Photoactivés Localisation Microscopie avec Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC-PALM)

Résumé

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Résumé

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Introduction

Interactions protéine-protéine (IPP) sont fondamentales pour la biologie ^{1 et} sont strictement réglementés par des mécanismes spatio-temporelles dans de nombreuses échelles de temps et de longueur. Des études sur la signalisation sur la membrane cellulaire cellule, par exemple, ont mis en évidence des compartiments spatiales dynamiques, à l'échelle nanométrique qui facilitent IPP processus cellulaires spécifiques et ^2. Par conséquent, la capacité de sonder IPP dans les systèmes biologiques avec des résolutions suffisantes spatiales et temporelles, haute spécificité et une sensibilité élevée est essentielle pour parvenir à une compréhension des mécanismes de la biologie.

Bimoléculaire complémentation de fluorescence (BiFC) est l'un des rares outils existants pour visualiser IPP dans une cellule avec une résolution subcellulaire et la compatibilité des cellules vivantes ^{3 ​​- 5.} La technique est relativement simple et implique le fractionnement d'une protéine de fluorescence en deux fragments non fluorescents; lorsque génétiquement marqués à deux protéines interagissant etamené à proximité, les fragments peuvent reconstituer pour former une protéine fluorescente complet, ce qui donne le signal fluorescent. Lorsqu'il est correctement conçu, sondes BiFC ne devraient pas reconstituer spontanément en l'absence des IPP. En tant que tel, le signal de fluorescence dans un essai BiFC ne se posera que dans la présence d'IPP, ce qui permet la visualisation directe des IPP avec une spécificité élevée. Les avantages supplémentaires de l'utilisation de la fluorescence que la lecture sont une haute sensibilité, une résolution subcellulaire, et la compatibilité avec un débit élevé et contenu dosages élevés de dépistage, entre autres. Pour ces avantages, un certain nombre de sondes BiFC basés sur différentes protéines fluorescentes parent ont été développés. Comme dans toutes les autres techniques de détection basées sur la microscopie optique classique, cependant, la résolution spatiale est limitée à BiFC ~ 250 nm par la diffraction de la lumière. Cela en fait un défi pour étudier la régulation des IPP à l'échelle nanométrique, qui, comme évoqué plus haut et illustré par des radeaux lipidiques ⁶ unee nanoclusters Ras ^7, est une échelle de longueur essentielle à la compréhension de nombreux processus cellulaires tels que la signalisation.

BiFC a été combinée avec Microscopie Palm (PALM) ^{8,9 à} surmonter cette limite de résolution spatiale pour former une image ¹⁰ IPP. PALM est une technique de microscopie à hyper-résolution récente qui contourne la limite de diffraction dans l'imagerie de fluorescence par l'activation et la localisation stochastique subdiffractive de molécules fluorescentes simples. Dans chaque cycle d'activation, une molécule fluorescente émet de quelques centaines à quelques milliers de photons et donnent lieu à une seule image molécule sur le détecteur. Bien que cette image est limité par diffraction (~ 250 nm de large), son centre de gravité peut être déterminée avec une précision beaucoup plus élevée, typiquement de l'ordre de 10 à 50 nm en fonction du nombre de photons détectés. En activant et la localisation de chaque molécule fluorescente dans l'échantillon, une image haute résolution peut être reconstruit. Performed sur les cellules vivantes, seule molécule de suivi (SMT) PALM permet en outre l'acquisition de milliers de trajectoires de diffusion de la protéine d'une cellule unique ^11. Surtout, PALM utilise des sondes fluorescentes spécialisées telles que les protéines fluorescentes photoactivables (PA-MF) pour obtenir l'activation stochastique. Depuis deux BiFC et des protéines fluorescentes utilisation PALM, ils ont été combinés en fractionnant PAmCherry1, un PA-FP couramment utilisé pour PALM, en deux fragments entre les acides aminés 159 et 160.

Le système basé sur PAmCherry1 BiFC partagé affiche faible signal de fond à partir de la reconstitution spontanée des deux fragments. Lorsque génétiquement marqués à une paire de protéines en interaction, les deux fragments (RN = 1 à 159 résidus de distillation; RC = Met + résidus 160-236) reconstitué de manière efficace pour former des protéines complètes PAmCherry1 même à 37 ° C et sans incubation à des températures plus basses, ce qui est pas le cas pour d'autres paires BiFC ¹² comme le parent mCherry ^13. Furthermore, la protéine de PAmCherry1 reconstitué conservé les propriétés photophysiques du PAmCherry1 mère, comme rapport de contraste élevé, rendement photonique moyen et photoactivation rapide, entre autres, qui sont essentiels pour la précision de localisation de la molécule unique et PALM imagerie à haute résolution.

Dans ce protocole, l'utilisation de BiFC-PALM pour imager interactions Ras-Raf dans des cellules en utilisant U2OS scission PAmCherry1 (figure 1A) est décrite. La première étape consiste à concevoir des constructions pour l'expression de protéines de fusion entre des fragments PAmCherry1 (c.-à-RN et RC) et les protéines d'intérêt. En théorie, pour chaque paire de protéines candidates (A et B), il y a huit paires de protéines de fusion à tester: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; et A-RC / B-RN. Ce processus peut souvent être simplifié en prenant en compte les propriétés structurales ou biochimiques des protéines candidates. Dans le cas de Ras, la protéine estmodifiée après traduction à la boîte CAAX C-terminal (C = Cys; A = aliphatique; X = y en a), après quoi le motif de AAX est clivé. Par conséquent, RN ou RC ne peuvent être fusionnés à l'extrémité N-terminale de Ras; ce qui réduit le nombre de paires de protéines de fusion à quatre (figure 1B). Pour Raf, le domaine Ras-contraignant (RBD; résidus 51-131) sont utilisées et peuvent être étiquetés à chaque extrémité. Ces quatre configurations de fusion ont été générés: RN-KRAS / RC-Raf RBD; RN-KRAS / Raf-RBD RC; RC-KRAS / RN-Raf RBD; et RC-KRAS / Raf RBD-RN.

En outre, l'agent de liaison entre les fragments et les protéines d'intérêt devra prendre en compte. Un lieur flexible d'environ dix acides aminés est souvent utilisé car il offre une liberté suffisante pour la complémentation de se produire. Une telle liaison est (GGGGS) x2, mais il ya beaucoup d'autres qui ont été appliquées avec succès, y compris des séquences aléatoires générées à partir d'un site de clonage multiple (MCS) ^14. La longueur des segments de liaison peut avoir besoin d'être optimisé depending sur la taille des protéines d'intérêt et leurs orientations lors de l'interaction.

Les fragments de PAmCherry1 sont contenues dans une petite épine dorsale de clonage avec accompagnement PMM (voir liste des matières). Les gènes d'intérêt peut être inséré via les sites de restriction ou avec un procédé de ligature indépendante. Après vérification de la séquence et le clonage, la cassette d'expression est transféré dans un vecteur d'expression en utilisant une réaction de recombinase, un procédé de clonage avec une grande fidélité et une grande efficacité.

Ensuite, les constructions d'expression résultants sont transfectés dans la lignée cellulaire cible ou, si une lignée cellulaire stable est souhaitée, conditionné dans des lentivirus pour infecter la lignée cellulaire cible. Transfection transitoire permet de valider rapidement les configurations BiFC, mais les problèmes potentiels doit être noté. Transfection en utilisant des produits chimiques souvent souligne les cellules, entraînant une forte auto-fluorescence; tandis que l'utilisation totale de la fluorescence à réflexion interne (FRBR) microscopy peut atténuer ce signal de fond en limitant le volume de l'éclairage, la FRBR idéal lorsque les IPP ont lieu sur la membrane cellulaire. En outre, des transfections transitoires conduisent souvent à des niveaux élevés d'expression de protéines, dépassant de loin celles des protéines endogènes, qui peuvent causer des artefacts à détecter les IPP. Par conséquent, il est recommandé que les lignées cellulaires stables sont établies après une configuration BiFC appropriée a été déterminée par l'essai initial. Des lignées cellulaires stables ont également le potentiel pour l'expression accordable par induction ¹⁵ doxycycline.

Après l'infection, les cellules sont sélectionnées avec des antibiotiques, typiquement la puromycine et à la néomycine, une pour chaque construction. Les étapes suivantes de préparation de l'échantillon, l'acquisition de l'image, et l'analyse des données vont être décrits en détail dans les protocoles.

Avec cette approche, la formation de grappes à l'échelle nanométrique en images BiFC-paume de Ras-Raf RBD sont régulièrement observé (figure 2A </ strong>). Constamment, les trajectoires SMT-paume de Ras-Raf RBD montrent une distribution hétérogène dans les Etats de diffusion (figure 2B-D). Ces résultats suggèrent que les complexes de Ras-Raf existent dans de multiples états sur la membrane cellulaire, probablement en tant que monomères et des grappes, avec des conséquences biologiques potentiels. Ce travail démontre la puissance de BiFC-PALM en imagerie sélective des IPP dans les cellules avec une résolution spatiale de nanomètre et sensibilité unique molécule, ce qui serait difficile à obtenir avec BiFC conventionnelle, la fluorescence co-localisation, ou le transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET).

Lors de la conception des expériences BiFC et interpréter les résultats, il est important de garder à l'esprit que le processus est irréversible BiFC dans la plupart des cas, y compris PAmCherry1 scission. Une fois que les deux fragments se combinent et forment une protéine de PAmCherry1 complet, la liaison entre les deux fragments, et donc l'IPP devient permanente. Ceci limite l'utilisation de BiFC et BiFC-PALM pour la surveillance de la dynamique des IPP (c.-à-cinétique de liaison et pas la dynamique de diffusion du complexe protéique fois qu'il est formé) et parfois pourrait même conduire à une mauvaise localisation des complexes de PPI.

Un autre facteur à considérer lors de la conception des expériences BiFC-Palm est le retard dans la maturation chromophore qui est inhérente à des protéines fluorescentes. Une fois que deux protéines interagissent et les fragments de PF se réunissent, ils replient généralement de l'ordre de secondes (à mi-temps de 60 sec pour EYFP ^3). Toutefois, après maturation chromophore fluorescent et se développent sur le signal de l'ordre de minutes. Alors que la fluorescence peut être détectable dans les 10 min après reconstitution du split-Vénus, une variante rapide pliage YFP, la mi-temps pour la maturation en général est souvent autour de 60 min ^16. Split-PAmCherry1 a été observé que des taux similaires. Par conséquent, BiFC et BiFC-PALM sont des choix actuellement pauvres pour le suivi cinétique de PPI en temps réel; autre methodes, comme FRET et une dimérisation récemment développé la protéine fluorescente dépendante ^17, peut être plus adapté à cet effet.

