Fotoactivado Localization Microscopy com Bimolecular Fluorescência de Complementação (BiFC-PALM)

Resumo

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Resumo

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 °C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Introdução

Interações proteína-proteína (IBP) são fundamentais para a biologia ¹ e sejam estritamente regulado através de mecanismos de espaço-temporais em muitas escalas de tempo e comprimento. Estudos sobre a sinalização celular na membrana celular, por exemplo, revelaram, compartimentos espaciais em nanoescala dinâmicos que facilitam PPIs específicas e processos celulares ^2. Assim, a capacidade de sondar os IPP em sistemas biológicos com resoluções suficientes espaciais e temporais, alta especificidade e alta sensibilidade é fundamental para alcançar um entendimento mecanicista da biologia.

Bimolecular fluorescência complementação (BiFC) é uma das poucas ferramentas existentes para visualizar PPIs em uma cela com resolução subcelular e compatibilidade de células viver ^3-5. A técnica é relativamente simples e envolve a divisão de uma proteína de fluorescência em dois fragmentos não fluorescentes; quando geneticamente marcado para duas proteínas interagem etrazida para a proximidade, os fragmentos podem reconstituir, para formar uma proteína fluorescente completa, obtendo-se o sinal fluorescente. Quando projetado corretamente, as sondas BiFC não deve reconstituir espontaneamente na ausência de PPIs. Como tal, o sinal de fluorescência num ensaio de BiFC só surgem, na presença de IPP, o que permite a visualização directa dos IPP com alta especificidade. Os benefícios adicionais da utilização de fluorescência como a leitura são de alta sensibilidade, resolução subcelular, e compatibilidade com alto rendimento e alta ensaios de rastreio de conteúdo, entre outros. Para estes benefícios, foram desenvolvidos um número de sondas diferentes com base em BiFC proteínas fluorescentes pai. Tal como em todas as outras técnicas de detecção baseadas em microscopia óptica convencional, no entanto, a resolução espacial de BiFC é limitada a ~ 250 nm pela difracção da luz. Isto o torna um desafio para estudar a regulação dos IPP em nanoescala, que, como referi anteriormente e exemplificados por jangadas lipídicas ⁶ and Ras nanoclusters ^7, é uma escala de comprimento crítico para a compreensão de muitos processos celulares, tais como sinalização.

BiFC foi combinada com microscopia localização fotoactivado ^(PALM) 8,9 para superar este limite em resolução espacial para a imagem latente PPIs ^10. PALM é uma recente técnica de microscopia SuperResolution que contorna o limite de difração em imagens de fluorescência através da ativação estocástica e localização subdiffractive de moléculas fluorescentes individuais. Em cada ciclo de activação, uma molécula fluorescente emite de algumas centenas a alguns milhares de fotões e dá origem a uma única molécula de imagem no detector. Quando a imagem é limitado por difracção (~ 250 nm de largura), a sua centróide pode ser determinada com muito maior precisão, tipicamente na ordem de 10-50 nm, dependendo do número de fotões detectados. Através da activação e localização de cada molécula fluorescente na amostra, imagem de alta resolução pode ser reconstruído. Performed em células vivas, monitoramento molécula única (smt-) PALM novas autorizações de aquisição de milhares de trajetórias de difusão proteína a partir de uma única célula ^11. Importante, PALM utiliza sondas fluorescentes especializados, tais como proteínas fluorescentes fotoactiv�eis (PA-FPS) para conseguir a ativação estocástica. Uma vez que tanto BiFC e proteínas fluorescentes uso PALM, eles foram combinados, dividindo PAmCherry1, um comumente usado PA-FP para PALM, em dois fragmentos entre os aminoácidos 159 e 160.

O sistema baseado em PAmCherry1 BiFC dividido mostra baixo sinal de fundo a partir de reconstituição espontânea dos dois fragmentos. Quando geneticamente marcado para um par de proteínas que interagem, os dois fragmentos (RN = resíduos 1-159; RC = MET + resíduos 160-236) reconstituído para formar de forma eficiente proteínas PAmCherry1 completa mesmo a 37 ° C e sem incubação a temperaturas mais baixas, o que Não é o caso de outros pares BiFC ^12, tais como o pai mCherry ^13. Furthermore, a proteína PAmCherry1 reconstituído manteve as propriedades fotofísicas da PAmCherry1 pai, como a alta taxa de contraste, o rendimento médio de fótons, e fotoativação rápido, entre outros, que são críticos para precisas de localização única molécula e de alta resolução de imagem PALM.

Neste protocolo, o uso de BiFC-PALM para imagiologia interações Ras-Raf em células U2OS usando divisão PAmCherry1 (Figura 1A) é descrito. O primeiro passo consiste em conceber as construções para expressar proteínas de fusão entre fragmentos PAmCherry1 (isto é, RN e RC) e as proteínas de interesse. Em teoria, para cada par de proteínas candidatas (A e B), existem oito pares de proteínas de fusão a ser testada: RN-A / RC-B; RN-A / B-Rc; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; e A-RC / B-RN. Este processo muitas vezes pode ser simplificada, tendo em conta as propriedades estruturais ou bioquímicas das proteínas candidatas. No caso de Ras, a proteína émodificada após tradução na caixa CAAX C-terminal (C = Cys; A = alifático; X = qualquer), após o que o motivo AAX é clivada. Assim, RN ou RC só pode ser fundido ao N-terminal de Ras; Isto reduz o número de pares de proteínas de fusão para quatro (Figura 1B). Para Raf, domínio de ligação a Ras (RBD; resíduos 51-131) é usado e pode ser marcado em cada extremidade. Esses quatro configurações de fusão foram gerados: RN-Kras / RC-Raf RBD; RN-Kras / Raf RBD-RC; RC-Kras / RN-Raf RBD; e RC-Kras / Raf RBD-RN.

Além disso, o ligante entre os fragmentos e as proteínas de interesse terão de ser consideradas. Um ligante flexível de cerca de dez aminoácidos é frequentemente utilizado como proporciona liberdade suficiente para complementação de ocorrer. Um tal ligante é (GGGGS) x2, embora existam muitos outros que foram aplicadas com êxito, incluindo seqüências aleatórias geradas a partir de um local de clonagem múltipla (MCS) ^14. O comprimento dos elementos de ligação podem precisar de ser optimizada depending do tamanho das proteínas de interesse e que interagem quando as suas orientações.

Os fragmentos PAmCherry1 estão contidos em um pequeno backbone clonagem com flanqueando MCSs (ver Lista de Materiais). Os genes de interesse pode ser inserido através dos locais de restrição ou com um método independente da ligadura. Após a clonagem e sequência de verificação, a cassete de expressão é transferido para um vector de expressão, utilizando uma reacção de recombinase, um processo de clonagem com alta fidelidade e alta eficiência.

Em seguida, as construções de expressão resultantes são transfectados para a linha de células alvo ou, se uma linha celular estável é desejada, empacotado em lentivírus para infectar a linha de células alvo. Transfecção transiente permite a validação rápida das configurações BiFC, mas os potenciais problemas devem ser observados. Transfecção utilizando produtos químicos frequentemente sublinha as células, resultando em alta autofluorescência; enquanto que a utilização de um total de fluorescência de reflexão interna (TIRF) microscoaa pode mitigar este sinal de fundo, limitando o volume iluminação, TIRF ideal quando os PPIs ocorrem na membrana da célula. Além disso, transfecções transientes muitas vezes levar a elevados níveis de expressão da proteína, muito superiores às das proteínas endógenas, o que pode causar artefactos na detecção do IPP. Assim, recomenda-se que as linhas celulares estáveis ​​após ser estabelecida uma configuração apropriada BiFC foi determinada através de ensaios iniciais. Linhas de células estáveis ​​também têm o potencial para a expressão sintonizável através da indução de doxiciclina ^15.

Após a infecção, as células são seleccionadas com antibióticos, tipicamente puromicina e neomicina, um para cada constructo. Os passos subsequentes de preparação das amostras, a aquisição de imagem e análise de dados será descrito em detalhe nos protocolos.

