이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM)

요약

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

초록

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

서문

단백질 - 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제)는 생물학 ¹ 기본적인 단단히 많은 시간과 길이 스케일에서 시공간 메커니즘을 통해 조절된다. 세포막 시그널링 세포에 관한 연구는 예를 들어, 특정 프로톤 펌프 억제제 및 세포 과정 ^(2)을 용이하게 동적 나노 스케일 공간 구획을 밝혀냈다. 따라서, 충분한 공간 및 시간 해상도, 높은 특이성 및 고감도 생물학적 시스템에서 프로톤 펌프 억제제를 검사 할 수있는 능력은 생물의 기계적 이해를 달성하기위한 키이다.

^{5 -} 이분자 형광 보완 (BiFC)는 세포 내 해상도와 라이브 셀 호환성 ³ 셀에 프로톤 펌프 억제제를 시각화에 대한 몇 가지 기존 도구 중 하나입니다. 이 기술은 비교적 간단하고 두 비 형광 조각으로 형광 단백질의 분리를 포함한다; 유전자 두 개의 상호 작용하는 단백질에 태그 때근접하게, 단편은 형광 신호를 산출 완전한 형광 단백질을 형성하도록 재구성 할 수있다. 적절하게 설계하면 BiFC 프로브 자발적 프로톤 펌프 억제제의 부재하에 재구성 안된다. 이와 같이, BiFC 분석에서의 형광 신호 만 높은 특이성 프로톤 펌프 억제제의 직접적인 시각화를 가능하게 프로톤 펌프 억제제의 존재하에 일어난다. 판독으로 형광을 사용하는 추가 혜택은 다른 사람의 사이에서 높은 처리량과 높은 콘텐츠 심사 분석, 높은 감도, 세포 내 해상도 및 호환성이다. 이러한 장점에 대해, 다른 상위 형광 단백질에 기초 BiFC 프로브의 수는 개발되었다. 통상적 인 광 현미경 검사에 기초하여 모든 다른 검출 기술에서와 같이, 그러나 BiFC의 공간 분해능은 빛의 회절에 의해 ~ 250 나노 미터로 제한된다. 이 지질 뗏목 ^(6)을하여 이전 언급과 예시 된 바와 같이, 나노 스케일에서 프로톤 펌프 억제제의 조절을 연구하기 위해 그것에게 도전한다ND 라스 나노 클러스터 ^(7)는 이러한 시그널링 많은 세포 과정을 이해하는데 중요한 길이 스케일이다.

BiFC는 프로톤 펌프 억제제 ⁽¹⁰⁾ 이미징을위한 공간 해상도에서이 한계를 극복하기 위해 광 활성화 현지화 현미경 (PALM) ^8,9과 결합되었다. 손바닥 확률 활성화 및 단일 형광 분자의 subdiffractive 현지화를 통해 형광 이미징의 회절 한계를 우회 최근 수퍼 해상력 현미경 기술이다. 각 사이클에서 활성화, 형광 분자는 몇천 광자 몇백을 방출하고 검출기상의 단일 분자 영상을 발생시킨다. 화상 회절 한정 동안 (~ 250 nm의 폭)은, 그 중심은 일반적으로 검출 된 광자의 수에 따라 10 ~ 50 nm 인 주문에, 훨씬 더 높은 정밀도로 측정 할 수있다. 활성화하고 샘플의 각 형광 분자를 로컬 화하여, 고해상도 화상이 재구성 될 수있다. Performe살아있는 세포에 D, 하나의 셀 ^(11)에서 단백질 확산 궤적 수천의 단일 분자 추적 (SMT를 구분) 종려 추가 허가 취득. 중요한 것은, 손바닥 확률 활성화를 달성하기 위해 이러한 광활성 형광 단백질 (PA-FPS)와 같은 특수 형광 프로브를 사용합니다. BiFC 및 PALM 이용 형광 단백질 양 때문에,이 아미노산 159과 160 사이의 두 단편으로, PALM PAmCherry1 위해, 일반적으로 사용되는 PA-FP를 분할하여 혼합 하였다.

스플릿 PAmCherry1에 기초 BiFC 시스템은 두 조각의 자발적인 재구성에서 낮은 배경 신호를 나타낸다. 상호 작용하는 단백질의 유전자 쌍 태그 때, 두 조각 (RN = 159은 잔기 RC = + 잔기 1백60부터 2백36까지 메트)에도 37 ℃ 낮은 온도에서 배양없이 완전한 PAmCherry1 단백질을 형성하도록 효율적으로 재구성 어느 이러한 부모 mCherry ^(13)와 같은 다른 BiFC 쌍 ^(12)의 경우에는 해당되지 않습니다. Furthermo다시 재구성 PAmCherry1 단백질은 정확한 단일 분자 현지화 및 고해상도 PALM 영상에 중요한 다른 사람 사이의 높은 명암비, 매체 광자 수율, 빠른 photoactivati​​on, 같은 부모 PAmCherry1의 광 물리 특성을 유지했다.