Protocole

1. Clonage

1. Déterminer les configurations à cloner et à choisir un lieur. Protéines de Tag avec les fragments sur le N- ou C-terminale comme décrit ci-dessous afin qu'ils ne perturbent pas leur localisation correcte. Utilisez un lieur flexible tels que (GGGGS) x2.
2. Marquer génétiquement les protéines d'intérêt aux fragments de PAmCherry1. Comme une option, utiliser les plasmides de clonage énumérés dans la liste des matériaux contenant les fragments RN (résidus de PAmCherry1 1-159) et RC (Met plus des résidus de PAmCherry1 160-236) avec accompagnement MCS séquences.
   1. Linéariser les plasmides contenant les fragments RN et RC avec PCR inverse (ou digestion de restriction) au point d'insertion. Amorces pour la PCR inverse sont énumérés dans le tableau 1. Ci-dessous est un protocole de PCR exemple utilisé dans le laboratoire de l'auteur (voir la liste des matériaux pour les matériaux exacts utilisés dans ce protocole).
      1. Mélanger la réaction de PCR en même temps, amené à un volume final de 50 ul avec de l'eau: une paroi minceTube ed PCR, ajouter l'eau, 25 ul de 2x Master Mix, 0,5 pi de chacune des amorces avant et arrière (20 um d'achat d'actions dilué, 0,2 uM concentration finale), et 1 ng de matrice. Les conditions de cyclage suivantes: 98 ° C pendant 30 sec, 30 cycles de 98 ° C pendant 7 secondes et 68 ° C pendant 2 min et une extension finale à 72 ° C pendant 10 min.
   2. PCR des gènes d'intérêt pour l'insertion des plasmides linéarisés contenant des fragments RN et RC. Effectuer la PCR comme à l'étape 1.2.1 avec le temps d'extension à 68 ° C. Utilisation des amorces avec des surplombs qui contiennent une séquence de liaison souple, tels que GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT de (GGGGS) x 2, et 15 paires de bases d'homologie avec les extrémités de la RN linéarisé les plasmides et RC pour la recombinaison.
      Remarque: Les surplombs amorces pour des protéines d'intérêt sont présentées dans le tableau 2 si on utilise les amorces du tableau 1 pour linéariser le squelette plasmidique.
   3. Digérer la PCRréaction avec Dpn1 pour éliminer la matrice de PCR. Ajouter 0,5 pi de Dpn1 (20 U / pi) directement à la 50 pi de réaction PCR. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure et de la chaleur inactiver à 80 ° C pendant 20 min. Si le modèle de fond persiste dans les étapes ultérieures, augmenter la quantité d'enzyme ou allonger le temps de digestion.
   4. On purifie les produits PCR par l'intermédiaire d'une colonne de centrifugation de la manière décrite par le fabricant.
   5. Effectuer une réaction de ligature indépendante de combiner un plasmide linéarisé contenant un RN ou un fragment RC avec le gène d'intérêt. Mesurer la concentration des produits de PCR purifiés: combiner 50 ng de plasmide linéarisé et 50 ng du gène d'intérêt avec 1 ul d'enzyme de prémélange et pour apporter le volume total de 5 ul avec de l'eau désionisée. Incuber à 50 ° C pendant 15 min, placer sur la glace, et ajouter 20 pi de tampon TE.
   6. Transformez plasmides recombinants dans des bactéries compétentes ^18.
   7. Sélectionnez 2-4 + (au choix) colonies pour O / N culture. Ajouter 5 mlde bouillon LB et 5 pi de kanamycine (50 mg / stock ml) dans un tube à fond rond de 14 ml en polypropylène, et ajouter la colonie de bactéries sélectionnées avec une boucle inoculation stérilisée. Incuber à 37 ° CO / N tout en agitant à 225 rpm.
   8. Congeler 1 ml de culture O / N pour stock de glycérol ^{19 et} miniPREP le reste comme décrit par le fabricant.
   9. Effectuer séquençage pour déterminer un bon clone. Si vous utilisez les plasmides de clonage dans la liste des matières, utilisez M13 amorces sens et antisens (dans des réactions séparées) que nécessaire pour obtenir la séquence complète de la construction de fusion. Comparer avec la séquence attendue en utilisant un outil d'alignement tel que BLAST du National Center for Biotechnology Information (NCBI) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
