быть достигнуто с помощью встроенного Matlab домой пакет (возможно, в будущих изменениях в http://www.ohsu.edu/nan.
    3. Дополнительно: После реконструкции, используйте пакет SPT 24 для расчета константы смещения и диффузии из траекторий. Кроме того, использовать вариационный Байеса одного-частицу слежения (vbSPT) 25 для определения диффузии состояния целевых белков. vbSPT Matlab пакет и документация могут быть найдены на официальном сайте Sourceforge: http://vbspt.sourceforge.net/.

Результаты

Пример BiFC пальма показан Крас G12D мутант взаимодействия с Ras связывания домена (RBD) из CRAF (рис 1а). Как обсуждалось, РН или RC фрагменты не были привязаны к С-концу Рас, потому что это нарушит локализации мембраны и, следовательно, биологической активности Ras. Это привело к снижению в?...

Обсуждение

BiFC был обычно используемая техника для обнаружения и визуализации ИЦП в клетках, в то время как PALM является недавний сингл сверхразрешение молекула техника микроскопии, который позволяет нано изображений неповрежденных биологических образцов. Сочетание BiFC с PALM достигается избирател...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

The authors thank Drs. Steven Chu and Joe W. Gray for helpful discussions, Henry Marr for his initial work on the BiFC-PALM project, and Alexis Shoemaker for her technical assistance. This work is supported by startup funds to X.N. from OHSU. Research in the Nan laboratory was also supported by NIH 5U54CA143836-05, the Damon Runyon Cancer Research Foundation, the M. J. Murdock Charitable Trust, and the FEI company.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Microscope frameNikonTi-U
60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NANikonCFI Apo TIRF 60x H
EMCCD cameraAndoriXon Ultra 897
561 nm laserOpto EngineMGL-FN-561
405 nm laserCoherentCUBE-405 50mW
561 nm dichroic mirrorSemrock Di01-R405/488/561/635-25x36
561 nm filterSemrockFF01-525/45-25
405/561 nm notch filterSemrockNF01-405/488/568-25
Temperature and CO2 controlled stageTokai HitINUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCSAddgene60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCSAddgene60546
pcDNA3.2-DESTLife Technologies12489-019
pLenti-DESTAddgenehttp://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseThermo ScientificF-531
In-Fusion HD CloningClontech639649
LR ClonaseLife Technologies11791
Vira Power Lentivirus PackagingLife TechnologiesK497500
X-tremeGENE Transfection ReagentRoche13873800
Lab-Tek II Chambered CoverglassThermo Scientific155409#1.5 glass bottom dishes
U2OS cellsATCCHTB-96
293T/17 cellsATCCCRL-11268
DMEM with phenol redLife Technologies11995
DMEM no phenol redLife Technologies21063
Fetal bovine serumLife Technologies10082
Leibovit's L-15, no phenol redLife Technologies21083-027
Reduced serum mediumLife Technologies31985
Phosphate Buffered SalineLife Technologies14040
SyringeBD Biosciences309604
Syringe filterMilliporeSLHV033RB
Lentiviral concentratorClontech631231
Retroviral concentratorClontech631455
10 cm culture dishBD Biosciences353003
6-well culture plateBD Biosciences353046
PolybreneSigma107689
PuromycinLife TechnologiesA11138
G-418Calbiochem345812Neomycin
DoxycylineFisherBP2653
Tris baseFisherBP152
EDTASigmaEDS
Sodium HydroxideSigmaS5881
ParaformaldehydeSigma158127
GlutaraldehydeSigmaG6257
PIPESSigmaP6757
HEPESSigmaH4034
EGTASigma3777
Magnesium SulfateSigmaM2643
Potassium HydroxideSigma221473
Sodium chlorideFisherBP358
Magnesium chlorideFisherM33
100 nm gold particlesBBI SolutionsEM.GC100
Molecular grade waterLife Technologies10977
Dpn1New England BiolabsR0176
PCR purification kitQiagen28104
Miniprep kitQiagen27104
Midiprep kitMacherey-Nagel740410
0.6 ml microcentrifuge tubesFisher05-408-120
1.5 ml microcentrifuge tubesFisher05-408-137
15 ml tubesFisher05-539-12
5 ml polypropylene round-bottom tubesBD Biosciences352063
14 ml polypropylene round-bottom tubesBD Biosciences352059
50 ml tubeBD Biosciences352070
PCR tubeGeneMateC-3328-1
SOC mediumLife Technologies15544
LB brothBD Biosciences244610
Kanamycin sulfateFisherBP906
Competent cellsLife TechnologiesC4040
MatlabMathworks

Ссылки

  1. Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
  2. Lasserre, R., et al. Raft nanodomains contribute to Akt/PKB plasma membrane recruitment and activation. Nat. Chem. Biol. 4 (9), 538-547 (2008).
  3. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol. Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
  4. Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
  5. Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53, 285-298 (2012).
  6. Lingwood, D., Simons, K. Lipid Rafts As a Membrane-Organizing Principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2009).
  7. Tian, T., Harding, A., Inder, K., Plowman, S., Parton, R. G., Hancock, J. F. Plasma membrane nanoswitches generate high-fidelity Ras signal transduction. Nat. Cell Biol. 9 (8), 905-914 (2007).
  8. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  9. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  10. Nickerson, A., Huang, T., Lin, L. J., Nan, X. Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM) for Nanoscale Imaging of Protein-Protein Interactions in Cells. PloS one. 9 (6), e100589 (2014).
  11. Manley, S., Gillette, J. M., Lippincott-Schwartz, J. Single-particle tracking photoactivated localization microscopy for mapping single-molecule dynamics. Methods Enzymol. 475, 109-120 (2010).
  12. Shyu, Y. J., Hu, C. D. Fluorescence complementation: an emerging tool for biological research. Trends Biotechnol. 26 (11), 622-630 (2008).
  13. Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
  14. Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
  15. Gomez-Martinez, M., Schmitz, D., Hergovich, A. Generation of stable human cell lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA expression. J. Vis. Exp. March. (73), e50171 (2013).
  16. Robida, A. M., Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation analysis of inducible protein interactions: effects of factors affecting protein folding on fluorescent protein fragment association. J. Mol. Biol. 394 (3), 391-409 (2009).
  17. Ding, Y., et al. Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange. Nat. Methods. 12 (3), (2015).
  18. Seidman, C. E., Struhl, K., Coligan, J. E. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr. Protoc. Protein Sci. Appendix 4, 4D (2001).
  19. Morrison, S. L., Coligan, J. E., et al. Preparing frozen bacterial stocks. Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3, Appendix 3M (2001).
  20. Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PloS One. 4 (8), e6529 (2009).
  21. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8 (91), (2008).
  22. Deschout, H., et al. Precisely and accurately localizing single emitters in fluorescence microscopy. Nat. Methods. 11 (3), 253-266 (2014).
  23. Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110 (46), 18519-18524 (2013).
  24. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat. Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
  25. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nat. Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  26. Liu, Z., et al. Super-resolution imaging and tracking of protein–protein interactions in sub-diffraction cellular space. Nat. Commun. 5, 1-8 (2014).
  27. Xia, P., et al. Super-resolution imaging reveals structural features of EB1 in microtubule plus-end tracking. Mol. Biol. Cell. 25 (25), 4166-4173 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

106PAmCherryvbSPT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены