Bimoleküler Floresan tamamlama ile fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (BiFC-PALM)

Özet

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Özet

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Giriş

Protein-protein etkileşimleri (PPİ) biyoloji ¹ için temel olan ve sıkı birçok zaman ve uzunluk ölçeklerinde genelinde zamanmekansal mekanizmalar üzerinden düzenlenir. Hücre zarı üzerinde hücre sinyal ile ilgili çalışmalar, örneğin, belirli bir PPIs ve hücresel süreçlerin ² kolaylaştıran dinamik nano ölçekli mekansal bölmeleri göstermektedir. Bu nedenle, yeterli mekansal ve zamansal çözünürlükte, yüksek özgüllük ve yüksek hassasiyet ile biyolojik sistemlerde PPIs prob yeteneği biyoloji mekanistik anlayış ulaşmanın anahtarıdır.

^{5 -} Bimoleküler floresan tamamlama (BiFC) hücre içi çözünürlük ve canlı hücre uyumluluğu ³ bir hücreye PPIs görselleştirmek için birkaç mevcut araçlardan biridir. Tekniği oldukça basit ve iki floresan olmayan parçalara bir floresan proteininin yarma içerir; genetik iki etkileşen proteinlere etiketlendi zaman veyakınına getirildiğinde, fragmanları, flüoresan sinyali verecek şekilde tam bir floresan protein oluşturmak üzere sulandırmak olabilir. Doğru tasarlandığında, BiFC probları kendiliğinden PPİ yokluğunda sulandırmak gerekir. Bunun gibi, bir BiFC tahlilinde floresan sinyali sadece yüksek özgüllük ile PPİ doğrudan görüntülenmesine olanak tanıyan PPİ varlığında ortaya çıkacaktır. Okuma olarak floresan kullanmanın ek yararlar diğerleri arasında yüksek verimlilik ve yüksek içerik tarama deneyleri, yüksek hassasiyet, subsellüler çözünürlük ve uyumluluk. Bu faydalar, farklı üst floresan proteinleri göre BiFC probları bir dizi geliştirilmiştir. Geleneksel ışık mikroskopisi göre tüm diğer algılama teknikleri gibi, ancak, BiFC uzaysal çözünürlüğü ışık difraksiyonu ile ~ 250 nm ile sınırlıdır. Bu lipit sallar ⁶ a göre daha önce değindiğim ve örneklendiği gibi, nano, at PPİ düzenlenmesini incelemek için bunu bir meydan okuma yaparnd Ras nanokümeler ^7, örneğin sinyalizasyon gibi birçok hücresel süreçleri anlamak için kritik bir uzunluk ölçektir.

BiFC PPIs ¹⁰ görüntülenmesi için mekansal çözünürlükte bu sınırı aşmak için fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) ^8,9 ile kombine edilmiştir. PALM stokastik aktivasyonu ve tek flüoresan moleküllerinin subdiffractive lokalizasyonu ile floresan görüntüleme kırınım sınırı atlatır son superresolution mikroskopi tekniğidir. Her bir aktivasyon çevriminde, bir flüoresan molekül birkaç bin fotonlara birkaç yüz verir ve dedektör üzerinde tek bir molekülün bir görüntüye yol açmaktadır. Görüntü kırınım sınırlı olsa da (~ genişliği 250 nm) olarak, ağırlık merkezi, tipik olarak tespit edilen fotonların sayısına bağlı olarak 10-50 nm mertebesinde, daha yüksek hassasiyet ile tespit edilebilir. Aktive ve numunedeki her floresan molekülü lokalize ederek, yüksek çözünürlüklü bir görüntü yeniden inşa edilebilir. Performecanlı hücreler üzerinde d tek bir hücreden ¹¹ protein difüzyon yörüngeleri binlerce tek bir molekül izleme (smt-) PALM ileri izin edinimi. Önemlisi, PALM stokastik aktivasyonunu elde etmek için bu tür ışıkla aktive floresan proteinleri (PA-FP) gibi özel flüoresan millerini kullanır. BiFC ve PALM kullanım floresan proteinleri hem beri onlar amino asitler 159 ve 160 arasında iki parça halinde, PALM için PAmCherry1, yaygın olarak kullanılan bir PA-FP bölerek kombine edilmiştir.

Bölünmüş PAmCherry1 dayalı BiFC sistemi iki parçalarının kendiliğinden sulandırıldıktan düşük arka plan sinyalini gösterir. Genetik olarak etkileşen proteinlerin bir çift etiketli, iki fragman (RN = 1-159 kalıntıları RC = Met + kalıntıları 160-236) da 37 ° C 'de ve daha düşük sıcaklıklarda kuluçkaya olmadan PAmCherry1 proteinleri oluşturmak için etkin bir şekilde yeniden, burada Böyle ebeveyn mCherry ¹³ gibi diğer BiFC çiftleri ¹² için durum böyle değil. Furthermoyeniden yeniden PAmCherry1 proteini gibi doğru tek bir molekül lokalizasyonu ve yüksek çözünürlüklü PALM görüntüleme için kritik olan diğerleri arasında yüksek kontrast oranı, orta foton verimi ve hızlı fotoaktivasyon gibi ana PAmCherry1 ait Fotofiziksel özelliklerini korudu.