이 프로토콜에서, 스플릿 PAmCherry1 (도 1A)를 사용하여 U2OS 세포에서 라스 - 미친 상호 작용을 이미징 BiFC-PALM의 사용을 설명한다. 첫 번째 단계는 PAmCherry1 단편 (즉, RN과 RC) 및 관심 단백질 사이의 융합 단백질을 표현하기위한 구조를 설계하는 것이다. 이론적으로, 후보 단백질 (A 및 B)의 각 쌍에 대해, 융합 단백질 여덟 쌍 테스트 될있다 : RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; -RC / RN-B; 및-RC는 / B-RN. 이 프로세스는 종종 계정에 후보 단백질의 구조적 또는 생화학 적 특성을 고려함으로써 단순화 될 수있다. 라스의 경우, 상기 단백질은번역 후 C- 말단 CAAX 상자에서 수정 (C = Cys이고; = 지방족, X = 모든), 그 후 AAX 모티브 전원이 절단된다. 따라서, RN 또는 RC은 라스의 N 말단에 융합 될 수있다; 이 4 개의 (도 1b)에 대한 융합 단백질의 쌍의 수를 감소시킨다. Raf를 들어, 도메인은 라스 - 결합 (RBD를 잔기 51에서 1백31까지)가 사용되며, 양단에 태그 될 수있다. 이러한 네 융합 구성이 생성되었다 : RN-KRAS / RC-Raf를 RBD; RN-KRAS / Raf를 RBD-RC; RC-KRAS / RN-Raf를 RBD; 와 RC-KRAS / Raf를 RBD-RN.

또한, 단편 및 관심 단백질 사이의 링커는 고려 될 필요가있을 것이다. 약 10 아미노산 링커는 유연 종종 보완이 발생하기에 충분한 자유도를 제공로서 사용된다. 여러 복제 사이트 (MCS) ^(14)에서 생성 된 임의의 시퀀스를 포함하여 성공적으로 적용되어 많은 사람들이 있기는하지만 그 중 하나 링커, (GGGGS) X2입니다. 링커의 길이는 dependin 최적화 될 필요가있다관심의 단백질과 방향 상호 작용의 크기에 들어.

PAmCherry1 단편의 MCS의 측면에있는 작은 복제 백본에 포함되어 있습니다 (자료 목록 참조). 관심있는 유전자는 제한 부위로 결찰 또는 독립적 인 방식으로 삽입 될 수있다. 클로닝 및 서열 확인 후, 발현 카세트가 재조합 효소 반응, 높은 정확도 및 높은 효율로 복제 프로세스를 사용하여 발현 벡터로 전달된다.

이어서, 생성 된 작 제물은 발현 표적 세포주를 감염위한 안정된 세포주 원하면, 렌티 바이러스로 패키지, 표적 세포주로 형질 감염 또는된다. 과도 형질은 BiFC 구성의 빠른 확인이 가능하지만, 잠재적 인 문제는 주목해야합니다. 종종 화학 물질을 사용하는 형질 감염이 높은 형광도의 결과, 세포를 강조; 반면 전반사 형광 (TIRF) microsco 사용PY는 프로톤 펌프 억제제는 세포막에 일어날 때 조명 볼륨 TIRF 이상적 제한함으로써 이러한 배경 신호를 완화 할 수있다. 또한, 일시적인 형질은 종종까지 프로톤 펌프 억제제를 검출하는 아티팩트가 발생할 수 있습니다 내인성 단백질의 사람들을 초과, 단백질 발현의 높은 수준을 초래할. 따라서, 적절한 BiFC 구성은 초기 테스트를 통해 측정 한 후 안정한 세포주를 확립하는 것이 권장된다. 안정한 세포주는 독시사이클린 유도 ^(15)를 통해 조정 가능한 발현의 가능성을 가지고있다.

감염 후 세포는 일반적으로 퓨로 마이신과 각 구조에 대한 네오 마이신, 하나, 항생제로 선택됩니다. 샘플 준비, 이미지 수집 및 데이터 분석을위한 후속 단계는 프로토콜에 상세히 설명한다.

이 방법, 라스-Raf를 RBD의 BiFC-PALM 이미지에서 나노 클러스터의 형성이 정기적으로 관찰된다 (그림 2A </ STRONG>). 지속적으로, 라스-Raf를 RBD의 SMT-PALM 궤도는 확산 상태 (그림 2B-D)에서 이종 분포를 보여줍니다. 이러한 결과는 라스-Raf를 착체 잠재적 생물 함의 아마도 단량체 및 클러스터로서, 세포막의 여러 상태에 있는지 제안한다. 이 작업은 종래 BiFC 형광 공동 지역화 또는 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 얻는 것이 어려울 수 나노 미터의 공간 해상도와 단일 분자 감도를 가진 세포에서의 프로톤 펌프 억제제의 선택적 이미징 BiFC-PALM의 전력을 나타낸다.

BiFC 실험을 설계하고 결과를 해석 할 때, BiFC 프로세스가 분할 PAmCherry1을 포함하여 대부분의 경우에 돌이킬 명심하는 것이 중요하다. 두 조각이 결합하여 완전한 PAmCherry1 단백질, 두 조각 사이의 결합을 형성하고, 일단 따라서 PPI는 영구된다. 이것은 BiFC과 BiFC-PAL의 사용을 제한프로톤 펌프 억제제의 역학 (즉, 결합 반응 속도가 아니라이 형성되면 단백질 복합체의 확산 역학)를 모니터링하고 시간에 M 심지어 PPI 단지의 mislocalization가 발생할 수 있습니다.

BiFC-PALM 실험을 설계하는 형광 단백질에 내재되어 발색단 성숙의 지연 인 경우 추가 요인을 고려해야한다. 두 단백질이 상호 작용하고 FP 조각이 함께 모여되면, 그들은 일반적으로 초 (EYFP ³ 60 초 하프 타임)의 순서에 접힘. 그러나, 이후의 발색단의 성숙과 형광 신호 분 정도의 개발. 형광 분할 금성, 빨리 접는 YFP 변형의 재구성 후 10 분 이내에 검출 할 수 있지만, 일반적으로 성숙 하프 타임은 종종 약 60 분 ^(16)이다. 분할 PAmCherry1 비슷한 속도를 가지고 관찰 하였다. 따라서, BiFC과 BiFC-PALM 실시간 PPI 속도론을 모니터링 현재 가난한 선택할 수 있습니다; 다른 나FRET과 같은 최근 개발 된 이량 종속 형광 단백질 ¹⁷ thods 등이 목적에 더 적합 할 수있다.

