Fotoattivato localizzazione Microscopia con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC-PALM)

Riepilogo

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Abstract

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Introduzione

Interazioni proteina-proteina (PPI) sono fondamentali per la biologia ¹ e sono strettamente regolati attraverso meccanismi spazio-temporali attraverso molte tempo e lunghezza scale. Gli studi sulla segnalazione cellulare sulla membrana cellulare, ad esempio, hanno rivelato dinamici, scompartimenti spaziali nanoscala che facilitano PPI specifici e processi cellulari ^2. Quindi, la capacità di sondare PPI nei sistemi biologici con risoluzioni sufficienti spaziali e temporali, alta specificità e sensibilità elevata è la chiave per raggiungere una comprensione meccanicistica della biologia.

Biomolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) è uno dei pochi strumenti esistenti per la visualizzazione PPI in una cella con una risoluzione subcellulare e compatibilità live-cell ^3-5. La tecnica è relativamente semplice e comporta frazionamento di una proteina fluorescente in due frammenti non fluorescenti; quando geneticamente etichettati per due proteine ​​che interagiscono eportato in prossimità, i frammenti possono ricostituire per formare una proteina fluorescente completo, producendo segnale fluorescente. Se correttamente progettato, le sonde BiFC non dovrebbero ricostituire spontaneamente, in assenza di PPI. Come tale, il segnale di fluorescenza in un saggio BiFC sorgerà solo in presenza degli IPP, che consente la visualizzazione diretta degli IPP con elevata specificità. Ulteriori vantaggi di utilizzare la fluorescenza come la lettura sono alta sensibilità, risoluzione subcellulare, e compatibilità con l'alta produttività e alta test di screening di contenuti, tra gli altri. Per queste prestazioni, sono stati sviluppati una serie di sonde BiFC a base di proteine ​​fluorescenti genitore differenti. Come in tutte le altre tecniche di rilevazione basate sulla microscopia luce convenzionale, tuttavia, la risoluzione spaziale di BiFC è limitata a ~ 250 nm dalla diffrazione della luce. Questo lo rende una sfida per studiare la regolazione di PPI su scala nanometrica, che, come accennato in precedenza e esemplificato da un raft lipidici ⁶nd nanocluster Ras ^7, è una scala di lunghezza fondamentale per comprendere molti processi cellulari, come la segnalazione.

BiFC è stato combinato con la microscopia localizzazione fotoattivato ^(PALM) 8,9 per superare questo limite a risoluzione spaziale per l'imaging PPI ^10. PALM è una recente tecnica di microscopia Super Risoluzione che aggira il limite di diffrazione di imaging di fluorescenza attraverso l'attivazione stocastico e localizzazione subdiffractive di molecole fluorescenti singoli. In ogni ciclo di attivazione, una molecola fluorescente emette poche centinaia a qualche migliaio di fotoni e dà luogo ad una singola immagine Molecola sul rivelatore. Mentre l'immagine è diffrazione limitata (~ 250 nm in larghezza), il suo baricentro può essere determinata con precisione molto maggiore, tipicamente dell'ordine di 10-50 nm in funzione del numero di fotoni rilevati. Attivando e localizzare ogni molecola fluorescente del campione, una immagine ad alta risoluzione può essere ricostruita. Performed su cellule viventi, singola molecola tracking (all'SMT) PALM ulteriori permessi acquisizione di migliaia di traiettorie di diffusione proteine ​​da una singola ^cella 11. È importante sottolineare che, PALM utilizza sonde fluorescenti specializzati come proteine ​​fluorescenti fotoattivabile (PA-PQ) per ottenere l'attivazione stocastico. Dal momento che sia BiFC e proteine ​​fluorescenti uso PALM, sono stati combinati dividendo PAmCherry1, un comunemente usato PA-FP per PALM, in due frammenti tra aminoacidi 159 e 160.

Il sistema basato su PAmCherry1 BiFC scissione mostra basso segnale di fondo da ricostituzione spontanea dei due frammenti. Quando geneticamente etichettato ad una coppia di proteine ​​interagenti, i due frammenti (RN = residui 1-159; RC = Met + residui 160-236) ricostituito in modo efficiente per formare le proteine ​​complete PAmCherry1 anche a 37 ° C e senza incubazione a temperature più basse, che non è il caso per altre coppie BiFC ^12, come il genitore mCherry ^13. Furthermore, la proteina PAmCherry1 ricostituito mantenuto le proprietà fotofisiche del PAmCherry1 genitore, come l'elevato rapporto di contrasto, resa fotoni media, e fotoattivazione veloce, tra gli altri, che sono fondamentali per la localizzazione precisa di singola molecola e immagini ad alta risoluzione PALM.

In questo protocollo, l'uso di BiFC-PALM per l'imaging interazioni Ras-Raf in cellule U2OS utilizzando PAmCherry1 split (Figura 1A) è descritta. Il primo passo è quello di progettare i costrutti per l'espressione di proteine ​​di fusione tra i frammenti PAmCherry1 (cioè, RN e RC) e le proteine ​​di interesse. In teoria, per ogni coppia di proteine ​​candidati (A e B), vi sono otto coppie di proteine ​​di fusione da testare: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; e A-RC / B-RN. Spesso il processo può essere semplificato tenendo conto delle proprietà strutturali o biochimiche delle proteine ​​candidate. Nel caso di Ras, la proteina èpost-traduzionale modificato nella casella CAAX C-terminale (C = Cys; A = alifatici; X = qualsiasi), dopo di che il motivo AAX viene aperto fuori. Quindi, RN o RC possono essere fuse solo al N-terminale di Ras; Questo riduce il numero di coppie di proteine ​​di fusione di quattro (Figura 1B). Per Raf, dominio Ras vincolanti (RBD; residui 51-131) viene utilizzato e possono essere contrassegnati su entrambe le estremità. Sono stati generati Queste quattro configurazioni di fusione: RN-Kras / RC-Raf RBD; RN-Kras / Raf RBD-RC; RC-KRAS / RN-Raf RBD; e RC-KRAS / Raf RBD-RN.

Inoltre, il linker tra i frammenti e le proteine ​​di interesse deve essere considerato. Un linker flessibile di circa dieci amminoacidi è spesso usato in quanto fornisce sufficiente libertà per complementazione a verificarsi. Uno di questi è linker (GGGGS) x2, anche se ci sono molti altri che sono state applicate con successo, tra cui sequenze casuali generati da un sito di clonazione multipla (MCS) ^14. La lunghezza dei linker può avere bisogno di essere ottimizzato depending delle dimensioni delle proteine ​​di interesse e il loro orientamento quando interagenti.

I frammenti PAmCherry1 sono contenuti in una piccola spina dorsale di clonazione con accompagnamento MCSs (vedi Lista dei materiali). I geni di interesse possono essere inseriti attraverso i siti di restrizione o con un metodo di legatura indipendente. Dopo la verifica clonazione e la sequenza, la cassetta di espressione viene trasferito in un vettore di espressione mediante una reazione ricombinasi, un processo di clonazione con alta fedeltà e ad alta efficienza.

Successivamente, i costrutti di espressione risultanti vengono trasfettati nella linea cellulare di destinazione o, se una linea cellulare stabile è desiderato, confezionato in lentivirus per infettare la linea cellulare di destinazione. Trasfezione transitoria consente di convalida rapida delle configurazioni BiFC, ma i potenziali problemi deve essere notato. Trasfezione utilizzo di sostanze chimiche spesso sottolinea le cellule, con conseguente forte autofluorescenza; mentre l'uso di riflessione interna totale fluorescenza (TIRF) microscopy può attenuare questo segnale di fondo limitando il volume illuminazione, TIRF ideale quando le IPP avvengono sulla membrana cellulare. Inoltre, trasfezioni transienti portano spesso ad alti livelli di espressione della proteina, di gran lunga superiori a quelli delle proteine ​​endogene, che possono causare artefatti nel rilevare i PPI. Pertanto, si raccomanda che le linee cellulari stabili essere stabiliti dopo una configurazione BiFC appropriata è stata determinata attraverso prove iniziali. Linee cellulari stabili hanno anche la possibilità di espressione sintonizzabile tramite induzione doxiciclina ^15.

Dopo l'infezione, le cellule sono selezionate con antibiotici, tipicamente puromicina e neomicina, uno per ciascun costrutto. Le fasi successive per la preparazione del campione, l'acquisizione delle immagini, e l'analisi dei dati verranno descritti in dettaglio nei protocolli.

Con questo approccio, la formazione di cluster in nanoscala nelle immagini BiFC-PALM di Ras-Raf RBD sono comunemente osservati (Figura 2A </ strong>). Coerentemente, traiettorie SMT-PALM di Ras-Raf RBD mostrano una distribuzione eterogenea negli stati di diffusione (figura 2B-D). Questi risultati suggeriscono che esistono complessi Ras-Raf in più stati sulla membrana cellulare, presumibilmente come monomeri e cluster, con potenziali implicazioni biologiche. Questo lavoro dimostra la potenza di BiFC-PALM nell'imaging selettiva di PPI in cellule con nanometrica risoluzione spaziale e sensibilità singola molecola, che sarebbe difficile da ottenere con BiFC convenzionale, a fluorescenza co-localizzazione o la risonanza di fluorescenza trasferimento di energia (FRET).

Nel progettare gli esperimenti BiFC e interpretare i risultati, è importante tenere a mente che il processo è irreversibile BiFC nella maggior parte dei casi, di cui PAmCherry1 spaccato. Una volta che i due frammenti uniscono e formano una proteina PAmCherry1 completa, il collegamento tra i due frammenti, e quindi la PPI diventa permanente. Questo limita l'uso di BiFC e BiFC-PALM per monitorare la dinamica dei PPI (cioè, la cinetica di legame e non la dinamica di diffusione del complesso proteico volta che è formata) e, a volte potrebbe anche portare alla mislocalization dei complessi PPI.

Un ulteriore fattore da considerare nella progettazione di esperimenti BiFC-Palm è il ritardo nella maturazione cromoforo che è insita in proteine ​​fluorescenti. Dopo due proteine ​​interagiscono ei frammenti FP si incontrano, in genere ripiegare dell'ordine di secondi (primo tempo di 60 sec per EYFP ^3). Tuttavia, la successiva maturazione cromoforo e segnale fluorescente sviluppano dell'ordine di minuti. Mentre fluorescenza può essere rilevabile entro 10 minuti dopo la ricostituzione del split-Venere, un fast-pieghevole variante YFP, il primo tempo per la maturazione in generale è spesso circa 60 ^min 16. Split-PAmCherry1 è stato osservato ad avere tassi simili. Quindi, BiFC e BiFC-PALM sono scelte attualmente poveri per monitorare la cinetica PPI in tempo reale; altro mithods, come FRET e dimerizzazione recentemente sviluppato proteina fluorescente dipendente ^17, può essere più adatto per questo scopo.

Protocollo

1. Clonazione

1. Determinare le configurazioni per clonare e scegliere un linker. Proteine ​​tag con i frammenti sul N- o C-terminale come descritto di seguito in modo da non interrompere la loro localizzazione corretta. Utilizzare un linker flessibile come (GGGGS) x2.
2. Geneticamente contrassegnare le proteine ​​di interesse ai frammenti PAmCherry1. Come un'opzione, utilizzare i plasmidi clonazione elencate nella Lista dei materiali contenente il frammenti RN (residui PAmCherry1 1-159) e RC (Met più residui PAmCherry1 160-236) con sequenze fiancheggianti MCS.
   1. Linearizzare i plasmidi contenenti i frammenti RN e RC con inversa PCR (o restrizione digest) nel punto di inserimento. Primer per PCR inversa sono elencate nella Tabella 1. Di seguito è riportato un protocollo PCR esempio utilizzato nel laboratorio dell'autore (vedi elenco dei materiali per i materiali esatti utilizzati in questo protocollo).
      1. Mescolare la reazione PCR insieme, portato ad un volume finale di 50 ml con acqua: a parete sottiletubo ed PCR, aggiungere l'acqua, 25 ml di 2x master mix, 0,5 microlitri ciascuno dei primer in avanti e all'indietro (20 mM azionari diluita, 0,2 micron concentrazione finale), e 1 ng di modello. Utilizzare le seguenti condizioni di ciclo: 98 ° C per 30 sec, 30 cicli di 98 ° C per 7 sec e 68 ° C per 2 min, ed una estensione finale a 72 ° C per 10 min.
   2. PCR dei geni di interesse per l'inserimento di plasmidi linearizzate contenenti frammenti RN e RC. Eseguire la PCR come al punto 1.2.1 con il tempo di estensione a 68 ° C. Utilizzare primer con strapiombi che contengono una sequenza linker flessibile, come GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT per (GGGGS) x2, e 15 paia di basi omologia con le estremità della RN linearizzato e plasmidi RC per ricombinazione.
      Nota: I sbalzi di primer per le proteine ​​di interesse sono presentati nella tabella 2 se si utilizza i primer in tabella 1 per linearizzare la spina dorsale plasmide.
   3. Digerire la PCRreazione con Dpn1 per eliminare il template PCR. Aggiungere 0,5 ml di Dpn1 (20 U / mL) direttamente ai 50 ml di reazione PCR. Incubare a 37 ° C per 1 ora e calore inattivare a 80 ° C per 20 min. Se template di sfondo persiste nelle fasi successive, aumentare la quantità di enzimi o allungare il tempo di digestione.
   4. Purificare i prodotti di PCR con una colonna di spin come descritto dal produttore.
   5. Eseguire una reazione legatura indipendente per combinare un plasmide linearizzato contenente un infermiere o RC frammento con il gene di interesse. Misurare la concentrazione dei prodotti di PCR purificati: unire 50 ng di plasmide linearizzato e 50 ng del gene di interesse con 1 ml di enzima premix e portare il volume totale a 5 ml con acqua deionizzata. Incubare a 50 ° C per 15 min, posto su ghiaccio, e aggiungere 20 ml di tampone TE.
   6. Trasforma plasmidi ricombinanti in batteri competenti ^18.
   7. Selezionare 2-4 + (a piacere) colonie per O / N cultura. Aggiungere 5 mldi brodo LB e 5 ml di kanamicina (50 mg / ml di brodo) in una provetta a fondo rotondo 14 ml in polipropilene, e aggiungere la colonia batteri selezionato con un ciclo inoculo sterilizzata. Incubare a 37 ° CO / N agitando a 225 giri al minuto.
   8. Congelare 1 ml di O / N cultura per stock di glicerolo ^{19 e} Miniprep il resto come descritto dal produttore.
   9. Eseguire sequenziamento per determinare un buon clone. Se si utilizzano i plasmidi clonazione nella lista dei materiali, utilizzare M13 avanti e indietro primer (in reazioni separate) come necessario per ottenere la sequenza completa del costrutto di fusione. Confronto con la sequenza attesa utilizzando uno strumento di allineamento, come BLAST dal National Center for Biotechnology Information (NCBI) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
   10. Trasferire i costrutti sequenza verificata ad un plasmide di espressione attraverso una reazione ricombinasi.
       1. Aggiungere 75 ng della destinazione plasmide & #8212; quali pcDNA per trasfezioni transienti o Plenti per imballaggio lentivirali ²⁰ - e 50 ng della clonazione plasmide ricombinante a 1 ml di enzima premiscelato e portare il volume totale a 5 ml con acqua deionizzata. Incubare a 25 ° C per 1 ora, quindi aggiungere 5 ml di tampone TE.
          Nota: Per il confezionamento lentivirale e generazione linea cellulare stabile, utilizzare un diverso plasmide destinazione per ogni costrutto, per esempio, una resistenza puromicina e l'altra neomicina. Ciò consente di doppia selezione delle cellule trasdotte. Considerare anche il promotore per ciascuno, come il promotore del citomegalovirus costitutiva (CMV) per elevati livelli di espressione, o CMV con l'operatore per Teto espressione doxiciclina regolata sintonizzabile.
       2. Trasforma 5 ml in batteri competenti e Miniprep i plasmidi come nei passaggi 1.2.6 a 1.2.8, ma utilizzando l'antibiotico appropriato (tipicamente ampicillina).
3. Determinare la ottimaleConfigurazione BiFC.
   1. Co-trasfezione espressione plasmidi in cellule U2OS (o cella di scelta).
      1. Aggiungere 350 ml di fenolo DMEM-rosso liberi e senza antibiotico integrato con il 10% FBS in ogni pozzetto di un 8-bene # 1.5 vetrino camera inferiore. Piastra circa 7,5 x ¹⁰ 4 cellule per bene in modo cellule sono circa il 70% -90% confluenti il giorno successivo.
      2. Il giorno dopo la placcatura plasmidi di espressione, co-trasfezione con diverse configurazioni in ogni pozzetto usando il reagente preferita e come descritto dal produttore.
         1. Per ciascun pozzetto, aggiungere 125 ng di ciascun plasmide di espressione in 50 ml di mezzi ridotte senza siero in una provetta 0,6 ml e pipettare su e giù per mescolare. Aggiungere 1 ml di reagente di trasfezione lungo il centro del tubo e direttamente nel supporto. Agitare delicatamente per mescolare e lasciare che la reazione riposare per 30 minuti.