Bu protokolde, split PAmCherry1 (Şekil 1A) kullanarak U2OS hücrelerinde Ras-Raf etkileşimlerini görüntüleme için BiFC PALM kullanılması tarif edilmektedir. İlk adım PAmCherry1 fragmanları (örneğin, RN ve Re) ve ilgili proteinler arasındaki füzyon proteinleri ifade etmek için yapıları tasarlamaktır. Teorik olarak, aday protein (A ve B) her çifti için, füzyon proteinlerinin sekiz çifti, test edilecek vardır: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; ve A-RC / B-RN. Bu süreç genellikle dikkate aday proteinlerin yapısal veya biyokimyasal özellikleri alarak basitleştirilmiş olabilir. Ras'ın bir durumda, proteintranslasyon sonrası C-terminal CAAX kutusunun modifiye (C = Cys; A = alifatik, X = herhangi bir), ve bundan sonra AAX motifi kesilir. Bu nedenle, RN RC yalnızca Ras'ın N-terminine kaynaşmış olabilir; Bu dört (Şekil 1B), füzyon proteini çiftlerinin sayısını azaltır. Raf için domain Ras bağlayıcı (RBD; artıkları 51-131) kullanılır ve her iki uçta etiketlenmiş olabilir. Bu dört füzyon konfigürasyonları elde edilmiştir: RN-Kras / RC-Raf RBD; RN-Kras / Raf RBD-RC; RC-Kras / RN-Raf RBD; ve RC-KRAS / Raf RBD-RN.

Buna ek olarak, fragmanlar ve ilgi proteinleri arasındaki bağlayıcı olarak kabul edilmesi gerekir. Yaklaşık on amino asit esnek bir bağlayıcı genellikle tamamlama oluşması için yeterli özgürlüğü sağlar olarak kullanılır. Çoklu bir klonlama bölgesinin (MCS) ¹⁴ elde edilen rasgele diziler dahil olmak üzere, başarılı bir şekilde uygulanmıştır diğerleri, olmasına rağmen böyle bir bağlayıcı (GGGGS) x2. Bağlayıcıların uzunluğu dependin optimize edilmesi gerekebilirilgi proteinlerin ve yönelimleri etkileşim boyutuna g.

PAmCherry1 fragmanları MCSS yan küçük bir klonlama omurgası içerdiği (Malzeme listesi). Söz konusu genler sınırlama siteleri yoluyla, ya da bir ligasyon bağımsız yöntemi ile yerleştirilebilir. Klonlama ve Sekans doğrulama sonrasında, ekspresyon kaseti, bir yeniden bağlayıcı reaksiyonlar, yüksek aslına uygunluk ve yüksek verimlilik ile bir klonlama işlemi kullanılarak bir ekspresyon vektörüne transfer edilir.

Daha sonra, elde edilen sentezleme konstruktları hedef hücre hattı enfekte etmek için sabit bir hücre serisi isteniyorsa, lentivirüs içine paketlenmiş, hedef hücre hattına transfekte veya edilir. Geçici transfeksiyon BiFC yapılandırmasının hızlı doğrulama için sağlar, ancak potansiyel problemler dikkat edilmelidir. Genellikle kimyasallar kullanarak Transfeksiyon yüksek otofloresans sonuçlanan hücreleri vurgular; ise toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobik kullanımıpy PPİ hücre zarındaki yer alırken aydınlatma hacmi, TIRF idealini sınırlayarak bu arka plan sinyalini azaltmak olabilir. Buna ek olarak, geçici nakiller genellikle çok PPIs saptanmasında eserler neden endojen proteinlerin aşan, protein ekspresyonunun yüksek seviyeleri yol açar. Bu nedenle, uygun bir BiFC yapılandırması ilk test ile belirlenmiştir sonra kararlı hücre soyları kurulmuştur önerilir. Stabil hücre hatları da doksisiklin indüksiyonu ¹⁵ vasıtasıyla ayarlanabilir ekspresyon için potansiyele sahiptir.

Enfeksiyondan sonra, hücreler tipik haliyle puromisin ve her bir yapı için neomisin, bir antibiyotik kullanılarak seçilir. Numune hazırlama, görüntü elde etme ve veri analizi için bir sonraki adım protokoller detaylı olarak tarif edilecektir.

Bu yaklaşımla, Ras-Raf RBD BiFC PALM görüntülerde nano kümelerin oluşumu rutin görülmektedir (Şekil 2A </ strong>). Sürekli, Ras-Raf RBD smt-PALM yörüngeleri difüzyon devletler (Şekil 2B-D) heterojen bir dağılım gösterir. Bu sonuçlar, Ras-Raf kompleksleri potansiyel biyolojik etkileri olan, muhtemelen monomerlerin ve kümeleri gibi, hücre zarı üzerinde birden fazla eyalette mevcut olduğunu göstermektedir. Bu çalışma, geleneksel BiFC, floresan co-lokalizasyon veya floresan rezonans enerji transferi (FRET) ile elde etmek zor olurdu nanometre uzamsal çözünürlük ve tek bir molekülün duyarlılık, hücrelerin içinde PPİ seçici görüntülenmesinde BiFC PALM gücünü gösteriyor.

BiFC deneyler tasarlama ve sonuçları yorumlama, bu BiFC süreci bölünmüş PAmCherry1 dahil çoğu durumda, geri dönüşümsüz akılda tutmak önemlidir. Iki parça bir araya ve tam bir PAmCherry1 protein, iki parça arasındaki bağlantı oluşturabilir ve sonra bu şekilde PPI kalıcı olur. Bu BiFC ve BiFC-PAL kullanımını sınırlamaktadırPPI dinamiklerini (örneğin, bağlayıcı bir kinetik olup oluşturulduğu bir kez protein kompleksinin difüzyon dinamikleri) izlenmesi için ve zaman zaman M da PPI komplekslerinin mislocalization yol açabilir.

BiFC PALM deney tasarlama floresan proteinleri doğasında vardır kromofor olgunlaşmasında gecikme olduğunda ek bir faktör dikkate. İki protein etkileşim ve FP fragmanları bir araya gelip, onlar genellikle saniye (EYFP ³ 60 saniyelik yarı zamanlı) mertebesinde yeniden katlayın. Ancak, sonraki kromofor olgunlaşma ve flüoresan sinyal dakika mertebesinde gelişir. Floresan bölünmüş Venüs, hızlı bir katlama YFP varyant sulandırılmasından sonra 10 dakika içinde tespit edilebilir iken, genel olarak olgunlaşması için yarı-zamanı genellikle yaklaşık 60 dakika ^16. Split-PAmCherry1 benzer fiyat bilgisi gözlendi. Dolayısıyla, BiFC ve BiFC PALM gerçek zamanlı ÜFE kinetiği izlemek için şu anda kötü seçimlerdir; Diğer meörneğin FRET ve yeni geliştirilmiş bir dimerizasyon bağlı floresan proteini ¹⁷ gibi thods, bu amaç için daha uygun olabilir.

Protokol

1. Klonlama

1. Klonlamak ve bir bağlayıcı seçmek için yapılandırmaları belirleyin. Onların uygun lokalizasyonu bozmayacak böylece N- veya C-terminali üzerindeki parçaları ile Etiket proteinleri, aşağıda anlatıldığı gibi. Böyle (GGGGS) x2 olarak esnek bir bağlayıcı kullanın.
2. Genetiği PAmCherry1 fragmanları ilgi proteinleri etiketleyin. Tek seçenek olarak, MCS dizileri komşu olan parçaları RN (PAmCherry1 kalıntıları 1-159) ve RC (Met artı PAmCherry1 kalıntıları 160-236) içeren malzemeler Listesi'nde yer klonlama plasmidlerini kullanın.
   1. Insersiyon noktasındaki fragmanları RN ve Re, ters PCR (ya da restriksiyon sindirimi) ihtiva eden plasmidler linearize. Ters PCR primerleri Tablo 1'de verilmiştir. Aşağıda yazarın laboratuarda kullanılan bir örnek PCR protokolü (Bu protokolde kullanılan kesin malzemeler için Malzeme Listesi bakınız).
      1. Su ile 50 ul'lik nihai bir hacme kadar getirildi birlikte PCR reaksiyonu, karıştırın ince duvaraed PCR tüpü, su, 2x ana karışımı 25 ul, düz ve ters primerlerin her biri 0.5 ul (20 uM seyreltilmiş stok, 0.2 uM nihai konsantrasyon) ve şablon olarak 1 ng ila ekleyin. Aşağıdaki döngü koşullarında, kullanın: 98 ° C, 30 sn için, 98 ° C'lik 30 döngü 7 saniye ve 2 dakika süreyle 68 ° C'de ve 10 dakika süreyle 72 ° C'de son uzatma.
   2. PCR RN ve Re fragmanlarını ihtiva eden doğrusallaştırılmış plazmid sokulması için ilgili genler. 68 ° C de uzatma süresi aşama 1.2.1 gibi PCR gerçekleştirin. Böyle rekombinasyon için doğrusallaştırılmış RN uçları ve RC plazmidler için GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT için (GGGGS) x2 ve 15 baz çifti homoloji gibi esnek bir bağlayıcı dizisi içeren çıkıntılar ile primerler kullanın.
      Not: Plazmid omurgası linearize Tablo 1 'de primerler kullanılarak halinde ilgi konusu olan proteinlerin astar çıkıntılar Tablo 2'de sunulmaktadır.
   3. PCR DigestDpn1 tepkime PCR şablonu ortadan kaldırmak için. PCR reaksiyonunun 50 ul Dpn1 0.5 ul (20 U / ul), doğrudan ekleme. 20 dakika boyunca 80 ° C de 1 saat karıştırıldı ve bir ısı durgunluk, 37 ° C'de inkübe edilir. Arka plan şablonu sonraki adımlarda devam ederse, enzim miktarını artırmak veya sindirim süresini uzatır.
   4. Üretici tarafından tarif edilen bir spin sütunu vasıtası ile PCR ürünleri saflaştırılır.
   5. Ilgi konusu genin bir RN veya RC fragmanını ihtiva eden bir linearize plazmid birleştirmek için bir bağlama bağımsız bir tepki gerçekleştirmek. Saflaştırılmış PCR ürünlerinin konsantrasyonu ölçülür: doğrusallaştırılmış plazmidin 50 ng ve enzim ön karışımın 1 ul ilgi konusu genin 50 ng birleştirmek ve iyonu giderilmiş su ile 5 ul toplam hacim getirmek. Buz üzerinde 15 dakika, bir yer için 50 ° C'de inkübe edilir ve TE tamponu 20 ul ekle.
   6. Güçlü bakterilerin ¹⁸ rekombinant plazmidler dönüştürün.
   7. O / N kültür için kolonilerin (istenildiği gibi) 2-4 + seçin. 5 mlLB suyu ve 14 ml polipropilen yuvarlak tabanlı tüp içine kanamisin (50 mg / ml stok), 5 ul ve steril bir aşılama döngü ile seçilen bakteri kolonisi add. 225 rpm ile çalkalanarak bir 37 ° de CO / N inkübe edin.
   8. Gliserol stoku ¹⁹ O / N kültürünün 1 ml Freeze ve üretici tarafından tarif edildiği gibi geri kalan Miniprep.
   9. İyi bir klonu belirlemek için sıralamayı uygulayın. Malzeme Listesi klonlama plazmid kullanılırsa, füzyon yapının tam sekansı elde etmek için gerekli ileri M13 kullanmak ve (ayrı reaksiyonlarda) ters primerleri. - Böyle Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) dan BLAST olarak bir hizalama aracı kullanarak beklenen dizisi ile karşılaştır http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