프로토콜

1. 복제

1. 복제와 링커를 선택할 수있는 구성을 결정합니다. 그들의 적절한 현지화을 방해하지 않도록 N- 또는 C- 말단에 파편 태그 단백질은 아래에 설명 된대로. 이러한 (GGGGS) X2로 유연한 링커를 사용합니다.
2. 유전자 PAmCherry1 조각에 관심있는 단백질에 태그를. 하나의 옵션으로, MCS 시퀀스를 측면으로 조각 RN (PAmCherry1 잔류 1-159) 및 RC (메트로 플러스 PAmCherry1 잔류 물 160-236)를 포함하는 재료 목록에 나열된 복제 플라스미드를 사용합니다.
   1. 삽입 포인트에서 단편 RN 및 RC와 역 PCR (또는 제한 다이제스트)을 함유하는 플라스미드를 선형화. 역 PCR 프라이머는 표 1에 나와 있습니다. 아래는 저자의 실험실에서 사용되는 예 PCR 프로토콜 (이 프로토콜에서 사용되는 정확한 자료에 대한 자료 목록 참조).
      1. 물을 50 μL의 최종 부피로 자랐다 함께 PCR 반응 믹스 : 얇은 벽ED PCR 튜브, 물, 배 마스터 믹스 25 μL, 순방향 및 역방향 프라이머의 0.5 μL 각 (20 μm의 희석 주식, 0.2 μm의 최종 농도) 및 템플릿의 1 NG를 추가합니다. 다음 사이클링 조건을 사용하여 98 ° C를 30 초, 98 ° C의 30주기를 7 초, 2 분 68 ° C, 10 분 동안 72 ℃에서 최종 연장.
   2. PCR RN과 RC 조각을 포함하는 선형화 된 플라스미드에 삽입을위한 관심의 유전자. 68 ℃에서 연기 시간과 단계 1.2.1에서와 같이 PCR을 수행한다. 이러한 재결합에 대한 선형화 된 RN의 끝과 RC 플라스미드에 GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT에 대한 (GGGGS) X2, 15 염기쌍 동성으로 유연한 링커 서열을 포함 오버행과 프라이머를 사용합니다.
      참고 : 플라스미드 백본을 선형화 표 1의 프라이머를 사용하는 경우 관심의 단백질 프라이머 오버행은 표 2에 제시되어있다.
   3. PCR 다이제스트Dpn1와 반응은 PCR 템플릿을 제거합니다. PCR 반응의 50 μL에 Dpn1 0.5 μL (20 U / μL) 직접 추가합니다. 20 분 동안 80 ° C에서 1 시간 가열을 비활성화 37 ℃에서 배양한다. 배경 템플릿은 이후 단계에서 지속되면, 효소의 양을 증가 시키거나 소화 시간을 연장.
   4. 제조자에 의해 설명 된 바와 같이 스핀 컬럼을 통해 PCR 산물을 정제.
   5. 관심의 유전자와 RN 또는 RC 단편을 함유하는 플라스미드를 선형화 결합 결찰 독립적 반응을 수행한다. 정제 된 PCR 산물의 농도를 측정 : 선형화 된 플라스미드의 50 NG 및 효소 프리믹스 1 μL와 목적 유전자의 50 ng의 결합 및 탈 이온수로 5 μl의 총 부피를 가지고. 얼음에 15 분, 장소를 50 ℃에서 부화하고, TE 버퍼의 20 μl를 추가합니다.
   6. 유능한 박테리아 ^(18)에 재조합 플라스미드를 변환.
   7. O / N 문화에 대한 식민지 (필요에 따라) 2-4 +를 선택합니다. 5 mL를 추가LB 배지와 14 ml의 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브에 카나마이신 (50 ㎎ / ㎖ 주)의 5 μL 및 멸균 접종 루프를 선택한 박테리아 식민지를 추가 할의. 225 rpm으로 진탕하면서 37 ° CO / N에 품어.
   8. 글리세롤 스톡 ¹⁹ O / N의 배양액 1mL를 동결하고 제조업체에서 기술 된 바와 같이 나머지 미니 프렙.
   9. 좋은 복제를 결정하는 순서를 수행합니다. 자재 목록 클로닝 플라스미드를 이용하면, 융합 구조체의 완전한 시퀀스를 획득하기 위해 필요에 따라, 전방 및 M13을 사용 (별도 반응에서) 역방향 프라이머. - 이러한 생명 공학 정보를위한 국가 센터 (NCBI)에서 BLAST로 정렬 도구를 사용하여 예상되는 순서와 비교 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi .
   10. 재조합 효소 반응을 통해 발현 플라스미드의 순서 검증 된 구조를 전송합니다.
       1. 대상 플라스미드 & # 75 NG 추가8212; 50 효소 프리믹스 1 μL에 재조합 복제 플라스미드의 NG 탈 이온수 5 μL에 총 볼륨을 가지고 - 같은 pcDNA 벡터 등의 렌티 바이러스 포장 ⁽²⁰⁾ 과도 형질 또는 pLenti합니다. 그런 다음 TE 버퍼 5 μl를 추가로 1 시간 동안 25 ℃에서 배양한다.
          주 : 렌티 포장 안정적인 세포주 생성 용, 퓨로 마이신 내성 및 네오 마이신과 다른, 예를 들면, 각 구조에 대해 하나를, 다른 대상 플라스미드를 사용한다. 이 형질 세포의 이중 선택할 수 있습니다. 또한 조정 독시 싸이클린 조절 식 TETO 운영자와 구성 적 거대 세포 바이러스 (CMV) 높은 발현을위한 프로모터, 또는 CMV 등 각 프로모터를 고려한다.
       2. 권한있는 박테리아로 5 μl를 변환 및 단계 1.2.6에 1.2.8 에서처럼 플라스미드 미니 프렙하지만 적절한 항생제 (전형적 암피실린) 사용.
3. 최적의 결정BiFC 구성.
   1. 공동 트랜 발현 U2OS 세포에 플라스미드 (또는 선택 셀).
      1. 8 잘 # 1.5 유리 바닥 챔버 슬라이드의 각 웰에 10 % FBS와 보충 페놀 - 빨간 무료 항생제없는 DMEM의 350 μl를 추가합니다. 세포에 잘 당 플레이트 약 7.5 × 10 ⁴ 세포는 약 70 % -90 %의 합류 다음날입니다.
      2. 또한 바람직한 시약을 이용하여 각각의 구성이 서로 다른 도금 공동 트랜 발현 플라스미드 후 제조자 바와 같이 일.
         1. 각 웰, 0.6 ML 튜브 및 피펫에 무 혈청 감소 미디어의 50 μL로 각각의 발현 플라스미드 125 NG를 추가로 가입 및 믹스 다운합니다. 튜브의 중심 아래로 직접 미디어에 형질 전환 시약의 1 μl를 추가합니다. 혼합 반응이 30 분 동안 앉아 보자 부드럽게 저어.
         2. 약 절반에 의해 챔버 슬라이드의 각 웰에 미디어를 줄입니다. G 우물에 형질 전환 혼합물 적가를 추가하고 흔들고한다면 혼합합니다. 24 ~ 48 시간 동안 CO _2를 37 ° C에서 세포를 품어 5 %. 미디어를 형질 전환 한 후 하루를 변경합니다.
   2. 단계 2.1.4로 시작 프로토콜 2와 형광 현미경 이미지 셀.
      주 : 발현 수준이 높은 카메라가 PAmCherry1의 비교적 낮은 출력 광자 충분히 민감한 경우 시료 표준 형광 현미경에 이미징 될 수있다. 재구성 된 PAmCherry1 분자는 녹색 여자 (561 ㎚) 필터 세트와 이미징하기 전에 자외선 필터 세트 (405 ㎚)로 활성화 할 수 있습니다.
4. 적용 가능하다면, 상호 작용을 방해 관심의 단백질 중 하나에 점 돌연변이를 도입하는, 예를 들면, 음성 대조군을 생성한다. 단백질의 플라스미드에 클로닝 부위 특이 적 변이 도입 ⁽²¹⁾ 및 선택된 구성의 변이되도록 수행한다.
5. 바이러스로 구조를 포장하여 안정적인 세포주 생성입자 및 감염 U2OS 세포 (또는 선택의 세포주). 유도 (테트라 사이클린) 발현 시스템 ⁽¹⁵⁾ 그렇게 표현 BiFC의 연장 비가역성이 문제가, 또는 조정 가능한 표현이 필요한 경우 경우 이미징 이전에 유도 될 수를 고려한다.
   주의 : 바이러스 포장 시스템의 최근 세대 크게 복제 능이있는 바이러스의 제조 가능성을 감소 하였지만 바이러스 작업이 바이오 레벨 2로 분류되는 몇몇 위험은 여전히​​ 존재한다. 참고 문헌에서 찾을 수 있습니다 http://www.cdc.gov/biosafety/publications/.
   1. 렌티 또는 레트로 바이러스 대상 벡터 ^(20)를 사용하여 단계를 반복 1.2.10. 100 midiprep에 대한 mL 및 플라스미드의 큰 순도 O / N 문화를 높입니다.