         2. Ridurre i media in ogni pozzetto del vetrino da camera di circa la metà. Aggiungere goccia a goccia miscela di trasfezione ai pozzetti e agitare gtemente per mescolare. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO _{2 per} 24-48. Modificare i media il giorno dopo la trasfezione.
   2. Celle di immagine su un microscopio a fluorescenza, come nel protocollo 2 che iniziano con il passaggio 2.1.4.
      Nota: Il campione può essere stampato su un microscopio a fluorescenza standard se i livelli di espressione sono alti e la fotocamera è abbastanza sensibile per l'emissione di fotoni relativamente bassa di PAmCherry1. Molecole PAmCherry1 ricostituiti possono essere attivate con un set di filtri ultravioletti (405 nm) prima di imaging con una di eccitazione verde (561 nm) set di filtri.
4. Se del caso, creare un controllo negativo, ad esempio, l'introduzione di una mutazione puntiforme in una delle proteine ​​di interesse che interrompono l'interazione. Eseguire una mutagenesi sito-diretta ²¹ sul plasmide clonazione della proteina da mutato e della configurazione scelta.
5. Genera una linea cellulare stabile confezionamento costrutti in viraleparticelle e infettare le cellule U2OS (o linea cellulare di scelta). Si consideri un sistema inducibile (tetracicline) espressione ¹⁵ così espressione può essere indotta prima di imaging se irreversibilità prolungata di BiFC è un problema, o se l'espressione sintonizzabile è desiderato.
   ATTENZIONE: Lavorare con i virus è classificato come livello di biosicurezza 2. Mentre le recenti generazioni di sistemi di confezionamento virali hanno notevolmente ridotto la probabilità di produrre virus capaci di replicazione, alcuni rischi sono ancora presenti. I riferimenti possono essere trovati a http://www.cdc.gov/biosafety/publications/.
   1. Ripetere il punto 1.2.10 utilizzando una destinazione vettore retrovirale lenti- o ^20. Aumentare il / cultura O N per 100 ml per un midiprep e una maggiore purezza dei plasmidi.
   2. Il 1 ° giorno: Piatto circa 2 x 10 ⁶ 293T / 17 cellule in un piatto 10 cm per ogni costrutto da confezionare.
   3. Il giorno 2: Preparare una reazione trasfezione con un menù tradizionalereagente nsfection di scelta e come descritto dal produttore.
      1. Preparare una premiscela di imballaggio plasmidi con concentrazioni finali di 250 ng / ml per plasmidi Confezioni 1 e 2, e 100 ng / ml per il confezionamento plasmide 3 in acqua sterile. Aggiungere 10 ml di premiscelato imballaggio plasmide e 2,5 microgrammi di plasmide obiettivo di 1 ml di mezzi ridotti senza siero in 5 ml in polipropilene tubo a fondo rotondo e pipetta su e giù per mescolare. Aggiungere 20 ml di reagente di trasfezione lungo il centro del tubo e direttamente nel supporto.
         1. Agitare delicatamente per mescolare e incubare a temperatura ambiente per 30 min. Rimuovere circa la metà dei mezzi dalle cellule e aggiungere la miscela di trasfezione in maniera goccia a goccia. Agitare delicatamente per mescolare e incubare a 37 ° C e 5% di CO _2. Incubare 10 ml di supporti per piastra in una provetta con tappo allentato temperatura e CO ₂ equilibrazione.
      2. Il giorno 3: cambia delicatamente la media con i media pre-incubati e return per le cellule per l'incubatore. Incubare un altro tubo di media con il tappo allentato.
         Nota: sincizi, o la formazione di grandi cellule di multi-nucleate, può essere un segno che l'imballaggio sta andando bene. Tuttavia, le cellule sono in uno stato fragile e può essere facilmente rimosso. Quando cambia il supporto, inclinare il pipettatore modo che sia orizzontale e aggiungere goccia a goccia in un supporto bordo della piastra.
      3. Il giorno 4: raccogliere il virus rimuovendo il materiale con una siringa e filtrando attraverso un filtro con 0,45 micron pori in una provetta pulita da 50 ml. Sostituire delicatamente i mezzi di comunicazione con i media pre-incubate.
      4. Il giorno 5: Raccolta di nuovo come fatto in precedenza al punto 1.5.3.3 e combinare filtrato comune nello stesso tubo da 50 ml. Aggiungere 6 ml di concentratore virus per ciascuna provetta e mescolare. Conservare a 4 ° C per almeno 24 ore fino a quando i precipitati virus.
         Nota: A seconda della salute delle cellule, virus può essere raccolto un terzo tempo.
      5. Concentrare il virus per centrifugazione a 1.500 xgper 15 min a 4 ° C. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 250 ml di media. Virus può essere utilizzato immediatamente per infezione o conservato in aliquote di 50 microlitri a -80 ° C fino a un anno.
      6. Piatto circa 3 x 10 ⁵ U2OS (o target) cellule per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti (2 ml di DMEM con 10% FBS per pozzetto) per infezione, in modo cellule sono circa il 50% confluenti al momento dell'infezione.
      7. Il giorno seguente, rimuovere circa la metà della media in modo circa 1 ml resti. Coinfect con 50 ml di virus concentrati per ogni costrutto. Aggiungere 1 ml di polibrene (8 mg / ml) in ciascun pozzetto. Incubare a 37 ° C e 5% CO _2. Cambiare media il giorno successivo e incubare per un altro giorno prima selezione antibiotica.
         Nota: La quantità di virus da aggiungere può variare a seconda del tasso desiderato di infezione. I virus possono essere titolati utilizzando qRT-PCR.
      8. Aggiungere antibiotici selezionare per cellule infette. Pozzetti separati con cellule non infettate che non hanno visto virus sono tenuti come canarini per testare l'efficacia della selezione. Incubare per 2-7 giorni, o fino a quando la selezione è completa.
         Nota: Le concentrazioni efficaci dovrebbero essere titolati inizialmente, ma sono tipicamente 1,0 ug / ml di puromicina e 1,0 mg / ml di neomicina.
      9. Espandere le cellule in una più grande 10 centimetri piatto e procedere al protocollo 2.