   10. Bir Rekombinaz reaksiyonu vasıtasıyla bir ifade plazmid dizisi doğrulanmış yapıları aktarın.
       1. Hedef plazmid & # 75 ng ekle8212; ve 50 enzim ön karışımın 1 ul rekombinant klonlama plazmid ng ve deiyonize su ile 5 ul toplam hacim getirmek - örneğin pcDNA olarak lentiviral ambalaj ²⁰ için geçici transfeksiyonları ve randımanlı için. Daha sonra TE tamponu 5 ul, 1 saat süre ile 25 ° C'de inkübe edin.
          Not: lentiviral ambalaj ve dengeli hücre çizgisi üretimi için, puromisin direnç ve diğer neomisin, örneğin, her bir yapı için bir farklı bir hedef plazmiti kullanın. Bu kalıt aktarımlı hücrelerin iki seçilmesine olanak tanır. Ayrıca bu gibi ayarlanabilir doksisiklin ayarlı ifadesi için teto operatör ile yapısal sitomegalovirüs (CMV), yüksek ekspresyon düzeyleri için promoter veya CMV her biri için promoter, düşünün.
       2. Yetkili bakterilerin içine 5 ul Dönüşümü ve adımlar 1.2.6 için 1.2.8 gibi plazmidleri Miniprep, ancak uygun bir antibiyotik (genellikle ampisilin) ​​kullanarak.
3. Optimal belirleyinBiFC yapılandırması.
   1. Co-transfeksiyonu sentezleme U2OS hücrelere plazmidler (ya da seçenek hücre).
      1. 8 oyuklu # 1,5 cam alt oda slayt her oyuğuna% 10 FBS ile takviye edilmiş fenol kırmızısız ve antibiyotik içermeyen DMEM 350 ul ekle. Hücrelerin bu nedenle oyuk başına Plaka yaklaşık 7.5 x 10 hücre ⁴ yaklaşık% 70 -90% konfluent ertesi gün vardır.
      2. De tercih edilen bir reaktif kullanılarak her birinde farklı konfigürasyonlara sahip kaplama, ko-transfeksiyonu ekspresyon plazmidleri sonra üretici tarafından tarif edildiği gibi bir gün.
         1. Her bir oyuğa, 0.6 ml tüp ve pipet serumsuz indirgenmiş ortamlarda 50 ul her bir ekspresyon plazmidinin 125 ng ekleme için yukarı ve aşağı karıştırın. Tüpün merkezine doğru doğrudan ortam içine transfeksiyon reaktifi 1 ul ekleyin. Mix ve reaksiyon 30 dakika bekletin hafifçe çalkalayın.
         2. Yaklaşık yarı yarıya bölme slayt her bir kuyunun medyayı azaltın. G kuyulara transfeksiyon karışımı damla damla ekleyin ve sallamakently karıştırın. 24-48 st için CO ₂ 37 ° C'de inkübe hücreleri ve% 5. Ortam transfeksiyondan gün sonra değiştirin.
   2. Aşama 2.1.4 başlayan Protokol 2'deki gibi bir floresan mikroskop görüntü hücreleri.
      Not: sentezleme seviyeleri yüksek olan ve kamera PAmCherry1 nispeten düşük foton çıkışı için yeterince hassas ise, numune, standart bir floresan mikroskop görüntüsü alınabilir. Sulandırılmış PAmCherry1 molekülleri yeşil uyarım (561 nm) filtre seti ile görüntüleme öncesinde ultra viyole filtre seti (405 nm) ile aktif hale getirilebilir.
4. Uygun olduğunda, etkileşim bozan ilgi konusu olan proteinlerin birinin içine bir nokta mutasyonu, örneğin, bir negatif kontrol oluşturun. Protein klonlama plasmid üzerinde bir bölge-yönlendirmeli mütajenez ²¹ ve seçilen konfigürasyonun mutasyona uğratılacak gerçekleştirin.
5. Viral olarak yapıları paketlenmesiyle stabil bir hücre dizisi oluşturmaktanecikleri ve enfekte U2OS hücreleri (ya da tercih edilen hücre çizgisi). Bir uyarılabilir (tetrasiklin) ifade sistemi ¹⁵ için ifade BiFC uzun süre tersinmezliği bir sorun, ya da ayarlanabilir sentezleme isteniyorsa halinde görüntüleme öncesi indüklenebilir düşünün.
   DİKKAT: Viral paketleme sistemlerinin son nesil büyük ölçüde çoğaltma yetkili virüs üretme olasılığını azalttı ederken virüslere çalışma Biyogüvenlik Seviye 2 olarak sınıflandırılan bazı riskler hala mevcut bulunmaktadır. Kaynaklar bulunabilir http://www.cdc.gov/biosafety/publications/.