   10. Transférer les constructions de séquences-vérifié à un plasmide d'expression par une réaction de recombinase.
       1. Ajouter 75 ng de la destination plasmide & #8212; tels que pcDNA pour transfections transitoires ou pLenti pour l'emballage lentiviral ²⁰ - et 50 ng du plasmide de clonage recombinant à 1 ul d'enzyme prémélange et d'élever le volume total à 5 pi avec de l'eau déminéralisée. Incuber à 25 ° C pendant 1 h, puis ajouter 5 ul de tampon TE.
          Remarque: Pour lentiviral emballage stable et la production d'une lignée cellulaire, en utilisant un plasmide destination différent pour chaque construction, par exemple, avec une résistance à la puromycine et l'autre à la néomycine. Cela permet de double sélection de cellules transduites. Voir également le promoteur pour chacun, tel que le promoteur du cytomegalovirus constitutif (CMV) pour des niveaux d'expression élevés, ou CMV avec l'opérateur TetO pour l'expression régulée par la doxycycline accordable.
       2. 5 ul de transformation dans des bactéries compétentes et miniprep plasmides comme dans les étapes 1.2.6 à 1.2.8, mais en utilisant l'antibiotique approprié (typiquement de l'ampicilline).
3. Déterminer la optimaleBiFC configuration.
   1. Co-transfecter plasmides d'expression dans des cellules U2OS (ou cellule de choix).
      1. Ajouter 350 pi de phénol DMEM sans rouge et sans antibiotique complété avec 10% de FBS dans chaque puits d'une chambre en bas diapositive 8 puits # 1.5 de verre. Plate environ 7,5 x 10 ⁴ cellules par puits de sorte que les cellules sont environ 70% -90% de confluence le lendemain.
      2. Le lendemain de plasmides d'expression de placage, co-transfecter avec des configurations différentes dans chaque puits en utilisant le réactif préféré et comme décrit par le fabricant.
         1. Pour chaque puits, ajouter 125 ng de chaque plasmide d'expression dans 50 pi de support réduite sans sérum dans un tube de 0,6 ml et pipette de haut en bas pour mélanger. Ajouter 1 pi du réactif de transfection au centre du tube et directement dans le milieu. Agiter doucement pour mélanger et laisser la réaction reposer pendant 30 min.
         2. Réduire les médias dans chaque puits de la lame de la chambre de moitié environ. Ajouter goutte à goutte le mélange de transfection dans les puits et agiter gremment pour mélanger. Incuber les cellules à 37 ° C et _5% de CO2 pendant 24 à 48 heures. Changer les médias le jour après la transfection.
   2. Cellules image sur un microscope à fluorescence que dans le protocole 2 partir de l'étape 2.1.4.
      Note: L'échantillon peut être reproduite sur un microscope à fluorescence standard si les taux d'expression sont élevés et la caméra est suffisamment sensible pour la production de photons relativement faible de PAmCherry1. Molécules d'PAmCherry1 reconstitués peuvent être activés avec un ensemble de filtre ultra-violet (405 nm) avant l'imagerie avec une excitation vert (561 nm) jeu de filtres.
4. Le cas échéant, créer un témoin négatif, par exemple, en introduisant une mutation ponctuelle dans l'une des protéines d'intérêt qui perturbe l'interaction. Faire une mutagenèse dirigée ²¹ sur le plasmide de clonage de la protéine à muter et de la configuration choisie.
5. Générer une lignée cellulaire stable en conditionnant les constructions dans viraleparticules et d'infecter les cellules U2OS (ou une lignée cellulaire de choix). Envisager un système (tétracycline) d'expression inductible ¹⁵ afin expression peut être induite avant l'imagerie si irréversibilité prolongée de BiFC est un problème, ou si l'expression accordable est souhaitée.
   ATTENTION: Travailler avec des virus est classé comme biosécurité de niveau 2. Si les récentes générations de systèmes d'emballage virales ont considérablement réduit la probabilité de produire des virus compétents pour la réplication, certains risques sont toujours présents. Les références peuvent être trouvées à http://www.cdc.gov/biosafety/publications/.