Com esta abordagem, a formação de clusters em nanoescala em imagens BiFC-palma da Ras-Raf RBD são rotineiramente observados (Figura 2A </ strong>). Consistentemente, trajetórias smt-palma da Ras-Raf RBD apresentam uma distribuição heterogênea nos estados de difusão (Figura 2B-D). Estes resultados sugerem que os complexos de Ras-Raf existir em vários estados na membrana celular, presumivelmente como monómeros e aglomerados, com potenciais implicações biológicas. Este trabalho demonstra o poder da BiFC-PALM em imagem seletiva de PPIs em células com resolução espacial nanométrica e sensibilidade única molécula, o que seria difícil de obter com BiFC convencional, fluorescência co-localização, ou a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET).

Ao projetar experimentos BiFC e interpretação dos resultados, é importante ter em mente que o processo é irreversível BiFC na maioria dos casos, incluindo PAmCherry1 divisão. Uma vez que os dois fragmentos se combinar e formar uma proteína PAmCherry1 completo, a ligação entre os dois fragmentos, e, assim, torna-se permanente do PPI. Isto limita a utilização de BiFC e BiFC-PALM para monitorar a dinâmica dos PPIs (ou seja, cinética de ligação e não a dinâmica de difusão do complexo de proteína, uma vez que é formado) e às vezes pode até mesmo levar à mislocalization dos complexos PPI.

Um fator adicional a considerar ao projetar experimentos BiFC-palma é o atraso na maturação cromóforo que é inerente a proteínas fluorescentes. Uma vez que duas proteínas interagem e os fragmentos de PF vêm juntos, eles tipicamente redobre na ordem de segundos (tempo de meia 60 seg para EYFP ^3). No entanto, a maturação e posterior cromóforo sinal fluorescente desenvolver na ordem de minutos. Embora a fluorescência pode ser detectável dentro de 10 min após a reconstituição de split-Vénus, uma variante rápido dobrar-YFP, a meia-hora para a maturação, em geral, é muitas vezes cerca de 60 min ^16. Split-PAmCherry1 foi observada a ter taxas similares. Assim, BiFC e BiFC-PALM são escolhas atualmente pobres para monitorar cinética PPI em tempo real; outro methods, tais como a dimerização de FRET e uma recentemente desenvolvido proteína fluorescente dependente ^17, pode ser mais adequado para este fim.