   1. Bir lenti- veya retroviral hedef vektör ²⁰ kullanılarak adımı yineleyin 1.2.10. 100 Midiprep için ml plazmitlerin daha saflığı O / N kültürünü artırın.
   2. 1. Gün Açık: Plate her yapı için bir 10 cm çanak içine yaklaşık 2 ^x 10 6 293T / 17 hücreleri paketlenecek.
   3. 2. Gün: Bir tra kullanarak bir transfeksiyon reaksiyonu hazırlayıntercih edilen ve üretici tarafından tarif edildiği gibi nsfection reajanı.
      1. Ambalaj plasmidler 1 ve 2 için 250 ng / ul nihai konsantrasyonları ile plazmidleri ambalaj bir ön-karışımı hazırlanmakta ve 100 ng / steril suda plazmid 3 paketlenmesi için mcL. Karıştırmak için yukarı ve aşağı 5 ml'lik bir polipropilen yuvarlak dipli tüp ve pipet 10 ambalaj plazmid ön karışım ul ve serumsuz indirgenmiş eden 1 ml'lik ortam hedef plazmitin 2,5 ug ekleyin. Tüpün merkezine doğru doğrudan ortam içine transfeksiyon reaktifi 20 ul ekle.
         1. Karıştırın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe yavaşça çalkalayın. Hücrelerinden yaklaşık yarım Ortamı çıkarın ve damla damla bir tarzda transfeksiyon karışımı ekleyin. Karıştırmak ve _CO2 37 ° C'de inkübe etmek ve 5% yavaşça çalkalayın. Sıcaklık _ve CO2 dengeleme için gevşetilmiş kapaklı bir tüp içinde levha başına ortam 10 ml inkübe edin.
      2. Gün 3: yavaşça öncesi inkübe medya ile ortamı değiştirmek ve returinkübatör hücrelerin n tane. Gevşetilmiş kapaklı başka bir medya tüp inkübe edin.
         Syncytia veya büyük çoklu-çekirdekli hücrelerin oluşumu, paketleme iyi gidiyor bir işareti olabilir: Not. Bununla birlikte, hücreler kırılgan bir halde ve kolayca ayrılabilir. Ortam değiştirirken, yatay olacak şekilde pipet tilt ve plakanın bir kenarına ortam damla damla ilave edin.
      3. Gün 4: bir şırınga ile medya kaldırılması ve temiz bir 50 ml tüp içine 0.45 mikron gözenek boyutu filtre ile filtreleme yoluyla virüs Hasat. Yavaşça öncesi inkübe medya ile medya değiştirin.
      4. Gün 5 Açık: Hasat yeniden adımda 1.5.3.3 önceden yapılması ve aynı 50 ml tüp içine ortak süzülen birleştirmek olarak. Her bir tüp virüs yoğunlaştırıcısının 6 ml ilave et ve karıştır. Virüs çökelene kadar en az 24 saat süre ile 4 ° C'de saklayın.
         Not: hücrelerin sağlığı bağlı olarak, virüs 3 zaman hasat edilebilir.
      5. 1500 xg'de santrifüj virüsü Konsantre4 ° C'de 15 dakika daha karıştırıldı. Süpernatantı aspire ve medya 250 ul pelletini. Virüs enfeksiyonu için hemen kullanılabilir veya bir yıla kadar -80 ° C 'de 50 ul alikolar içinde saklanabilir.
      6. Hücreler, böylece levhalar 3 x 10 ⁵ U2OS (veya hedef), enfeksiyon için (oyuk başına% 10 FBS ile DMEM 2 mi) bir 6-yuvalı plaka içine oyuk başına hücreleri enfeksiyonu zamanında yaklaşık% 50 konfluent.
      7. Ertesi gün, yaklaşık 1 ml kalıntıları yani yaklaşık yarım ortamı çıkarın. Her bir yapı için konsantre virüs 50 ul Coinfect. Her bir oyuğa polibren 1 ul (8 mg / ml) eklenir. 37 ° C'de inkübe edin ve% 5 _CO2. Ortam ertesi gün değiştirin ve antibiyotik seçimi öncesi bir gün daha kuluçkaya yatmaktadır.
         Not: Enfeksiyon istenilen oranda bağlı olarak değişebilir eklemek virüs miktarını. Virüsler QRT-PCR kullanılarak titre edilebilir.
      8. Enfekte hücreleri seçmek için antibiyotik ekleyin. Vi görmedim bulaşmamış hücreleri ile ayrı kuyukanarya seçiminin etkinliğini test etmek rus gerekmektedir. Seçimi tamamlandığında 2-7 gün kadar veya inkübe edin.
         Not: etkili konsantrasyonları başlangıçta titre edilebilir, ama bunlar genellikle, neomisin puromycin ve 1.0 mg / ml 1,0 ug / ml'dir.
      9. Daha büyük bir 10 cm çanak içine hücreleri genişletin ve Protokol 2'ye geçin.