2. Imaging fisso Celle

1. Preparare un campione per l'imaging
   1. Pulire 8 e # 1.5 fondo di vetro scorrevole camera aggiungendo 250 ml di 1 M NaOH per almeno 1 ora e lavare con PBS.
      Nota: camera di diapositive non trattati tipicamente provocano alto segnale di fondo. Inoltre, le cellule possono essere sensibili a residuo NaOH e la mancata pulire accuratamente la superficie di vetro (fino a 10x lavaggi) possono rendere difficile l'adesione cellulare. Se necessario, incubare il vetrino camera pulita con PBS O / N dopo il lavaggio. Per le linee cellulari sensibili, placcatura ad una densità più alta(Ad esempio, al 50% -60% di confluenza iniziale) può aiutare.
   2. Piatto circa 5,5 x 10 ^{4 delle} cellule U2OS espressione stabile per pozzetto in 350 ml di fenolo DMEM senza rosso con il 10% FBS in modo che le cellule sono sane e non oltre confluente quando l'imaging.
   3. Effettuare trattamenti necessari per l'esperimento, come l'aggiunta di tetraciclina per indurre l'espressione della proteina.
   4. Fissare le cellule immediatamente prima di imaging.
      1. Prima della fissazione, preparare la soluzione paraformaldeide fresca (PFA) - 3,7% PFA in 1x PHEM con 0,1% glutaraldeide (GA). Per 10 ml di soluzione PFA, pesare 0,37 g di PFA e trasferire in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 1 ml di acqua distillata e 30 ml di 1 M NaOH e vortex. Il calore a 70 ° C e vortice ogni 1-2 minuti fino a quando PFA è completamente sciolto.
      2. Trasferimento sciolto PFA a un tubo da 15 ml e aggiungere 3,8 ml di acqua distillata, 5 ml di 2x tampone PHEM, 20 ml di 25% glutaraldeide, e agitare per miscelare. Archivio, tampone PHEM 2x è 120 TUBI mM, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA, e 16 mM MgSO _4, con pH regolato a 7,0 con 10 M KOH. Questa soluzione fissativo può essere conservato a 4 ° C per diversi giorni.
         ATTENZIONE: PFA e GA sono entrambi pericolosi. Preparare la soluzione in una cappa aspirante e indossare attrezzatura di protezione durante la manipolazione di sostanze chimiche entrambi. Evitare l'inalazione o contatto cutaneo diretto.
      3. Rimuovere il mezzo di crescita. Lavare rapidamente con 500 ml di PBS e aggiungere 250 ml di fissativo PFA per pozzetto. Incubare le cellule per 20 minuti a RT.
   5. Rimuovere il fissativo PFA dal campione e aggiungere 350 ml di PBS o di tampone di immagini (100 mM Tris con 30 mM NaCl e 20 mM MgCl _2, pH 8,5) per pozzetto.
   6. Vortex 100 particelle d'oro nm a rompere gli aggregati e aggiungere 35 microlitri per bene (10x finale diluizione) per il monitoraggio fase deriva durante l'imaging.
2. Acquisire le immagini
   1. Accendere il microscopio. Accendere i 405 e 561 nm laser, ma tenere le persiane(interna o esterna) chiuso a questo punto. Accendere la fotocamera EMCCD e lasciarlo raffreddare. Assicurarsi che i 561 nm filtri sono a posto.
   2. Aprire il software di acquisizione e impostare il tempo di esposizione di 100 msec e il guadagno EMCCD di 300 (range 1 - 1000).
   3. Aggiungere olio di immersione con l'obiettivo e fissare il campione al palco microscopio.
   4. Con entrambi campo chiaro o il laser 561 nm su (~ 1 kW / cm ^2), trasferire il campione a fuoco.
   5. Per l'imaging di Ras e di altre proteine ​​di membrana, utilizzare un obiettivo 60X apochromat TIRF con 1.49 apertura numerica e portare il microscopio nella configurazione TIRF. Regolare il laser di eccitazione in modo che sia decentrato quando colpisce l'apertura posteriore dell'obiettivo TIRF; questo fa sì che il laser a deviare raggiungimento campione. Mantenere la regolazione del laser fino a raggiungere l'angolo critico e il laser viene riflessa. Ricerca di una cella di un'immagine con più particelle d'oro in vista. Impostare una regione di interesseche racchiude la cella (o una regione all'interno della cellula) e le particelle di oro.
      Nota: TIRF diminuisce la profondità di penetrazione del laser di eccitazione e riduce il segnale di fuori fuoco sfondo. Inoltre, la correzione della deriva rischia di essere più precisi quando altre particelle d'oro sono in vista.
   6. Se disponibile, impegnare il sistema di autofocus per correggere la deriva campione nella direzione z. In caso contrario, regolare la messa a fuoco manualmente durante l'acquisizione se l'immagine va fuori fuoco.
   7. Iniziare con l'acquisizione nm laser 405 off e il laser 561 nm su (~ 1 kW / cm ²⁾ in caso di attivazione avviene già sufficiente (tipicamente se i livelli di espressione sono elevati). Altrimenti, accendere il nm laser 405 sulla potenza di fabbrica più basso (0,02 mW o 0,01 W / cm ²⁾ e aumentare gradualmente (0,1 mW alla volta) come necessario fino esistono diverse decine di molecole per fotogramma o che singole molecole sono ben separati.
   8. Mentre l'acquisizione dei dati continua, graddualmente aumentare potenza del laser 405 nm per mantenere la densità del punto più o meno costante.
      Nota: In basso a potenza di eccitazione 405 nm, alcuni PAmCherry1 può già essere attivato. Poiché queste molecole photobleach, la popolazione di rimanere molecole PAmCherry1 fotoattivabile diminuisce, richiedendo un flusso di fotoni elevato per mantenere la stessa densità di molecole che emettono fluorescenza in ciascun frame.
   9. Continuare fino a quando l'acquisizione di immagini ad alta potenza 405 nm (2,5-10 W / cm ²⁾ non attiva più eventi di attivazione.
      Nota: Il tempo totale di acquisizione dipende dal livello di espressione e l'efficienza del complementazione.
3. Elaborare le immagini