Protocolo

1. Clonagem

1. Determinar as configurações para clonar e escolher um ligante. Proteínas Tag com os fragmentos no N- ou C-terminal, como descrito abaixo para que eles não perturbar a sua localização adequada. Use de um ligante flexível, tal como (GGGGS) x2.
2. Geneticamente marcar as proteínas de interesse aos fragmentos PAmCherry1. Como uma opção, use os plasmídeos de clonagem incluídos na Lista de Materiais contendo fragmentos do RN (resíduos PAmCherry1 1-159) e RC (Met mais os resíduos PAmCherry1 160-236) com sequências de flanqueamento MCS.
   1. Linearizar os plasmídeos contendo os fragmentos de RN e RC com a PCR inversa (ou digestão de restrição) no ponto de inserção. Primers para PCR inversa estão listadas na Tabela 1. Abaixo está um exemplo de protocolo de PCR utilizado no laboratório do autor (ver Lista de Materiais para as matérias exatas utilizadas neste protocolo).
      1. Misture a reacção de PCR em conjunto, trazido até um volume final de 50 ul com água: a uma parede finaed tubo PCR, adicione a água, 25 mL de 2x mistura principal, 0,5 ul cada um dos primers direto e reverso (20 um banco de diluído, 0,2 mM de concentração final), e 1 ng de modelo. Use as seguintes condições de ciclo: 98 ° C durante 30 seg, 30 ciclos de 98 ° C, durante 7 segundos e 68 ° C durante 2 min, e uma extensão final a 72 ° C durante 10 min.
   2. PCR dos genes de interesse para a inserção de plasmídeos linearizados contendo os fragmentos de RN e RC. Realizar o passo PCR, como em 1.2.1 com o tempo de extensão a 68 ° C. Use iniciadores com saliências que contêm uma sequência ligante flexível, tal como para GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT (GGGGS) x 2, e 15 pares de bases de homologia com as extremidades do RN linearizado e plasmídeos RC para recombinação.
      Nota: As saliências de iniciadores para as proteínas de interesse são apresentadas na Tabela 2, utilizando os iniciadores se na Tabela 1 para linearizar o plasmídeo espinha dorsal.
   3. Digerir o PCRreacção com Dpn1 para eliminar o molde de PCR. Adicionar 0,5 uL de Dpn1 (20 U / ul) directamente para a 50 ul de reacção de PCR. Incubar a 37 ° C durante 1 hora e inactivar pelo calor a 80 ° C durante 20 min. Se o molde do fundo persiste em etapas posteriores, aumentar a quantidade de enzima ou de prolongar o tempo de digestão.
   4. Purifica-se os produtos de PCR por meio de uma coluna de centrifugação, tal como descrito pelo fabricante.
   5. Executar uma reacção de ligação independente de combinar um plasmídeo linearizado, contendo uma RN ou RC fragmento com o gene de interesse. Medir a concentração dos produtos de PCR purificados: combinar 50 ng de plasmídeo linearizado e 50 ng do gene de interesse com 1 ul de pré-mistura de enzimas e ajustar o volume total para 5 mL com água desionizada. Incubar a 50 ° C durante 15 minutos, colocar em gelo, e adicionar 20 ul de tampão TE.
   6. Transformar plasmídeos recombinantes em bactérias competentes ^18.
   7. Selecione 2-4 + (como desejado) colônias de cultura D / N. Adicionar 5 mlde caldo LB e 5 mL de canamicina (50 mg / ml) num tubo de polipropileno de 14 ml de fundo redondo, e adicionar as bactérias colónia seleccionada com uma ansa de inoculação esterilizada. Incubar a 37 ° CO / N, agitando a 225 rpm.
   8. Congelar 1 ml de cultura D / N para stock de glicerol e miniprep de ¹⁹ o resto como descrito pelo fabricante.
   9. Execute sequenciação para determinar um bom clone. Se utilizando os plasmídeos de clonagem na Lista de Materiais, M13 usar iniciadores directos e inversos (em reacções separadas) conforme necessário, para obter a sequência completa da construção de fusão. Compare com a sequência esperada usando uma ferramenta de alinhamento tais como BLAST do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