2. Görüntüleme Sabit Hücreler

1. Görüntüleme için bir örnek hazırlayın
   1. En az 1 saat boyunca 1 M NaOH 250 ul ilave edilerek 8 oyuklu # 1,5 cam alt odasına slayt temizleyip PBS ile iyice yıkayın.
      Not: tedavi edilmemiş bölmeli lamlar tipik haliyle, yüksek bir zemin sinyali ile sonuçlanır. Ayrıca, hücreler artık NaOH ve hücre yapışması zor hale getirebilir iyice cam yüzeyi temizlemek için başarısızlık (kadar 10x olarak yıkar) duyarlı olabilir. Gerekirse, yıkadıktan sonra PBS O / N ile temizlenmelidir kamara slayt kuluçkaya yatmaktadır. Daha yüksek bir yoğunlukta kaplama duyarlı hücre hatları için,(Örneğin,% 50 -60% başlangıç ​​konflüansa) yardımcı olabilir.
   2. Plaka yaklaşık 5.5 x 10 ^4,% 10 FBS ile fenol kırmızısı içermeyen DMEM de 350 ul başına U2OS stabil ekspresyon hücreleri hücreleri sağlıklı olup görüntülerken, belirli konfluent fazla olacak şekilde.
   3. Böyle bir protein ifadesini uyarmak için tetrasiklin eklenmesi gibi deney için gerekli tedavileri, gerçekleştirin.
   4. Hemen görüntüleme önce hücreleri saptamak.
      1. Önce tespite, taze paraformaldehid (PFA) solüsyonu hazırlamak -% 3.7 PFA 1x PHEM% 0.1 glutaraldehit (GA) ile. 10 ml PFA çözüm için, PFA 0.37 g ağırlığında ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüp transfer. Damıtık su 1 ml, 1 M NaOH ve girdap 30 ul ekle. 70 ° C de ısı ve vorteks PFA kadar her 1-2 dakika tamamen çözülür.
      2. Transfer 15 ml konik tüp PFA çözündürüldü ve karışımı su damıtılmış 3,8 mi, 5 ml 2x PHEM tamponu,% 25 Tik glutaraldehid 20 ul ve vorteks ekleyin. Hazır, 2x PHEM tamponu 12'dir0 mM PIPES, 10 M KOH ile 7.0'a ayarlanmıştır pH, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA, 16 mM MgSO _4. Bu çözelti, sabitleştirici birkaç gün 4 ° C'de saklanabilir.
         DİKKAT: PFA ve GA hem zararlıdır. Davlumbaz çözeltisi hazırlayın ve her iki Kimyasallarla çalışırken uygun koruyucu ekipman giyin. Solumaktan veya doğrudan cilt temasından kaçının.
      3. Büyüme ortamı çıkarın. PBS 500 ul hızla yıkayın ve PFA fiksatif 250 ul ekleyin başına iyi. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe hücreleri.
   5. Örnek PFA Fiksatif çıkarın ve PBS veya görüntüleme tamponu oyuk başına (30 mM NaCI ve 20 mM _MgCI2, pH 8.5 ile 100 mM Tris) 350 ul ilave edin.
   6. Vortex 100 nm altın parçacıkları agrega kırmak ve görüntüleme sırasında sahne sürüklenme izlemek için kuyu başına 35 ul (10x son seyreltme) ekleyin.
2. Görüntü elde
   1. Mikroskop açın. 405 ve 561 nm lazerler Güç, ama kepenkleri tutmak(dahili veya harici) bu noktada kapattı. EMCCD Kamerayı açın ve soğumasını bekleyin. 561 nm filtreler yerinde olduğundan emin olun.
   2. Toplama yazılımı açın ve 100 milisaniye maruz kalma süresi ve 300 (aralık: 1 - 1000) için EMCCD kazancını ayarlayın.
   3. Hedefe daldırma yağı ekleyin ve mikroskop aşamasına örneği sabitleyin.
   4. Parlak bir alan veya 561 nm lazer biriyle (~ 1 kW / cm ^2), odak noktası haline getirmek numune.
   5. Ras ve diğer membran proteinleri görüntüleme için 1.49 sayısal diyafram ile 60X apochromat TIRF objektif kullanmak ve TIRF yapılandırma içine mikroskop getirmek. Kapalı merkezli TIRF objektif arka diyafram isabet zaman böylece uyarma lazer ayarlayın; Bu lazer örneği ulaşan üzerine saptırmak neden olur. Kritik açı ulaşıldığında ve lazer geri yansıtılıyor kadar lazer ayar tutun. Görünümde birçok altın parçacıkları ile görüntüye bir hücre için ara. Ilgi bir bölge ayarlayınBu hücreyi (ya da hücre içinde bir bölge) ve altın parçacıkları kapsamaktadır.
      Not: TIRF uyarma lazer penetrasyon derinliğini azaltır ve odak background sinyalinin out azaltır. Buna ek olarak, kayma düzeltme daha çok altın parçacıkları görünümünde daha doğru olması muhtemeldir.
   6. Varsa, z-doğrultusunda örnek sürüklenme düzeltmek için otomatik odaklama sistemi meşgul. Görüntü odak dışında giderse Aksi takdirde, satın alma boyunca Odağı manuel olarak ayarlayabilirsiniz.
   7. 405 nm lazer kapalı ve (~ 1 kW / cm ²⁾ dava yeterli aktivasyon zaten oluşup üzerinde 561 nm lazer ile edinilmesini başlayın (ifade düzeyleri yüksek olan tipik ise). Aksi halde kare başına molekül veya böylece tek moleküllerin onlarca vardır kadar gerekli, en düşük fabrika güç ayarında 405 nm lazer açın (0.02 mW veya 0.01 W / cm ^{2) ve} (bir seferde 0,1 mW) giderek artması iyi ayrılır.
   8. Veri toplama, grad devam ettikçeually kabaca sabit nokta yoğunluğunu tutmak için 405 nm lazer gücünü artırmak.
      Not: Alt 405 nm eksitasyon gücü, bazı PAmCherry1 önce aktif hale getirilebilir. Bu moleküllerin photobleach gibi, foto-aktifleştirilebilen PAmCherry1 molekülleri kalan nüfusu her çerçeve içinde floresan yayan molekülleri aynı yoğunluğunu korumak için yüksek bir foton akısı gerektiren azalır.
   9. Daha fazla aktivasyon olayları aktive etmez - (10 W / cm ² 2.5) yüksek 405 nm gücü kadar görüntü elde etme devam edin.
      Not: Toplam iktisap süresi tamamlama ifadesi seviyesi ve verimliliğine bağlıdır.