   2. 1 일에 : 플레이트 각 구조에 대한 10cm 접시에 약 2 × 10 ⁶ 293T / 17 세포를 포장한다.
   3. 주 2 일 : TRA를 사용하여 형질 전환 반응을 준비선택 및 제조 업체에 의해 설명 된대로 nsfection 시약.
      1. 패키징 플라스미드 1 및 2에 대해 250 NG / μL의 최종 농도 플라스미드 패키징 프리믹스를 조제하고, 100 NG / 멸균 플라스미드 3 포장용 μL. 혼합 위아래로 5 ml의 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브와 피펫 10 포장 플라스미드 프리믹스의 μL 및 혈청 감소 미디어 1 ㎖에 대상 플라스미드의 2.5 μg의 추가. 튜브의 중심 아래로 직접 미디어로 형질 전환 시약의 20 μl를 추가합니다.
         1. 혼합하고 실온에서 30 분 동안 품어 부드럽게 저어. 세포에서 약 반 용지를 제거하고 적하 방식으로 형질 전환 혼합물을 추가합니다. 혼합 및 CO _2를 37 ° C에서 품어 5 % 부드럽게 흔들어. 온도와 CO ₂ 평형에 대해 풀어 모자와 튜브 판 당 미디어 10 ㎖를 품어.
      2. 3 일에 : 조심스럽게 미리 배양 된 매체를 사용하여 미디어를 변경하고 retur인큐베이터에 세포를 명. 느슨하게 캡 미디어의 또 다른 튜브를 품어.
         Syncytia을, 또는 대형 멀티 핵 세포의 형성, 포장이 잘되어 가고 있다는 신호가 될 수 있습니다. 그러나, 세포는 깨지기 쉬운 상태에 쉽게 분리 될 수있다. 미디어를 변경하는 경우,이 수평이되도록 피펫을 기울 판의 한쪽 가장자리에 미디어 적가를 추가합니다.
      3. 4 일째 : 주사기와 미디어를 분리하고 깨끗한 50 ㎖ 튜브에 0.45 ㎛의 공극 크기의 필터를 통해 여과하여 바이러스를 수확. 조심스럽게 미리 배양 된 매체와 매체를 교체합니다.
      4. 주 5 일 : 수확 단계를 다시 1.5.3.3 이전에 수행과 같은 50 ㎖ 튜브에 일반적인 여과 액을 결합있다. 각각의 튜브에 바이러스 집중 6 ML을 추가하고 혼합한다. 바이러스 침전 될 때까지 최소 24 시간 동안 4 ℃에서 보관.
         주 : 셀의 상태에 따라서, 바이러스는 세 번째를 수확 할 수있다.
      5. 1500 XG에서 원심 분리하여 바이러스를 집중4 ℃에서 15 분 동안. 뜨는을 기음과 미디어의 250 μL에 펠렛을 재현 탁. 바이러스 감염에 대한 즉시 사용 또는 최대 1 년까지 -80 ℃에서 분취 액 50 μL에 저장 될 수있다.
      6. 세포 그래서 플레이트 약 3 × ¹⁰⁵ U2OS (또는 목표)를 감염 (웰 당 10 % FBS를 가진 DMEM 2 ㎖) 6- 웰 플레이트에 웰 당 세포 감염시 대략 50 % 융합 성이다.
      7. 다음 날, 약 1 ml의 유지되도록 절반 용지를 제거합니다. 각 구조에 대한 집중 바이러스의 50 μL와 Coinfect. 각 웰에 폴리 브렌 1 μL (8 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. 37 ℃에서 인큐베이션하고, 5 % CO _2. 미디어 다음날을 변경하고 항생제 선택하기 전에 한 번 더 일 동안 품어.
         주 : 감염 원하는 속도에 따라 달라질 수있다 추가 바이러스의 양. 바이러스는 QRT-PCR을 이용하여 적정 수 있습니다.
      8. 감염된 세포에 대한 선택 항생제를 추가합니다. VI를 보지 못했다 감염되지 않은 세포와 별도의 우물카나리아는 선택의 효능을 테스트하기로 RUS가 필요합니다. 선택이 완료 2-7 일 동안, 또는까지 배양한다.
         참고 : 유효 농도가 초기에 적정해야하지만, 일반적으로 네오 마이신에 대한 퓨로 마이신 1.0 ㎎ / ㎖ 1.0 ㎍ / ㎖의입니다.
      9. 더 큰 10cm 접시에 세포를 확장하고 프로토콜 2를 진행합니다.