   Nota: Ci sono molte opzioni di software open source per l'elaborazione delle immagini. Esempi sono Temporale (https://code.google.com/p/thunder-storm/) e QuickPALM (https://code.google.com/p / quickpalm /). Le procedure tipiche trattamento dei dati sono brevemente illustrati qui utilizzando un pacchetto Matlab personalizzata denominata wfiread per elaborare dati PALM come esempio. Tuttavia, le revisioni future non esattamente seguire ciò che è descritto qui. Per l'elaborazione delle immagini con altri software, consultare la documentazione utente.
   1. Scaricare il software di elaborazione delle immagini (file di codice supplementare) o la versione più recente di http://www.ohsu.edu/nan. Aprire Matlab e caricare il software wfiread (che è già messo nel percorso predefinito).
   2. Visualizza la sequenza di immagini raw e determinare la regione di interesse. Selezionare l'area dello stack da lavorare cliccando con il tasto sinistro e trascinando un riquadro intorno all'area desiderata. Se la regione di interesse non è stata ridotta durante l'acquisizione (a circa 256x256 pixel), selezionare un'area più piccola per diminuire il tempo di calcolo. Per deselezionare un'area ed elabora l'intera struttura, fare clic destro ovunque in the immagine.
   3. Inserire l'intervallo di fotogrammi da elaborare.
   4. Selezionare una particella d'oro (uno che è isolato e uniforme in forma) cliccando con il tasto sinistro sull'immagine e trascinando un piccolo riquadro. Sotto particelle Monitoraggio, fare clic sul pulsante Track. Apparirà un grafico che mostra la posizione della particella dell'oro selezionato attraverso la pila di immagini, raffigurante la misura della deriva.
   5. Ripetere questo processo per rintracciare il maggior numero di particelle d'oro possibili e determinare quelli che tracciano insieme (le particelle saranno codice colore). Idealmente la deriva complessiva è dell'ordine di un pixel al massimo.
   6. Selezionare singolarmente le particelle d'oro che monitorati insieme una alla volta e fare clic sul pulsante Aggiungi marcatore sotto Particle inseguimento. Una croce verde apparirà a indicare che è stata aggiunta come un marcatore e sarà utilizzato per correggere la deriva.
   7. Regolare la gamma Sigma, Smoothing Threshold Range e, se necessario, modificando i valori leggermente. Fare clic sul Particle Trovapulsante per verificare le impostazioni. Le particelle che verranno elaborati saranno inscatolati e quelli che non sono saranno lasciati fuori. Le molecole PAmCherry1, particelle che sono relativamente rotondo e brillante, devono essere selezionati.
   8. Avviare l'elaborazione delle immagini, fare clic sul pulsante Coord Crea file e salvare il file.
      Nota: il programma passerà attraverso ogni fotogramma all'interno della gamma telaio definito, trovare tutti i punti fluorescenti, ed eseguire il montaggio gaussiana per trovare le coordinate centroide. Un file .cor verrà generato memorizzare tutte le coordinate e gli altri parametri di montaggio delle immagini di singola molecola elaborate.
4. Post-processo le immagini e rendono l'immagine PALM
   Nota: Altri software possono rendere direttamente l'immagine dopo l'estrazione di coordinate.
   1. In Matlab, avviare il pacchetto 'palme' e caricare il file .cor appena creato.
   2. Prima di pronunciare l'immagine PALM utilizzando le coordinate, ordinare le singole coordinate (ciascuna da un 'localizatisu evento '). I valori di ordinamento ottimali possono variare a seconda della configurazione e fluoroforo.
      1. Per PAmCherry1, utilizzare i seguenti valori: Combinando Frame - 8; Combinando Distanza (nm) - 100; RMS minimi - 4; Fit minima Bontà - 0.25; e Max. Eccentricità - 1.4. Vedi la sezione di discussione per ulteriori spiegazioni di questi parametri.
   3. Fare clic sul pulsante Ordina per generare un nuovo insieme di coordinate pronte per il rendering di immagini ad alta risoluzione.
   4. Immettere i valori per una corretta rappresentazione dell'immagine finale, come il formato grezzo pixel (nm), la dimensione del tratto desiderato (nm) nell'immagine di rendering, e la dimensione dei pixel per l'immagine di rendering.
      Nota: la dimensione dei pixel crudo deve essere determinata per ogni installazione. La dimensione dell'elemento di rendering può essere impostata arbitrariamente, ma è tipicamente impostata ad un valore leggermente superiore alla precisione media localizzazione. Per PAmCherry1, la precisione media localizzazione è di circa 18 nm, quindi una dimensione del tratto 20-30 nm è appropriate. Da notare, la precisione di localizzazione è stato calcolato prendendo la deviazione standard delle localizzazioni della stessa molecola su più fotogrammi ²² e non dividendo il limite di diffrazione con la radice quadrata del numero di fotoni rilevati. Per quanto riguarda la dimensione in pixel dell'immagine di rendering, 10 nm è un buon punto di partenza; impostazione di un valore troppo basso si tradurrà in file di immagini inutilmente grandi per le viste non ingrandita.
   5. Fare clic sul pulsante Rendering per generare l'immagine PALM. Utilizzare le icone +/- ingrandimento nella barra degli strumenti della finestra cifra per ingrandire e rimpicciolire.
   6. Opzionale: Eseguire l'analisi di cluster dell'immagine PALM ricostruita utilizzando test di K di Ripley o altri meccanismi, come la simulazione assistita DBSCAN (SAD) ^23. Nota: Nel pacchetto di palma personalizzato, sia K di Ripley e analisi SAD sono già costruite in; per le coordinate generate da altri software, le stesse analisi possono essere eseguite con l'aggiunta di script personalizzati.