   1. Répétez l'étape 1.2.10 en utilisant un vecteur de destination lenti- ou rétrovirale ^20. Augmenter la culture O / N à 100 ml pour un midiprep et une plus grande pureté des plasmides.
   2. Le jour 1: Plaque d'environ 2 x 10 ⁶ 293T / 17 cellules dans une boîte de 10 cm pour chaque construction à emballer.
   3. Le jour 2: Préparer une réaction de transfection utilisant un transfection réactif de choix et de la manière décrite par le fabricant.
      1. Préparer un pré-mélange de l'emballage plasmides avec des concentrations finales de 250 ng / ul pour les plasmides d'emballage 1 et 2, et 100 ng / ul de plasmide pour l'emballage 3 dans de l'eau stérile. Ajouter 10 pi de prémélange emballage de plasmide et 2,5 pg du plasmide cible à 1 ml de milieu sans sérum réduit dans un tube de pipette et à fond rond de 5 ml polypropylène de haut en bas pour mélanger. Ajouter 20 ul de réactif de transfection au centre du tube et directement dans le milieu.
         1. Agiter doucement pour mélanger et incuber à température ambiante pendant 30 min. Retirer environ la moitié des médias à partir des cellules et ajouter le mélange de transfection d'une manière goutte à goutte. Secouer doucement pour mélanger et incuber à 37 ° C et 5% de CO _2. Incuber 10 ml de milieu par plaque dans un tube avec le bouchon desserré pour la température _et le CO 2 équilibration.
      2. Le Jour 3: changer doucement les médias avec les médias pré-incubées et return les cellules à l'incubateur. Incuber un autre tube des médias avec le bouchon desserré.
         Remarque: Syncytia, ou la formation de grandes cellules multinucléées, peut être un signe que l'emballage va bien. Cependant, les cellules sont dans un état fragile et peut facilement être enlevé. Lorsque vous changez les médias, inclinez la pipette de sorte qu'il est horizontal et ajouter le goutte à goutte des médias dans un bord de la plaque.
      3. Le jour 4: récolter le virus par élimination du support avec une seringue et une filtration à travers un filtre de taille de pore de 0,45 um dans un tube de 50 ml propre. Replacez délicatement les médias avec les médias pré-incubées.
      4. Le jour 5: Récolte à nouveau comme précédemment à l'étape 1.5.3.3 et de combiner filtrat commun dans le même tube de 50 ml. Ajouter 6 ml d'concentrateur de virus à chaque tube et mélanger. Conserver à 4 ° C pendant au moins 24 heures jusqu'à ce que les précipités de virus.
         Note: En fonction de la santé des cellules, le virus peut être récolté une troisième fois.
      5. Concentrer le virus par centrifugation à 1500 xgpendant 15 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant et remettre le culot dans 250 pi de médias. Le virus peut être utilisé immédiatement pour l'infection ou stocké dans des aliquotes de 50 ul à -80 ° C pendant jusqu'à un an.
      6. Plaque d'environ 3 x 10 ⁵ U2OS (ou cible) cellules par puits dans une plaque à 6 puits (2 ml de DMEM avec 10% de FBS par puits) pendant l'infection, de sorte que les cellules sont confluentes à environ 50% au moment de l'infection.
      7. Le lendemain, retirez environ la moitié des médias afin d'environ 1 ml restes. Co-infecter avec 50 ul de virus concentré pour chaque construction. Ajouter 1 pi de polybrène (8 mg / ml) dans chaque puits. Incuber à 37 ° C et 5% de CO _2. Changer les médias le lendemain et incuber pendant un jour de plus avant la sélection antibiotique.
         Note: La quantité de virus à ajouter peut varier en fonction du taux d'infection souhaitée. Les virus peuvent être titrés en utilisant qRT-PCR.
      8. Ajouter des antibiotiques pour sélectionner les cellules infectées. Puits séparés avec des cellules non infectées qui ne sont pas vus virus sont tenus comme les canaris pour tester l'efficacité de la sélection. Incuber pendant 2-7 jours, ou jusqu'à ce que la sélection est terminée.
         Remarque: Les concentrations efficaces devraient être titrés au départ, mais ils sont typiquement 1,0 ug / ml pour la puromycine et 1,0 mg / ml de néomycine.
      9. Développez les cellules dans une plus grande boîte de 10 cm et de procéder à protocole n ° 2.