3. Görüntüleri işlemek
   Not: Görüntü işleme için birçok açık kaynak kodlu yazılım seçeneği vardır. Örnekler Gök Gürültülü (vardır https://code.google.com/p/thunder-storm/) ve QuickPALM (https://code.google.com/p / quickpalm /). Tipik veri işleme prosedürleri kısaca bir örnek olarak PALM verilerin işlenmesi için wfiread denilen özel bir Matlab paket programı kullanılarak burada gösterilmiştir. Ancak, gelecekteki revizyonlar tam burada açıklanan şeyleri takip edebilir. Diğer yazılımlar ile görüntü işleme için kullanıcı kılavuzlarına başvurun.
   1. Görüntü işleme yazılımları (Ek Kod Dosyası) ya da en son sürümünü indirin http://www.ohsu.edu/nan. (Zaten varsayılan yoluna koymak) wfiread yazılım Matlab açın ve yükleyin.
   2. Ham görüntü sırasını görüntüleyin ve ilgi bölgeyi belirler. Yığının alanı seçin sol tıklayarak ve istenen alanın etrafına bir kutu sürükleyerek işlenecek. Çevrede bölgesi (yaklaşık 256x256 piksel) satın alma sırasında düşürülen değil ise, işlem süresini azaltmak için daha küçük bir alanı seçin. Bir alan seçimini kaldırmak ve tüm çerçeveyi işler için, sağ inci herhangi tıklayıne görüntüsü.
   3. Dilimlerinde aralığını giriniz işlenecek.
   4. Bir altın parçacığı (izole edilir bir şekil ve üniforma) resmin üzerine sol tıklayarak ve çevresindeki küçük bir kutu sürükleyerek seçin. Parçacık Takip altında Parça butonuna tıklayın. Bir grafik sürüklenme kapsamını gösteren, bu görüntülerin yığınının karşısında seçilen altın parçacığın konumunu göstermektedir görünecektir.
   5. Mümkün olduğunca çok sayıda altın parçacıkları izlemek ve birlikte izlemek olanları belirlemek için bu işlemi tekrarlayın (partiküller renk kodlu olacaktır). İdeal genel sürüklenme en az bir pikselin sırasına olduğunu.
   6. Bireysel bir anda birlikte bir paletli altın parçacıkları seçin ve Parçacık Takip altında Add Marker düğmesini tıklatın. Yeşil çapraz bir işaretleyici olarak eklenmiştir ve sürüklenme düzeltmek için kullanılacak olacağını belirten görünecektir.
   7. Biraz değerleri değiştirerek gerektiğinde Sigma Range, Pürüzsüzleştirici Range ve Eşik ayarlayın. Bul Parçacık tıklayındüğme ayarlarını test etmek için. Işlenecektir parçacıklar kutulu olacak ve olmayanlar dışı bırakılacaktır. PAmCherry1 molekülleri, yuvarlak ve parlak partiküllerin seçilmelidir.
   8. Yap Coord Dosya düğmesine tıklayarak görüntü işleme başlayın ve dosyayı kaydedin.
      Not: Program tüm floresan noktalar bulmak, belirlenen çerçeve aralığında her karede geçmesi ve ağırlık merkezi koordinatları bulmak için Gauss uydurma gerçekleştirecektir. Bir .cor dosyası işlenmiş tek bir molekül görüntüleri tüm koordinatları ve diğer montaj parametreleri saklamak oluşturulur.
4. Post-işlem görüntüleri ve PALM resmi işlemek
   Not: Diğer yazılım doğrudan görüntü sonra çıkarma koordine hale getirebilir.
   1. Matlab, 'hurma' paketi başlatmak ve yeni oluşturulan .cor dosyası yüklenemedi.
   2. Koordinatları kullanarak PALM görüntüyü render önce, 'localizati bireysel koordinatları (her sıralamak) 'olay. Uygun ayırma değerleri, kurulum ve fluorofor bağlı olarak değişebilir.
      1. PAmCherry1 için aşağıdaki değerleri kullanın: birleştiren Frame - 8; Birleştiren Uzaklık (nm) - 100; Asgari RMS - 4; Asgari Fit İyilik - 0,25; ve Max. Eksantriklik - 1.4. Bu parametrelerin ek açıklama için tartışma bölümüne bakın.
   3. Yüksek çözünürlüklü görüntüler render hazır koordinatlar yeni bir dizi oluşturmak için Sıralama düğmesini tıklatın.
   4. Böyle ham piksel boyutunda (nm), işlenmiş görüntüde istenen özellik boyutu (nm) ve işlenmiş görüntü için piksel boyutuna kadar nihai görüntünün düzgün render değerleri girin.
      Not: Çiğ piksel boyutu her kurulum için tespit edilmelidir. Işlenen özellik boyutunun, isteğe göre ayarlanabilir, fakat genellikle ortalama lokalizasyon hassas göre biraz daha yüksek bir değere ayarlanır. PAmCherry1 için ortalama yerelleştirme hassas yaklaşık 18 nm, yani 20 bir özelliği boyutu - 30 nm ÖDENEK olduğunute. Not, yerelleştirme hassas fotonların tespit sayısının kare kökü ile kırınım limiti bölerek birden fazla kare üzerinden ²² ve aynı molekülün lokalizasyonu standart sapması alınarak hesaplanmıştır. Işlenmiş görüntünün piksel boyutunda ise 10 nm iyi bir başlangıç ​​noktasıdır; Bu değer çok düşük ayarı büyütülmemiş görünümler için gereksiz yere büyük görüntü dosyalarını neden olur.
   5. PALM görüntü oluşturmak için Render düğmesine tıklayın. Yakınlaştırma ve uzaklaştırma için şekil penceresinin araç çubuğunda +/- büyüteç simgeleri kullanın.
   6. İsteğe bağlı: Ripley'in K testi veya simülasyon destekli DBSCAN (SAD) ²³ gibi diğer mekanizmalar kullanılarak yeniden PALM görüntüsünün gerçekleştirin küme analizi. Not: Özel hurma paketinde, Ripley'in K ve SAD analiz hem zaten inşa edilir; diğer yazılım elde edilen koordinatları için, aynı analizler ek özel komut ile gerçekleştirilebilir.