2. 이미지 고정 세포

1. 이미징을위한 샘플을 제조
   1. 적어도 1 시간 동안 1 M NaOH를 250 μl를 추가하여 8 잘 # 1.5 유리 바닥 챔버 슬라이드를 청소하고 PBS로 철저하게 씻는다.
      주 : 비 처리 챔버 슬라이드 전형적 높은 백그라운드 신호 발생. 또한, 세포가 잔류하고 NaOH로 세포 부착이 어려워 질 수있다 충분히 유리 표면을 청소하지 (10 배만큼의 세척 등)에 민감 할 수있다. 필요한 경우 세척 후 PBS O / N과 청소 챔버 슬라이드를 품어. 고밀도 도금 민감한 세포주를위한(예를 들어, 50 % -60 %의 초기 생장이) 도움이 될 수 있습니다.
   2. 플레이트 약 5.5 × 10 ⁴ 10 % FBS와 페놀 레드가없는 DMEM 잘 350 μL 당 U2OS 안정 발현 세포의 세포가 건강하지 이미징 때 합류 이상이되도록.
   3. 이러한 단백질의 발현을 유도하는 테트라 사이클린을 추가하는 등의 실험에 필요한 치료법을 수행.
   4. 바로 촬영하기 전에 세포를 수정.
      1. 이전에 고정으로, 신선한 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액을 제조 - 3.7 % PFA를 1X PHEM에서 0.1 % 글루 타르 알데하이드 (GA)로. 10 ml의 PFA 솔루션의 경우, PFA의 0.37 g의 무게 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 전송할 수 있습니다. 증류수 1 mL 및 1 M의 NaOH와 소용돌이의 30 μl를 추가합니다. 70 ℃에서 가열하고 와류는 PFA까지 매 1-2 분을 완전히 용해시킨다.
      2. 전송 15 ML 원뿔 튜브에 PFA를 용해 혼합 증류수 3.8 ml를, 5 ml의 2 배 PHEM 버퍼, 25 % 글루 타르 알데히드의 20 μL, 그리고 소용돌이를 추가합니다. 재고, 2 배 PHEM 버퍼 120 mM의 파이프, 10 M KOH 7.0로 조정 pH를 50 mM의 HEPES, 20 mM의 EGTA, 16 mM의 _황산,. 이는 고정 제 용액을 수일 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다.
         주의 : PFA와 GA는 모두 위험합니다. 흄 후드에서 솔루션을 준비하고 모두 화학 물질 취급시 적절한 보호 장비를 착용하십시오. 흡입 또는 직접 피부 접촉을 피하십시오.
      3. 성장 매체를 제거합니다. PBS 500 μL 신속하게 세척하고 PFA 정착액의 250 μL를 추가 당 잘. RT에서 20 분 동안 세포를 배양한다.
   5. 샘플에서 PFA 정착액을 제거하고 PBS 또는 영상 버퍼 아니라 당 (30 mM의 염화나트륨과 20 mm의 MgCl _2, pH가 8.5 100 mM 트리스)의 350 μl를 추가합니다.
   6. 소용돌이 100 nm의 금 입자는 집계를 분쇄 및 이미징 동안 무대 드리프트를 추적하기 위해 잘 당 35 μL (10 배 최종 희석)을 추가 할 수 있습니다.
2. 이미지 획득
   1. 현미경을 켭니다. 405 및 561 nm의 레이저의 전원을하지만, 셔터를 유지(내부 또는 외부)는이 시점에서 마감했다. EMCCD 카메라를 켜고 냉각 할 수 있습니다. 561 nm의 필터가 제자리에 있는지 확인.
   2. 수집 소프트웨어를 열고 100 밀리 초에 노출 시간과 300 (범위 1 - 1000)에 EMCCD 게인을 설정합니다.
   3. 목표에 침지 기름을 추가하고 현미경 단계에 샘플을 고정합니다.
   4. 밝은 필드 나에 561 nm의 레이저 중 하나와 함께 (~ 1 킬로와트 ^{/ ㎠),} 초점에 샘플을 가져.
   5. RAS 및 기타 막 단백질을 이미징, 1.49 개구 수의 고차 색지움 TIRF 60X 대물 렌즈를 사용하고 TIRF 구성으로 현미경을 가지고. 이 중심에서 벗어난 TIRF 목적의 배면 개구를 타격 할 때되도록 여기 레이저를 조정; 이는 레이저가 샘플에 도달시 편향시킨다. 임계각에 도달하고, 레이저가 반사되어 돌아 가기까지 레이저를 조정하는 것. 보기에서 여러 금 입자와 이미지 셀을 검색합니다. 관심 영역을 설정즉, 셀 (또는 셀 내의 영역)과 금 입자를 둘러싸.
      주 : TIRF은 여기 레이저의 침투 깊이를 감소시키고 포커스 배경 신호의 출력을 감소시킨다. 또한, 드리프트 보정 더 금 입자가보기에있을 때 더 정확하게 될 가능성이있다.
   6. 가능하면, Z 방향의 샘플 드리프트를 수정하기 위해 자동 초점 시스템을 결합. 이미지의 초점이 벗어나면 그렇지 않으면, 인수를 통해 수동으로 초점을 조정합니다.
   7. 405 nm의 레이저 오프 (~ 1 킬로와트 ^/ ㎠)의 경우 충분한 활성화에 이미 발생에 561 nm의 레이저로 수집을 시작 (발현 수준이 높은 일반적으로 경우). 그렇지 않으면, 프레임 당 분자 또는되도록 단일 분자 수십 거기까지 필요한 최저 공장 전력 설정에서 405 nm의 레이저를 켜 (0.02 mW의 0.01 W / ㎝ ²⁾ 및 (시간 0.1 MW) 점차 증가 잘 분리된다.
   8. 데이터 수집, 대학원을 계속단계적 거의 일정 스폿 밀도를 유지하기 위해 405 nm의 레이저 출력을 증가시킨다.
      주 : 하부 405 nm의 여기 파워에서 일부 PAmCherry1 이미 활성화 될 수있다. 이들 분자 photobleach 같이 광활성 PAmCherry1 분자의 나머지 인구는 각 프레임에서 형광을 방출하는 분자의 동일한 밀도를 유지하기 위해 더 높은 광자 플럭스 요구, 감소한다.