   10. Transferir as construções verificou-seqüência para um plasmídeo de expressão através de uma reação recombinase.
       1. Adicione 75 ng de plasmídeo de destino & #8212; tais como pcDNA para transfecções transientes ou plenti para embalagem lentiviral ²⁰ - e 50 ng de plasmídeo recombinante para clonagem 1 ul de pré-mistura de enzimas e trazer-se um volume total de 5 mL com água desionizada. Incubar a 25 ° C durante 1 h, em seguida, adicionam-se 5 ul de tampão TE.
          Nota: Para embalagens de lentivírus e geração linha celular estável, utilizar um plasmídeo destino diferente para cada construção, por exemplo, com uma resistência à puromicina e o outro neomicina. Isto permite uma dupla selecção de células transduzidas. Considere também o promotor para cada um, tal como o promotor constitutivo citomegalovírus (CMV) para elevados níveis de expressão, ou de CMV com o operador TetO para sintonizável expressão regulada por doxiciclina.
       2. Transformar 5 ul em bactérias competentes e miniprep os plasmídeos como nos passos 1.2.6 a 1.2.8, mas utilizando o antibiótico apropriado (tipicamente ampicilina).
3. Determinar a óptimaConfiguração BiFC.
   1. Co-transfectar os plasmídeos de expressão em células U2OS (ou célula de escolha).
      1. Adicionar 350 ul de fenol DMEM sem vermelho e livre de antibióticos suplementados com FBS 10% em cada poço de uma de 8 poços # 1.5 vidro câmara inferior slide. Placa de cerca de 7,5 x 10 ⁴ culas por po modo que as células são cerca de 70% -90% confluentes no dia seguinte.
      2. No dia após plaqueamento plasmídeos de expressão, a co-transfecção com diferentes configurações em cada poço utilizando o reagente preferido e, tal como descrito pelo fabricante.
         1. Para cada poço, adicione 125 ng de cada plasmídeo de expressão em 50 ul de meio isento de soro reduzidas em um tubo de 0,6 ml e pipeta-se e para baixo para misturar. Adicionar 1 ml de reagente de transfecção para baixo do centro do tubo e directamente para o meio. Agita-se suavemente para misturar e deixar que a reacção se sentar durante 30 min.
         2. Reduzir a mídia em cada poço da lâmina de câmara pela metade. Adicionar gota a gota mistura de transfecção aos poços e agitar gSuavemente para misturar. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 24-48 horas. Troque a mídia do dia após a transfecção.
   2. Células de imagem em um microscópio de fluorescência como no protocolo n.º 2 que começam com o passo 2.1.4.
      Nota: A amostra pode ser trabalhada em um microscópio de fluorescência padrão, se os níveis de expressão são elevados ea câmera é sensível o suficiente para o relativamente baixo débito fóton de PAmCherry1. Moléculas PAmCherry1 reconstituídos pode ser ativado com um conjunto de filtros ultravioleta (405 nm) antes da imagiologia com um conjunto de filtros de excitação verde (561 nm).
4. Se for caso disso, criar um controlo negativo, por exemplo, a introdução de uma mutação pontual em uma das proteínas de interesse que rompe a interacção. Executar uma mutagénese direccionada para o local ²¹ no plasmídeo de clonagem da proteína a ser mutado e da configuração escolhida.
5. Gerar uma linha celular estável empacotando as construções em viralpartículas e infectar células U2OS (ou linhagem celular de escolha). Considere um sistema induzível (tetraciclina) ¹⁵ expressão tão expressão pode ser induzida antes da imagem se irreversibilidade prolongado de BiFC é um problema, ou se a expressão sintonizável é desejado.
   CUIDADO: Trabalhando com vírus é classificado como Nível de Biossegurança 2. Enquanto as gerações recentes de sistemas de embalagem virais têm reduzido significativamente a probabilidade de produzir vírus capazes de replicação, alguns riscos ainda estão presentes. As referências podem ser encontradas em http://www.cdc.gov/biosafety/publications/.