3. singola molecola di monitoraggio in cellule vive

1. Trattare la superficie di coltura tissutale e piastra le cellule come descritto nel protocollo 2. Poiché la temperatura e / o CO _{2 stadi} controllata può richiedere un certo piatto di coltura, assicurarsi assicurarsi che il coprioggetti ha lo spessore adeguato (0.17 mm) per l'impostazione microscopia.
   1. Trasfettare cellule se facendo un'espressione transiente ed eseguire eventuali trattamenti necessari per l'esperimento, come tetraciclina per indurre l'espressione, e incubare come necessario. Questo è anche lo stesso come descritto nel protocollo 2.
   2. Porre la capsula cultura su un incubatore sul palco. Lasciate che il piatto si depositano sul palco per qualche minuto fino a quando la temperatura e la concentrazione di CO ₂ stabilizzare ogni volta dopo aver montato il piatto cultura o lo spostamento di una nuova regione di interesse. I laser di blocco di questo passo. Se CO ₂ di controllo non è disponibile, passare a una _di CO 2 media indipendenti a destra prima di imaging, come Leibovdi itz L-15.
      Nota: medio fenolo-rosso-libero è raccomandato per sfondo deprimente fluorescenza.
2. Acquisire le immagini come nel protocollo 2. Tuttavia, impostare un tempo di esposizione appropriato (tipicamente 25-50 msec per PAmCherry1).
   Nota: La densità molecola deve essere inferiore di cellule fissate in modo che le traiettorie possono essere registrati senza sovrapporsi tra loro. Le poche decine di molecole specificati è tipico per un'acquisizione 256x256 pixel in una dimensione di pixel di circa 160 nm. La densità di potenza laser 561 nm è stato fissato a 0,8 kW / cm ² per mantenere un buon rapporto segnale-rumore riducendo la fototossicità alle cellule e aumentando la lunghezza media traiettoria.
3. Elaborare le immagini.
   1. Estrarre coordinate di singole molecole con il pacchetto wfiread come descritto nel protocollo 2, o con un altro pacchetto.
   2. Ricostruire traiettorie delle particelle singole utilizzando varie singola particella tenere traccia dei pacchetti (SPT) in base a diversi algoritmi trovatialtrove ^24. Nota: In alternativa, questa operazione può essere effettuata utilizzando il pacchetto Matlab casa costruita (forse disponibile a future revisioni a http://www.ohsu.edu/nan.
   3. Opzionale: Dopo la ricostruzione, utilizzare un pacchetto SPT ²⁴ per il calcolo di spostamento e di diffusione costanti dalle traiettorie. Inoltre, utilizzare variazionale Bayes singola particella tracking (vbSPT) ²⁵ per determinare gli stati di diffusione delle proteine ​​bersaglio. Pacchetto e la documentazione vbSPT Matlab sono disponibili sul suo sito Sourceforge ufficiale: http://vbspt.sourceforge.net/.