2. imagerie fixe Cellules

1. Préparer un échantillon pour l'imagerie
   1. Nettoyer un # 1.5 chambre lame de verre à fond 8 puits en ajoutant 250 pi de NaOH 1 M pendant au moins 1 heure et laver soigneusement avec du PBS.
      Remarque: diapositives de la chambre non traités entraînent généralement un signal de fond élevé. En outre, les cellules peuvent être sensibles à NaOH résiduelle et l'incapacité à nettoyer soigneusement la surface de verre (jusqu'à 10x lavages) peut rendre difficile l'adhésion cellulaire. Si nécessaire, incuber la lame de la chambre nettoyée avec du PBS O / N après le lavage. Pour les lignées cellulaires sensibles, le placage à une densité plus élevée(Par exemple, à 50% -60% de confluence initiale) peut aider.
   2. Plaque d'environ 5,5 x 10 ⁴ U2OS des cellules d'expression stable par puits dans 350 ul de phénol DMEM exempt de rouge avec 10% de FBS de sorte que les cellules sont en bonne santé et pas plus de confluence lors de l'imagerie.
   3. Effectuer des traitements nécessaires pour l'expérience, comme l'ajout de tétracycline pour induire l'expression de la protéine.
   4. Fixer les cellules immédiatement avant l'imagerie.
      1. Avant la fixation, préparer paraformaldéhyde frais (PFA) solution - 3,7% en PFA 1x MEHP avec 0,1% de glutaraldéhyde (GA). Pour 10 ml de solution de PFA, peser 0,37 g de PFA et de les transférer à un tube de 1,5 ml. Ajouter 1 ml d'eau distillée et 30 ul de NaOH IM et une vortex. Chauffer à 70 ° C et le vortex toutes les 1-2 min jusqu'à ce que PFA est complètement dissous.
      2. Transfert dissous PFA à un tube conique de 15 ml et ajouter 3,8 ml d'eau distillée, 5 ml 2x tampon de MEHP, 20 pi de glutaraldéhyde à 25%, et vortex pour mélanger. Stock, tampon de MEHP 2x est 120 mM de PIPES, HEPES 50 mM, EGTA 20 mM, 16 mM et MgSO _4, avec pH ajusté à 7,0 avec KOH 10 M. Cette solution de fixateur peut être stocké à 4 ° C pendant plusieurs jours.
         ATTENTION: PFA et GA sont à la fois dangereux. Préparer la solution dans une hotte de laboratoire et porter un équipement de protection approprié lors de la manipulation deux produits chimiques. Eviter l'inhalation ou le contact direct de la peau.
      3. Retirer le milieu de croissance. Laver rapidement avec 500 ul de PBS et ajouter 250 ul du fixateur PFA par puits. Incuber les cellules pendant 20 min à température ambiante.
   5. Retirer le fixateur PFA de l'échantillon et ajouter 350 ul de PBS ou de tampon de formation d'image (Tris 100 mM de NaCl avec 30 mM et 20 _mM de MgCl2, pH 8,5) par puits.
   6. Vortex 100 particules nm d'or pour briser les agrégats et ajouter 35 pi par puits (10x dilution finale) pour le suivi de la dérive de la scène lors de l'imagerie.
2. Acquérir les images
   1. Allumez le microscope. Puissance sur les lasers 405 nm et 561, mais garder les volets(interne ou externe) fermée à ce point. Tournez sur la caméra EMCCD et laissez-le refroidir. Vérifiez que les filtres 561 nm sont en place.
   2. Ouvrez le logiciel d'acquisition et de régler le temps d'exposition à 100 ms et le gain EMCCD à 300 (gamme 1 - 1000).
   3. Ajouter de l'huile d'immersion de l'objectif et l'échantillon à fixer la platine du microscope.
   4. Avec deux champs lumineux ou le laser de 561 nm sur (~ 1 kW / cm ^2), amener l'échantillon dans le foyer.
   5. Pour l'imagerie Ras et d'autres protéines membranaires, utilisez un objectif de 60X FRBR apochromat 1,49 ouverture numérique et amener le microscope dans la configuration de la FRBR. Réglez le laser d'excitation de sorte qu'il est décentré en frappant l'ouverture arrière de l'objectif de la FRBR; ce qui provoque le laser pour dévier lorsqu'il atteint l'échantillon. Continuez à régler le laser jusqu'à l'angle critique est atteint et le laser est réfléchi. Rechercher une cellule d'image avec plusieurs particules d'or en vue. Définir une région d'intérêtqui entoure la cellule (ou d'une région à l'intérieur de la cellule) et les particules d'or.
      Remarque: TIRF diminue la profondeur du laser d'excitation de pénétration et réduit le signal de mise au point sur de fond. En outre, la correction de dérive est susceptible d'être plus précis lorsque plusieurs particules d'or sont en vue.
   6. Le cas échéant, engager le système de mise au point automatique pour corriger la dérive de l'échantillon dans la direction z. Sinon, ajuster la mise au point manuellement à travers l'acquisition si l'image devient floue.
   7. Commencez acquisition avec le laser 405 nm au large et le laser de 561 nm sur (~ 1 kW / cm ²⁾ en cas d'activation suffisante se produit déjà (généralement si les niveaux d'expression sont élevés). Sinon, tournez sur la nm laser 405 au réglage le plus bas de la puissance de l'usine (0,02 mW ou 0,01 W / cm ²⁾ et d'augmenter progressivement (0,1 mW à la fois) que nécessaire jusqu'à ce que il ya plusieurs dizaines de molécules par image ou que des molécules uniques sont bien séparés.
   8. Comme l'acquisition de données continue, gradsivement augmenter la puissance du laser 405 nm à maintenir la densité de place à peu près constante.
      Remarque: A la baisse du pouvoir d'excitation 405 nm, certains PAmCherry1 peut déjà être activée. Comme ces molécules de photoblanchiment, la population de molécules d'PAmCherry1 restant photoactivables diminue, ce qui nécessite un flux de photons supérieur à maintenir la même densité de molécules émettant une fluorescence dans chaque trame.
   9. Continuer acquisition de l'image jusqu'à ce que la puissance élevée de 405 nm (2,5 à 10 W / cm ²⁾ ne pas activer d'autres événements d'activation.
      Remarque: Le temps d'acquisition totale dépend du niveau d'expression et l'efficacité de la complémentation.