   1. Repita o passo 1.2.10 usando um vector retroviral lenti- ou destino ^20. Aumentar a cultura D / N para 100 ml para um Midiprep e maior pureza dos plasmídeos.
   2. No Dia 1: Placa de cerca de 2 x 10 ⁶ 293T / 17 células numa placa de 10 cm para cada constructo a ser embalado.
   3. No Dia 2: Prepara-se uma reacção de transfecção utilizando um transfection reagente de escolha e, tal como descrito pelo fabricante.
      1. Prepara-se uma pré-mistura de embalagem plasmídeos com concentrações finais de 250 ng / mL para a embalagem de plasmídeos 1 e 2, e 100 ng / ul de plasmídeo de empacotamento 3 em água estéril. Adicionar 10 ul de pré-mistura do plasmídeo de empacotamento e 2,5 ug do plasmídeo alvo para 1 ml de meio isento de soro reduzidas em 5 ml de um tubo de polipropileno de fundo redondo e pipeta-se e para baixo para misturar. Adicionar 20 ul de reagente de transfecção para baixo do centro do tubo e directamente para o meio.
         1. Agita-se suavemente para misturar e incubar à TA durante 30 min. Retirar cerca de metade dos meios de comunicação social a partir das células e adicione a mistura de transfecção gota a gota. Agitar suavemente para misturar e incubar a 37 ° C e 5% de CO _2. Incubar 10 mL de meio por cada placa num tubo com a tampa solta de temperatura e de equilíbrio de CO _2.
      2. No Dia 3: suavemente alterar a mídia com a mídia pré-incubados e returNOTA: As células para a incubadora. Incubar outro tubo de mídia com a tampa solta.
         Nota: sincícios, ou a formação de grandes células multinucleadas, pode ser um sinal de que a embalagem está a correr bem. No entanto, as células estão em um estado frágil e pode ser facilmente retirado. Ao alterar meios, inclinar o pipetador de modo que é horizontal e adicionar gota a gota a mídia para uma borda da placa.
      3. No Dia 4: recolher o vírus através da remoção do meio com uma seringa e filtração através de um filtro de tamanho de poro de 0,45 um para um tubo limpo de 50 ml. Gentilmente substituir a mídia com a mídia pré-incubadas.
      4. No Dia 5: Colheita de novo como feito anteriormente no passo 1.5.3.3 e combinar filtrado comum para o mesmo tubo de 50 ml. Adicionar 6 ml de concentrador de vírus a cada tubo e misturar. Armazenar a 4 ° C durante pelo menos 24 horas até que os precipitados de vírus.
         Nota: Dependendo da saúde das células, o vírus pode ser colhido de um terço do tempo.
      5. Concentra-se o vírus por centrifugação a 1.500 xgdurante 15 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 250 ul de meios de comunicação. O vírus pode ser utilizado imediatamente para a infecção ou armazenado em alíquotas de 50 ul a -80 ° C durante até um ano.
      6. Placa de cerca de 3 x 10 ⁵ U2OS (ou alvo) células por poço numa placa de 6 poços (2 ml de DMEM com 10% de FBS por poço) para a infecção, de modo que as células são cerca de 50% confluentes no momento da infecção.
      7. No dia seguinte, retire cerca de metade da mídia para cerca de 1 ml restos mortais. Coinfect com 50 ul de vírus concentrado para cada constructo. Adicionar 1 ml de polibreno (8 mg / ml) a cada poço. Incubar a 37 ° C e 5% de CO _2. Mudança de mídia no dia seguinte e incubar por mais um dia antes da seleção antibiótico.
         Nota: A quantidade de vírus a adicionar pode variar dependendo da desejada taxa de infecção. Os vírus podem ser titulado utilizando qRT-PCR.
      8. Adicionar antibióticos para seleccionar as células infectadas. Poços separados com células não infectadas que não viram virus são requeridas como canários para testar a eficácia da selecção. Incubar por 2-7 dias, ou até que a seleção está completa.
         Nota: As concentrações eficazes devem ser tituladas inicialmente, mas são tipicamente 1,0 ug / ml para a puromicina e 1,0 mg / ml de neomicina.
      9. Expandir as células em um prato de 10 cm maior e proceder ao Protocolo 2.