   9. 더 활성화 이벤트를 활성화하지 않습니다 - (10 W ^/ ㎠ 2.5) 높은 405 nm의 전력까지 이미지 수집을 계속합니다.
      주 : 총 획득 시간은 상보성의 발현 수준과 효율에 의존한다.
3. 이미지를 처리
   참고 : 이미지 처리를위한 많은 오픈 소스 소프트웨어 옵션이 있습니다. 예를 들면 뇌우 (이다 https://code.google.com/p/thunder-storm/ ) 및 QuickPALM ( https://code.google.com/P / quickpalm /). 일반적인 데이터 처리 순서는 간단히 예를 들어 PALM 데이터를 처리 wfiread라고 정의 매트랩 패키지를 사용하여 여기에 도시되어있다. 그러나, 미래의 개정 정확히 여기에 설명 팔로우하지 않을 수 있습니다. 다른 소프트웨어와 이미지 처리의 경우, 사용 설명서를 참조하십시오.
   1. 화상 처리 소프트웨어 (기업 코드 파일) 또는 최신 버전의 다운로드 를 http://www.ohsu.edu/nan . (이미 기본 경로에 넣어) wfiread 소프트웨어를 matlab에를 열고로드합니다.
   2. 원시 이미지 시퀀스를보고 관심 영역을 결정합니다. 스택의 지역을 선택 왼쪽을 클릭하고 원하는 영역 주위에 상자를 드래그하여 처리 할 수​​ 있습니다. 관심 영역 (약 256 × 256 픽셀) 취득시에 감소되지 않은 경우, 연산 시간을 줄이기 위해 작은 영역을 선택한다. 지역 선택을 해제하고 전체 프레임을 처리하기 위해, 바로 일의 아무 곳이나 클릭전자 이미지입니다.
   3. 프레임의 범위를 입력합니다 처리합니다.
   4. 금 입자 (격리 하나와 모양이 균일) 이미지에 왼쪽 버튼으로 클릭하고 주위에 작은 상자를 드래그를 선택합니다. 입자 추적에서 트랙 버튼을 클릭합니다. 그래프는 드리프트의 범위를 묘사하는, 즉 화상의 스택에 걸쳐 선택된 금 입자의 위치를​​ 도시 나타난다.
   5. 가능한 많은 금 입자를 추적하고 추적하는 것과 함께 성을 결정하는 과정을 반복 (입자는 색상이 코딩 된 것이다). 이상적으로는 전체 드리프트는 많아야 하나의 픽셀 정도이다.
   6. 개별적으로 한 번에 함께 하나를 추적 금 입자를 선택하고 입자 추적에서 추가 마커 버튼을 클릭합니다. 녹십자는 마커로서 첨가되었으며 드리프트를 수정하기 위해 사용되는 것을 나타내는 표시됩니다.
   7. 약간 값을 변경하여 필요에 따라 시그마 범위, 스무딩 범위 및 임계 값을 조정합니다. 찾기 입자를 클릭버튼을 눌러 설정을 테스트합니다. 처리됩니다 입자 박스되며되지 않은 사람들은 생략 할 것이다. PAmCherry1 분자, 상대적으로 둥글고 밝은 입자는 선택해야합니다.
   8. 만들기 좌표 운전 파일 버튼을 클릭하여 이미지 처리를 시작하고 파일을 저장합니다.
      참고 :이 프로그램은 모든 형광 반점을 발견, 정의 된 프레임 범위 내에서 각각의 프레임을 통해 이동하여 중심 좌표를 찾기 위해 가우스 피팅을 수행합니다. .cor 파일이 처리 된 단일 분자 이미지의 모든 좌표와 다른 피팅 파라미터를 저장 생성됩니다.
4. 포스트 프로세스 이미지와는 손바닥 이미지를 렌더링
   참고 : 다른 소프트웨어는 직접 이미지 후 추출 좌표 렌더링 할 수 있습니다.
   1. 매트랩, '손바닥'패키지를 실행하고 방금 만든 .cor 파일을로드합니다.
   2. 좌표를 사용하여 손바닥의 이미지를 렌더링하기 전에, 'localizati에서 각각의 좌표 (각각 분류) '이벤트에. 최적의 정렬 값은 설정 및 형광에 따라 달라질 수 있습니다.
      1. PAmCherry1를 들어, 다음과 같은 값 사용 결합 프레임 - 8; 결합 거리 (㎚) - (100); 최소 RMS - 4; 최소 맞춤 미덕 - 0.25; 맥스. 편심 - 1.4. 이러한 매개 변수의 추가 설명에 대한 토론 섹션을 참조하십시오.
   3. 고해상도 이미지를 렌더링 준비 좌표의 새로운 세트를 생성하기 위해 정렬 버튼을 클릭합니다.
   4. 이러한 원시 화소 사이즈 (㎚), 렌더링 된 이미지에서 원하는 피처 크기 (㎚), 및 렌더링 된 이미지에 대한 픽셀 크기로 최종 이미지의 렌더링 적절한 값을 입력한다.
      주 : 원시 화소의 크기가 각각 설정에 결정되어야한다. 렌더링 피처 크기는 임의로 설정할 수 있지만, 일반적으로 평균 파악 정밀도보다 약간 높은 값으로 설정된다. PAmCherry1를 들어, 평균 위치 파악 정확성은 약 18 나노 미터이므로, (20)의 피쳐 사이즈 -는 30 나노 미터이다 appropria테. 참고로, 위치 파악의 정밀도가 광자의 검출 수의 제곱근과 회절 한계를 분할하여 다수의 프레임에 걸쳐 ⁽²²⁾ 및하지를 동일 분자의 지역화의 표준 편차를 고려하여 계산되었다. 렌더링 된 이미지의 픽셀 크기에 관해서는, 10 nm의 좋은 출발점이고; 이 값을 너무 낮게 설정하면 unmagnified 뷰 불필요하게 큰 이미지 파일을 발생합니다.
   5. 손바닥 이미지를 생성하는 렌더링 버튼을 클릭합니다. 확대 및 축소하기 위해 그림 창의 도구 모음에서 +/- 확대 아이콘을 사용합니다.
   6. 옵션 : 리플리의 K 테스트 또는 시뮬레이션의 도움 DBSCAN (SAD) ^(23)와 같은 다른 메커니즘을 사용하여 재구성 PALM 이미지의 수행 클러스터 분석. 참고 : 사용자 정의 손바닥 패키지에서, 리플리의 K와 SAD 분석 모두가 이미 내장되어 있습니다; 다른 소프트웨어에서 생성 된 좌표를 위해, 동일한 분석이 추가로 정의 스크립트로 수행 될 수있다.