3. Traiter les images
   Remarque: Il ya beaucoup d'options de logiciels open source pour le traitement de l'image. Les exemples sont ORAGE (https://code.google.com/p/thunder-storm/) et QuickPALM (https://code.google.com/p / quickpalm /). Les procédures typiques de traitement de données sont brièvement illustrées ici en utilisant un package Matlab personnalisé appelé wfiread de traitement de données de palme comme un exemple. Toutefois, les révisions futures peuvent ne pas suivre exactement ce qui est décrit ici. Pour le traitement de l'image avec un autre logiciel, s'il vous plaît se référer aux documentations utilisateurs.
   1. Téléchargez le logiciel de traitement d'image (Fichier de code supplémentaire) ou la dernière version à http://www.ohsu.edu/nan. Ouvrez Matlab et charger le logiciel de wfiread (qui est déjà mis dans le chemin par défaut).
   2. Voir la séquence d'image brute et de déterminer la région d'intérêt. Sélectionnez le domaine de la pile à traiter par un clic gauche et glisser une boîte autour de la zone souhaitée. Si la région d'intérêt n'a pas été réduite au cours de l'acquisition (à environ 256x256 pixels), sélectionner une zone plus petite pour réduire le temps de calcul. Pour désélectionner une zone et traite l'ensemble du cadre, faites un clic droit n'importe où dans THimage de e.
   3. Entrez la plage d'images à traiter.
   4. Sélectionnez une particule d'or (de celui qui est isolé et uniforme dans la forme) par un clic gauche sur l'image et en faisant glisser une petite boîte autour d'elle. Sous Suivi de particules, cliquez sur le bouton de la piste. Un graphique apparaît que montre la position de la particule d'or sélectionné à travers la pile d'images, représentant la mesure de la dérive.
   5. Répétez ce processus de suivre autant de particules d'or que possible et de déterminer celles qui suivent ensemble (les particules seront codés par couleur). Idéalement la dérive globale est de l'ordre d'un pixel au maximum.
   6. Sélectionner individuellement les particules d'or qui a suivi un ensemble à la fois et cliquez sur le bouton Ajouter un marqueur sous Suivi de particules. Une croix verte apparaît signifiant qu'il a été ajouté comme un marqueur et sera utilisé pour corriger la dérive.
   7. Ajustez la chaîne Sigma, Lissage Range et Seuil nécessaire en modifiant légèrement les valeurs. Cliquez sur l'Recherche particulesbouton pour tester les paramètres. Les particules qui seront traités seront encadrés et ceux qui ne sont pas seront laissés de côté. Les molécules d'PAmCherry1, particules qui sont relativement rond et lumineux, devraient être sélectionnés.
   8. Commencez traiter les images en cliquant sur le bouton Coord Créer un fichier et enregistrez le fichier.
      Remarque: Le programme passera par chaque cadre dans l'intervalle de trame définie, trouver tous les taches fluorescentes, et effectuer des ajustement gaussien de trouver les coordonnées centroïdes. Un fichier .cor sera généré stocker toutes les coordonnées et autres paramètres d'ajustement des images simples de molécules transformés.
4. Post-traitement des images et de rendre l'image de PALM
   Remarque: D'autres logiciels peuvent directement rendu de l'image après coordonner extraction.
   1. Dans Matlab, lancer le package 'de palme »et charger le fichier .cor venez de créer.
   2. Avant de rendre l'image PALM utilisant les coordonnées, trier les coordonnées individuelles (chacun d'un «localizatisur événement »). Les valeurs de tri optimales peuvent varier en fonction de la configuration et de fluorophore.
      1. Pour PAmCherry1, utiliser les valeurs suivantes: Combinant Frame - 8; Combinant Distance (nm) - 100; RMS minimum - 4; Fit Bonté minimum - 0,25; et Max. Excentricité - 1.4. Voir la section de discussion pour des explications supplémentaires de ces paramètres.
   3. Cliquez sur le bouton Trier pour générer un nouveau jeu de coordonnées prêts pour le rendu des images haute résolution.
   4. Entrez les valeurs pour un rendu correct de l'image finale comme la taille brute de pixel (nm), la taille de la fonction désirée (nm) dans l'image rendue, et la taille du pixel de l'image rendue.
      Remarque: La taille brute de pixel doit être déterminé pour chaque installation. La dimension de l'élément peut être rendue arbitrairement fixée, mais est typiquement fixé à une valeur légèrement supérieure à la précision de la localisation de la moyenne. Pour PAmCherry1, la précision de localisation moyenne est d'environ 18 nm, donc une taille de trait de 20 - 30 nm est appropriée.Boîtete. Il faut noter que la précision de la localisation a été calculée en prenant la déviation standard des localisations de la même molécule sur plusieurs trames ²² et en divisant pas la limite de diffraction de la racine carrée du nombre de photons détectés. Quant à la taille de pixel de l'image rendue, 10 nm est un bon point de départ; définition de cette valeur trop faible se traduira dans les fichiers inutilement grandes images pour les vues grossies.
   5. Cliquez sur le bouton Rendu pour générer l'image de PALM. Utilisez les icônes +/- loupe dans la barre d'outils de la fenêtre de figure pour zoomer et dézoomer.
   6. Facultatif: Effectuer une analyse de cluster de l'image de PALM reconstruite en utilisant soit test de K de Ripley ou d'autres mécanismes tels que la simulation assistée par dbscan (SAD) ^23. Remarque: Dans le paquet de palme de coutume, à la fois K de Ripley et de l'analyse SAD sont déjà intégrées; pour les coordonnées générées à partir d'autres logiciels, les mêmes analyses peuvent être effectuées avec des scripts personnalisés supplémentaires.