2. Células de imagem fixa

1. Prepara-se uma amostra para imagiologia
   1. Limpar a 8 bem # 1.5 com fundo de vidro câmara de corrediça através da adição de 250 ul de NaOH 1 M durante pelo menos 1 hora e lava-se exaustivamente com PBS.
      Nota: lâminas de câmara não tratadas normalmente resultam em alto sinal de fundo. Além disso, as células podem ser sensíveis a NaOH residual e fracasso para limpar completamente a superfície do vidro (até 10x lavagens) pode tornar difícil a adesão celular. Se necessário, incubar a corrediça câmara limpa com PBS S / N após a lavagem. Para as linhas de células sensíveis, chapeamento a uma densidade superior(Por exemplo, a 50% -60% de confluência inicial) pode ajudar.
   2. Placa de cerca de 5,5 x 10 ⁴ das células U2OS expressão estável por poço em 350 ul de fenol DMEM livre de vermelho com 10% de FBS, de modo que as células são saudáveis ​​e não confluentes sobre quando Imaging.
   3. Realizar tratamentos necessários para o experimento, como a adição de tetraciclina para induzir a expressão da proteína.
   4. Fixar as células imediatamente antes de imagem.
      1. Antes da fixação, preparar a solução de paraformaldeído fresco (PFA) - 3,7% de PFA em 1x PHEM com 0,1% de glutaraldeído (GA). Para 10 ml de solução de PFA, pesar 0,37 g de PFA e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 1 ml de água destilada e 30 ul de NaOH 1 M e agitar com vortex. Aquece-se a 70 ° C e 1-2 min cada vórtice até estar completamente dissolvido PFA.
      2. Transferência dissolvido PFA para um tubo de 15 ml e adicionar 3,8 ml de água destilada, 5 ml 2x tampão PHEM, 20 l de 25% de glutaraldeído e vortex para misturar. Estoque, tampão PHEM 2x é de 120 mM PIPES, HEPES 50 mM, EGTA 20 mM, e 16 _mM de MgSO4, com pH ajustado para 7,0 com 10 M de KOH. Esta solução fixadora pode ser armazenado a 4 ° C durante vários dias.
         CUIDADO: PFA e GA são ambos perigosos. Preparar a solução em um exaustor e usar equipamentos de proteção ao manusear ambos os produtos químicos. Evitar a inalação ou contato direto da pele.
      3. Remover o meio de crescimento. Lava-se rapidamente com 500 ul de PBS e 250 ul de adicionar o fixador PFA por poço. Incubam-se as células durante 20 min à TA.
   5. Remover o fixador PFA a partir da amostra e adicionar 350 ul de PBS ou tampão de imagiologia (Tris 100 mM com NaCl 30 mM e 20 _mM de MgCl2, pH 8,5) por poço.
   6. Vortex 100 nm partículas de ouro para quebrar agregados e adicionar 35 ul por poço (10x diluição final) para rastreamento de fase deriva durante o exame.
2. Adquirir imagens
   1. Ligue o microscópio. Ligue os 405 e 561 nm lasers, mas manter as persianasfechado (interno ou externo) neste ponto. Ligue a câmera EMCCD e deixe-a esfriar. Verifique se os filtros de 561 nm estão no lugar.
   2. Abra o software de aquisição e definir o tempo de exposição de 100 ms eo ganho EMCCD a 300 (faixa 1 - 1.000).
   3. Adicionar o óleo de imersão para o objectivo e fixar a amostra para a fase de microscópio.
   4. Com qualquer campo brilhante ou o laser 561 nm (~ 1 kW / cm ^2), levar a amostra em foco.
   5. For Imaging Ras e outras proteínas da membrana, use um objetivo TIRF 60X Apochromat com 1,49 abertura numérica e trazer o microscópio em configuração TIRF. Ajustar o laser de excitação de modo que é descentrada ao bater a abertura traseira do objectivo TIRF; isto faz com que o laser para deflectir ao atingir a amostra. Mantenha ajustando o laser até o ângulo crítico é atingido e que o laser está sendo refletida de volta. Procurar um celular para a imagem com várias partículas de ouro em vista. Defina uma região de interesseque inclui a célula (ou uma região no interior da célula), e as partículas de ouro.
      Nota: TIRF diminui a profundidade de penetração do laser de excitação e reduz o sinal de fundo para fora de foco. Além disso, a correção de desvio é provável que seja mais preciso quando mais partículas de ouro estão em vista.
   6. Se estiver disponível, envolver o sistema de focagem automática para corrigir o desvio de exemplo na direção z. Caso contrário, ajustar o foco manualmente em toda a aquisição se a imagem fica desfocada.
   7. Comece com a aquisição de 405 nm laser desligado eo laser 561 nm (~ 1 kW / cm ²⁾ em caso de activação suficiente já está ocorrendo (tipicamente, se os níveis de expressão são elevados). Caso contrário, ligue o laser nm 405 na configuração mais baixa de energia fábrica (0,02 mW ou 0,01 W / cm ²⁾ e aumentar gradualmente (0,1 mW de cada vez), conforme necessário até que haja várias dezenas de moléculas por quadro ou que moléculas individuais são bem separados.
   8. Como aquisição de dados continua, graduadoually aumentar a potência do laser de 405 nm para manter a densidade local mais ou menos constante.