Risultati

L'esempio BiFC-PALM mostrata è KRAS G12D mutante interagire con Ras legame dominio (RBD) del CRAF (Figura 1A). Come discusso, la RN o frammenti RC non contrassegnati al C-terminale di Ras perché interromperebbe la localizzazione di membrana e quindi l'attività biologica di Ras. Questo riduce le possibili combinazioni da otto a quattro (Figura 1B). Ciascuno di questi quattro combinazioni stato introdotto in cellule U2OS utilizzando infezione lentivirale. Le cellule sono state ...

Discussione

BiFC è una tecnica comunemente usata per il rilevamento e la visualizzazione PPI nelle cellule, mentre PALM è una recente tecnica di microscopia molecola SuperResolution unico che permette l'imaging su nanoscala di campioni biologici intatti. La combinazione di BiFC con PALM raggiunto l'imaging selettivo di PPI all'interno di una cella con nanometrica risoluzione spaziale e sensibilità singola molecola. BiFC-PALM estende l'utilità di entrambe le tecniche, e come dimostrato in questo lavoro, mostra un...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope frame	Nikon	Ti-U
60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA	Nikon	CFI Apo TIRF 60x H
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 897
561 nm laser	Opto Engine	MGL-FN-561
405 nm laser	Coherent	CUBE-405 50mW
561 nm dichroic mirror	Semrock	Di01-R405/488/561/635-25x36
561 nm filter	Semrock	FF01-525/45-25
405/561 nm notch filter	Semrock	NF01-405/488/568-25
Temperature and CO2 controlled stage	Tokai Hit	INUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS	Addgene	60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS	Addgene	60546
pcDNA3.2-DEST	Life Technologies	12489-019
pLenti-DEST	Addgene		http://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-531
In-Fusion HD Cloning	Clontech	639649
LR Clonase	Life Technologies	11791
Vira Power Lentivirus Packaging	Life Technologies	K497500
X-tremeGENE Transfection Reagent	Roche	13873800
Lab-Tek II Chambered Coverglass	Thermo Scientific	155409	#1.5 glass bottom dishes
U2OS cells	ATCC	HTB-96
293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
DMEM with phenol red	Life Technologies	11995
DMEM no phenol red	Life Technologies	21063
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082
Leibovit's L-15, no phenol red	Life Technologies	21083-027
Reduced serum medium	Life Technologies	31985
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	14040
Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe filter	Millipore	SLHV033RB
Lentiviral concentrator	Clontech	631231
Retroviral concentrator	Clontech	631455
10 cm culture dish	BD Biosciences	353003
6-well culture plate	BD Biosciences	353046
Polybrene	Sigma	107689
Puromycin	Life Technologies	A11138
G-418	Calbiochem	345812	Neomycin
Doxycyline	Fisher	BP2653
Tris base	Fisher	BP152
EDTA	Sigma	EDS
Sodium Hydroxide	Sigma	S5881
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Glutaraldehyde	Sigma	G6257
PIPES	Sigma	P6757
HEPES	Sigma	H4034
EGTA	Sigma	3777
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643
Potassium Hydroxide	Sigma	221473
Sodium chloride	Fisher	BP358
Magnesium chloride	Fisher	M33
100 nm gold particles	BBI Solutions	EM.GC100
Molecular grade water	Life Technologies	10977
Dpn1	New England Biolabs	R0176
PCR purification kit	Qiagen	28104
Miniprep kit	Qiagen	27104
Midiprep kit	Macherey-Nagel	740410
0.6 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-120
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-137
15 ml tubes	Fisher	05-539-12
5 ml polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352063
14 ml polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352059
50 ml tube	BD Biosciences	352070
PCR tube	GeneMate	C-3328-1
SOC medium	Life Technologies	15544
LB broth	BD Biosciences	244610
Kanamycin sulfate	Fisher	BP906
Competent cells	Life Technologies	C4040
Matlab	Mathworks