라이브 세포 3. 단일 분자 추적

1. 조직 배양 표면을 처리하고, 소정의 배양 접시가 필요 커브 글라스가 현미경 설정을위한 적절한 두께 (0.17 mm)를 가지고 있는지 확인 수도의 온도 및 / 또는 CO ₂ 제어 단계 이후 프로토콜 (2)에 기재된 바와 같이 세포를 접시.
   1. 일시적 발현을 구성함으로써 세포를 형질 감염 및 발현을 유도하는 등의 테트라 사이클린과 같은 실험에 필요한 치료를 수행하고, 필요에 따라 부화. 프로토콜 2에 기재 한 바와 같이도 동일하다.
   2. 무대 인큐베이터에서 배양 접시를 놓습니다. 요리 배양 접시를 설치 또는 관심의 새로운 영역으로 이동 한 후 모든 시간을 안정화 온도와 _{이산화탄소} 농도가 될 때까지 몇 분 동안 무대에 정착하자. 이 단계에서 차단 레이저. _{이산화탄소} 제어를 사용할 수없는 경우, 같은 Leibov 같은 권리 이미징 전에 CO ₂ 독립적 인 미디어로 변경ITZ의 L-15.
      주 : 페놀 레드 무료 매체가 우울한 배경 형광을 권장합니다.
2. 프로토콜 2와 이미지를 수집 그러나, 적절한 노출 시간 (PAmCherry1에 대한 일반적으로 25-50 밀리 초)을 설정합니다.
   참고 : 궤도가 서로 중첩되지 않게 기록 될 수 있도록 분자 밀도가 고정 세포보다 낮아야한다. 분자의 지정된 수십 약 160 nm의 화소 크기 256 × 256 화소의 획득을위한 전형적이다. 561 nm의 레이저 파워 밀도는 세포 광독성을 감소시키고 평균 궤도 길이를 증가시키면서 양호한 신호 대 잡음 비율을 유지하기 위해 0.8의 kW / cm ^2로 하였다.
3. 이미지를 처리​​합니다.
   1. 프로토콜 2, 또는 다른 패키지에 설명 된대로 wfiread 패키지 단일 분자의 좌표를 추출합니다.
   2. 발견 다른 알고리즘을 기반으로 (SPT) 패키지를 추적 다양한 단일 입자를 사용하여 단일 입자의 궤적을 재구성다른 곳에서 ^(24). 참고 : 또한,이 단계에서 미래의 개정에 가능하게 사용할 수 집 내장 매트랩 패키지를 (사용하여 수행 할 수있다 http://www.ohsu.edu/nan.
   3. 옵션 : 재건 후, 궤도에서 변위 및 확산 상수를 계산하는 SPT 패키지 ^(24)를 사용합니다. 부가 적으로, 표적 단백질의 확산 상태를 결정하는 추적 변분 Bayes의 단일 입자 (vbSPT) ^(25)를 사용한다. : vbSPT 매트랩 패키지와 설명서는 공식 소스 포지 사이트에서 찾을 수 있습니다 http://vbspt.sourceforge.net/.

결과

표시된 BiFC-PALM 예제 CRaf의 도메인 (RBD) (그림 1A)를 결합 라스와 상호 작용 KRAS G12D 돌연변이입니다. 논의 된 바와 같이 그것의 라스 막 지역화 때문에 생물학적 활성을 방해 할 것이기 때문에, RN 또는 RC 라스 단편의 C- 말단에 태그되지 않았다. 이 네 가지 (그림 1B)에 여덟에서 가능한 조합을 감소시켰다. 이러한 네 개의 조합들 각각은 렌티 바이러스를 사용하여 감염 U2OS 세?...

토론

PALM 그대로 생체 시료의 나노 이미징을 가능하게하는 최근 단일 분자 수퍼 해상도 현미경 기법 동안 BiFC는 검출 셀에서 프로톤 펌프 억제제를 시각화 기술에 일반적으로 사용되어왔다. 손바닥 BiFC의 조합은 나노 미터 공간 해상도와 단일 분자 감도 세포 내에서 프로톤 펌프 억제제의 선택 영상을 달성했다. BiFC-PALM은 두 가지 기술의 유틸리티를 확장하고,이 연구에서 입증 된 바와 같이, 그 나라의 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope frame	Nikon	Ti-U
60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA	Nikon	CFI Apo TIRF 60x H
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 897
561 nm laser	Opto Engine	MGL-FN-561
405 nm laser	Coherent	CUBE-405 50mW
561 nm dichroic mirror	Semrock	Di01-R405/488/561/635-25x36
561 nm filter	Semrock	FF01-525/45-25
405/561 nm notch filter	Semrock	NF01-405/488/568-25
Temperature and CO2 controlled stage	Tokai Hit	INUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS	Addgene	60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS	Addgene	60546
pcDNA3.2-DEST	Life Technologies	12489-019
pLenti-DEST	Addgene		http://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-531
In-Fusion HD Cloning	Clontech	639649
LR Clonase	Life Technologies	11791
Vira Power Lentivirus Packaging	Life Technologies	K497500
X-tremeGENE Transfection Reagent	Roche	13873800
Lab-Tek II Chambered Coverglass	Thermo Scientific	155409	#1.5 glass bottom dishes
U2OS cells	ATCC	HTB-96
293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
DMEM with phenol red	Life Technologies	11995
DMEM no phenol red	Life Technologies	21063
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082
Leibovit's L-15, no phenol red	Life Technologies	21083-027
Reduced serum medium	Life Technologies	31985
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	14040
Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe filter	Millipore	SLHV033RB
Lentiviral concentrator	Clontech	631231
Retroviral concentrator	Clontech	631455
10 cm culture dish	BD Biosciences	353003
6-well culture plate	BD Biosciences	353046
Polybrene	Sigma	107689
Puromycin	Life Technologies	A11138
G-418	Calbiochem	345812	Neomycin
Doxycyline	Fisher	BP2653
Tris base	Fisher	BP152
EDTA	Sigma	EDS
Sodium Hydroxide	Sigma	S5881
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Glutaraldehyde	Sigma	G6257
PIPES	Sigma	P6757
HEPES	Sigma	H4034
EGTA	Sigma	3777
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643
Potassium Hydroxide	Sigma	221473
Sodium chloride	Fisher	BP358
Magnesium chloride	Fisher	M33
100 nm gold particles	BBI Solutions	EM.GC100
Molecular grade water	Life Technologies	10977
Dpn1	New England Biolabs	R0176
PCR purification kit	Qiagen	28104
Miniprep kit	Qiagen	27104
Midiprep kit	Macherey-Nagel	740410
0.6 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-120
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-137
15 ml tubes	Fisher	05-539-12
5 ml polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352063
14 ml polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352059
50 ml tube	BD Biosciences	352070
PCR tube	GeneMate	C-3328-1
SOC medium	Life Technologies	15544
LB broth	BD Biosciences	244610
Kanamycin sulfate	Fisher	BP906
Competent cells	Life Technologies	C4040
Matlab	Mathworks