Canlı hücreler 3. Tek Molekül Takibi

1. Doku kültürü yüzeyi tedavi ve belirli bir kültür çanağı ihtiyaç coverglass mikroskopi yerleşim için uygun kalınlık (0.17 mm) sahip olduğundan emin olun olabilir, sıcaklık ve / _veya CO2 kontrol aşaması yana Protokol 2'de anlatıldığı gibi hücreler plaka.
   1. Geçici bir ifadeyi yapıyor eğer hücreleri transfect ve ifade ikna etmek için böyle bir tetrasiklin gibi deney için gerekli herhangi bir tedavi gerçekleştirmek ve gerektiğinde kuluçkaya yatmaktadır. Protokol 2 de tarif edildiği gibi da aynıdır.
   2. Bir sahnede inkübatör kültür çanak yerleştirin. Çanak kültür çanak montaj veya ilgi yeni bir bölgeye taşıdıktan sonra her zaman stabilize sıcaklık ve _CO2 konsantrasyonu kadar birkaç dakika sahnede dinlendiriniz. Bu aşamada Blok lazerler. CO _{2 kontrol} mevcut değilse, örneğin Leibov olarak sağ görüntüleme önce bir CO ₂ bağımsız medya, değiştirmekitz L-15.
      Not: Fenol kırmızısı içermeyen aracı madde, sıkıcı eşiğe için tavsiye edilir.
2. Protokolde 2'deki gibi görüntü elde Ancak, uygun bir pozlama süresini (PAmCherry1 için tipik 25-50 msn) ayarlayın.
   Not: yörüngeleri birbirleri ile üst üste ihlal eder, böylece molekülün yoğunluğu sabit hücreler için daha düşük olmalıdır. Moleküllerin belirtilen birkaç on yaklaşık 160 nm'lik bir piksel boyutunda, 256x256 piksel elde edilmesi için tipik bir örneğidir. 561 nm lazer güç yoğunluğu hücrelere fototoksisite azaltılması ve ortalama uzunluğu yörünge artırırken iyi bir sinyal-gürültü oranını korumak için 0.8 kW / ^cm2 olarak ayarlanmış.
3. Görüntüleri işlemek.
   1. Protokol 2, ya da başka bir paket ile tarif edildiği gibi wfiread paketi ile tek moleküllerin koordinatları ekstrakte edin.
   2. Bulunan farklı algoritmalar dayalı (SPT) paketleri izleme çeşitli tek parçacık kullanarak tek parçacık yörüngeleri yenidenBaşka bir yerde ^24. Not: Alternatif olarak, bu adımı gelecekteki revizyonlar muhtemelen mevcut ev inşa Matlab paket (kullanılarak gerçekleştirilebilir http://www.ohsu.edu/nan.
   3. İsteğe bağlı: Rekonstrüksiyon sonrası yörüngeleri yer değiştirme ve difüzyon katsayılarını hesaplamak için bir SPT paketini ²⁴ kullanın. Ayrıca, hedef proteinlerin difüzyon durumlarını belirlemek için izleme variational Bayes tek parçacık (vbSPT) ²⁵ kullanın. : vbSPT Matlab paketi ve dokümantasyon kendi resmi Sourceforge sitesi adresinde bulunabilir http://vbspt.sourceforge.net/.

Sonuçlar

Gösterilen BiFC PALM örnek Craf etki (RBD) (Şekil 1A) bağlayıcı Ras ile etkileşim Kras G12D mutant olduğunu. Tartışıldığı gibi Ras zar lokalizasyonu ve dolayısıyla biyolojik aktivitesini bozacak, çünkü, RN veya RC fragmanları Ras'ın C-terminaline etiketlenmemiş. Bu dört (Şekil 1B) sekizden olası kombinasyonları azalır. Bu dört kombinasyon her lentiviral enfeksiyonu ile U2OS hücrelerine dahil edilmiştir. Protokolde ayrıntılı olarak hücreler sabitlend...

Tartışmalar

PALM sağlam biyolojik örneklerin nano ölçekli sokulmuşlardır son tek bir molekül superresolution mikroskopi tekniği ise BiFC, tespit ve hücrelerde PPIs görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir teknik, olmuştur. PALM ile BiFC kombinasyonu nanometre mekansal çözünürlükte ve tek bir molekülün duyarlılığı ile bir hücrenin içinde PPİ seçici görüntüleme elde etti. BiFC PALM her iki tekniğin yararını uzanır ve bu çalışmada gösterildiği gibi, kendi ana hücresel bağlamda PPİ ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope frame	Nikon	Ti-U
60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA	Nikon	CFI Apo TIRF 60x H
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 897
561 nm laser	Opto Engine	MGL-FN-561
405 nm laser	Coherent	CUBE-405 50mW
561 nm dichroic mirror	Semrock	Di01-R405/488/561/635-25x36
561 nm filter	Semrock	FF01-525/45-25
405/561 nm notch filter	Semrock	NF01-405/488/568-25
Temperature and CO2 controlled stage	Tokai Hit	INUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS	Addgene	60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS	Addgene	60546
pcDNA3.2-DEST	Life Technologies	12489-019
pLenti-DEST	Addgene		http://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-531
In-Fusion HD Cloning	Clontech	639649
LR Clonase	Life Technologies	11791
Vira Power Lentivirus Packaging	Life Technologies	K497500
X-tremeGENE Transfection Reagent	Roche	13873800
Lab-Tek II Chambered Coverglass	Thermo Scientific	155409	#1.5 glass bottom dishes
U2OS cells	ATCC	HTB-96
293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
DMEM with phenol red	Life Technologies	11995
DMEM no phenol red	Life Technologies	21063
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082
Leibovit's L-15, no phenol red	Life Technologies	21083-027
Reduced serum medium	Life Technologies	31985
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	14040
Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe filter	Millipore	SLHV033RB
Lentiviral concentrator	Clontech	631231
Retroviral concentrator	Clontech	631455
10 cm culture dish	BD Biosciences	353003
6-well culture plate	BD Biosciences	353046
Polybrene	Sigma	107689
Puromycin	Life Technologies	A11138
G-418	Calbiochem	345812	Neomycin
Doxycyline	Fisher	BP2653
Tris base	Fisher	BP152
EDTA	Sigma	EDS
Sodium Hydroxide	Sigma	S5881
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Glutaraldehyde	Sigma	G6257
PIPES	Sigma	P6757
HEPES	Sigma	H4034
EGTA	Sigma	3777
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643
Potassium Hydroxide	Sigma	221473
Sodium chloride	Fisher	BP358
Magnesium chloride	Fisher	M33
100 nm gold particles	BBI Solutions	EM.GC100
Molecular grade water	Life Technologies	10977
Dpn1	New England Biolabs	R0176
PCR purification kit	Qiagen	28104
Miniprep kit	Qiagen	27104
Midiprep kit	Macherey-Nagel	740410
0.6 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-120
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-137
15 ml tubes	Fisher	05-539-12
5 ml polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352063
14 ml polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352059
50 ml tube	BD Biosciences	352070
PCR tube	GeneMate	C-3328-1
SOC medium	Life Technologies	15544
LB broth	BD Biosciences	244610
Kanamycin sulfate	Fisher	BP906
Competent cells	Life Technologies	C4040
Matlab	Mathworks