3. Simple suivi Molecule dans des cellules vivantes

1. Traiter la surface de culture de tissus et de la plaque les cellules comme décrit dans le protocole 2. Puisque la température et / CO ₂ scène ou contrôlée peut nécessiter une certaine boîte de culture, assurez-vous que la lamelle a l'épaisseur appropriée (0,17 mm) pour l'installation de microscopie.
   1. Transfecter des cellules si vous effectuez une expression transitoire et effectuer les traitements nécessaires pour l'expérience, comme la tétracycline pour induire l'expression, et incuber comme nécessaire. Ceci est également le même que celui décrit dans le protocole 2.
   2. Placez la boîte de culture sur un incubateur sur scène. Laissez le plat régler sur la scène pendant quelques minutes jusqu'à ce que la température et la concentration de CO ₂ stabiliser chaque fois après le montage de la boîte de culture ou de passer à une nouvelle région d'intérêt. Lasers de bloc à cette étape. Si le CO ₂ de contrôle ne sont pas disponibles, changer pour un CO ₂ médias indépendants juste avant l'imagerie, comme Leibovitz de la L-15.
      Remarque: moyen Phénol-rouge-free est recommandé pour déprimante fluorescence de fond.
2. Acquérir les images que dans le protocole 2. Toutefois, définissez un temps d'exposition approprié (généralement 25-50 ms pour PAmCherry1).
   Remarque: La densité de la molécule doit être inférieur à celui des cellules fixées de telle sorte que les trajectoires peuvent être enregistrées sans chevauchement avec l'autre. Les quelques dizaines déterminées de molécules est typique pour une acquisition de 256x256 pixels avec une taille de pixel d'environ 160 nm. La densité de puissance laser 561 nm a été réglée à 0,8 kW / cm ² afin de maintenir un bon rapport signal à bruit tout en diminuant la phototoxicité des cellules et l'augmentation de la longueur de trajectoire moyenne.
3. Traiter les images.
   1. Extrait coordonnées de molécules simples avec le paquet wfiread comme décrit dans le protocole 2, ou avec un autre paquet.
   2. Reconstruire les trajectoires des particules simples en utilisant différents seule particule de suivi (SPT) paquets basé sur des algorithmes différents trouvés²⁴ ailleurs. Note: Alternativement, cette étape peut être accompli en utilisant package Matlab maison construite (éventuellement disponibles dans les futures révisions à http://www.ohsu.edu/nan.
   3. Facultatif: Après la reconstruction, utiliser un package SPT ²⁴ pour calculer les constantes de déplacement et de diffusion des trajectoires. En outre, utiliser variationnelle Bayes suivi une particule (vbSPT) ²⁵ pour déterminer les États de diffusion des protéines cibles. emballage et la documentation vbSPT Matlab peuvent être trouvés à sa Sourceforge site officiel: http://vbspt.sourceforge.net/.

Résultats

L'exemple BiFC-PALM est montré KRAS mutant G12D interagir avec les Ras domaine de liaison (RBD) du CRAF (figure 1A). Comme on le verra, le RN ou fragments sont marqués RC à l'extrémité C-terminale de Ras, car il perturberait la localisation membranaire et donc l'activité biologique de Ras. Cela réduit les combinaisons possibles de huit à quatre (figure 1B). Chacune de ces quatre combinaisons a été introduit dans des cellules en utilisant U2OS infection lentivirale....

Discussion

BiFC est une technique couramment utilisée pour détecter et visualiser les cellules dans les IPP, alors que PALM est une technique de microscopie récent seule molécule à hyper-résolution nanométrique qui permet l'imagerie d'échantillons biologiques intacts. La combinaison de BiFC avec PALM atteint imagerie sélective des IPP dans une cellule avec une résolution spatiale de nanomètre et sensibilité unique molécule. BiFC-PALM étend l'utilité de ces deux techniques, et comme l'a démontré dan...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope frame	Nikon	Ti-U
60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA	Nikon	CFI Apo TIRF 60x H
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 897
561 nm laser	Opto Engine	MGL-FN-561
405 nm laser	Coherent	CUBE-405 50mW
561 nm dichroic mirror	Semrock	Di01-R405/488/561/635-25x36
561 nm filter	Semrock	FF01-525/45-25
405/561 nm notch filter	Semrock	NF01-405/488/568-25
Temperature and CO2 controlled stage	Tokai Hit	INUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS	Addgene	60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS	Addgene	60546
pcDNA3.2-DEST	Life Technologies	12489-019
pLenti-DEST	Addgene		http://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-531
In-Fusion HD Cloning	Clontech	639649
LR Clonase	Life Technologies	11791
Vira Power Lentivirus Packaging	Life Technologies	K497500
X-tremeGENE Transfection Reagent	Roche	13873800
Lab-Tek II Chambered Coverglass	Thermo Scientific	155409	#1.5 glass bottom dishes
U2OS cells	ATCC	HTB-96
293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
DMEM with phenol red	Life Technologies	11995
DMEM no phenol red	Life Technologies	21063
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082
Leibovit's L-15, no phenol red	Life Technologies	21083-027
Reduced serum medium	Life Technologies	31985
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	14040
Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe filter	Millipore	SLHV033RB
Lentiviral concentrator	Clontech	631231
Retroviral concentrator	Clontech	631455
10 cm culture dish	BD Biosciences	353003
6-well culture plate	BD Biosciences	353046
Polybrene	Sigma	107689
Puromycin	Life Technologies	A11138
G-418	Calbiochem	345812	Neomycin
Doxycyline	Fisher	BP2653
Tris base	Fisher	BP152
EDTA	Sigma	EDS
Sodium Hydroxide	Sigma	S5881
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Glutaraldehyde	Sigma	G6257
PIPES	Sigma	P6757
HEPES	Sigma	H4034
EGTA	Sigma	3777
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643
Potassium Hydroxide	Sigma	221473
Sodium chloride	Fisher	BP358
Magnesium chloride	Fisher	M33
100 nm gold particles	BBI Solutions	EM.GC100
Molecular grade water	Life Technologies	10977
Dpn1	New England Biolabs	R0176
PCR purification kit	Qiagen	28104
Miniprep kit	Qiagen	27104
Midiprep kit	Macherey-Nagel	740410
0.6 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-120
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-137
15 ml tubes	Fisher	05-539-12
5 ml polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352063
14 ml polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352059
50 ml tube	BD Biosciences	352070
PCR tube	GeneMate	C-3328-1
SOC medium	Life Technologies	15544
LB broth	BD Biosciences	244610
Kanamycin sulfate	Fisher	BP906
Competent cells	Life Technologies	C4040
Matlab	Mathworks