      Nota: Ao menor poder de excitação 405 nm, alguns PAmCherry1 já pode ser ativada. À medida que estas moléculas photobleach, a restante população de moléculas PAmCherry1 fotoactiv�eis diminui, o que requer um maior fluxo de fótons de manter a mesma densidade de moléculas emissores de fluorescência em cada quadro.
   9. Continue a aquisição de imagens de alta potência até 405 nm (2,5-10 W / cm ²⁾ não ativa mais eventos de ativação.
      Nota: O tempo de aquisição total depende do nível de expressão e a eficiência de complementação.
3. Processar as imagens
   Nota: Existem muitas opções de software de código aberto para processamento de imagem. Exemplos são Trovoada (https://code.google.com/p/thunder-storm/) e QuickPALM (https://code.google.com/p / quickpalm /). Os procedimentos típicos de processamento de dados são brevemente aqui ilustrado usando um pacote Matlab personalizado chamado wfiread para o processamento de dados de palma como um exemplo. No entanto, as revisões futuras não pode exatamente seguir o que está descrito aqui. Para o processamento de imagem com outro software, por favor, consulte as documentações do usuário.
   1. Faça o download do software de processamento de imagem (Supplemental arquivo de código) ou a última versão em http://www.ohsu.edu/nan. Abra Matlab e carregar o software wfiread (que já é colocada no caminho padrão).
   2. Veja a sequência de imagens em bruto e determinar a região de interesse. Seleccione a área da pilha a ser processado por clique esquerdo e arrastando uma caixa ao redor da área desejada. Se a região de interesse não foi reduzida durante a aquisição (a cerca de 256x256 pixels), seleccionar uma área menor para diminuir o tempo de computação. Para desmarcar uma área e processa todo o quadro, clique direito em qualquer lugar no the imagem.
   3. Entre a gama de quadros a serem processados.
   4. Selecione uma partícula de ouro (que é isolado e uniforme em forma) clicando com o botão esquerdo na imagem e arrastando uma pequena caixa em torno dela. Sob Particle Tracking, clique no botão Track. Um gráfico que aparece mostra a posição da partícula de ouro seleccionado entre a pilha de imagens, que apresenta a extensão da deriva.
   5. Repita esse processo para rastrear o maior número de partículas de ouro quanto possível e determinar aqueles que seguem juntos (as partículas irão ser codificados por cores). Idealmente, o desvio total é da ordem de um pixel no máximo.
   6. Individualmente selecionar as partículas de ouro que acompanhavam juntos um de cada vez e clique no botão Adicionar marcador sob Particle Acompanhamento. Uma cruz verde aparece significando que foi adicionado como um marcador e irá ser utilizado para corrigir o desvio.
   7. Ajuste o Sigma Range, Smoothing Gama e Threshold conforme necessário, alterando os valores ligeiramente. Clique no Particle Findbotão para testar as configurações. As partículas que serão processados ​​são embalados e aqueles que não são vai ser deixado de fora. As moléculas PAmCherry1, partículas que são relativamente redondo e brilhante, deve ser selecionada.
   8. Começar a processar as imagens, clicando no botão Coord tornar arquivo e salve o arquivo.
      Nota: O programa vai passar por cada quadro dentro do intervalo de moldura definido, encontrar todas as manchas fluorescentes, e executar instalação Gaussian para encontrar as coordenadas do centróide. Um arquivo .cor serão gerados armazenando todas as coordenadas e outros parâmetros de ajuste das imagens única molécula processados.
4. Pós-processamento das imagens e processar a imagem PALM
   Nota: Outros softwares podem processar diretamente a imagem depois de coordenar a extração.
   1. Em Matlab, lançar o pacote 'palma' e carregar o arquivo .cor acabou de criar.
   2. Antes de proferir a imagem PALM usando as coordenadas, classificar as coordenadas individuais (cada uma de um 'localizatino evento '). Os valores de classificação óptimas podem variar dependendo da configuração e fluoróforo.
      1. Para PAmCherry1, use os seguintes valores: Combinando Frame - 8; Combinando Distância (nm) - 100; RMS Mínimo - 4; Goodness Fit mínima - 0,25; e Max. Excentricidade - 1.4. Consulte a seção de discussão para explicação adicional destes parâmetros.
   3. Clique no botão Classificar para gerar um novo conjunto de coordenadas prontos para renderizar imagens de alta resolução.
   4. Digite valores para boa prestação da imagem final, como o tamanho matéria-pixel (nm), o tamanho do recurso desejado (nm) na imagem renderizada, e o tamanho do pixel para a imagem renderizada.
      Nota: O tamanho do pixel cru deve ser determinado para cada configuração. O tamanho característica rendeu pode ser definido arbitrariamente, mas é tipicamente fixado a um valor ligeiramente maior do que a média da precisão de localização. Para PAmCherry1, a precisão média localização é de cerca de 18 nm, então uma dimensão de traço 20 - 30 nm é appropriate. De nota, a precisão de localização foi calculada tomando-se o desvio padrão das localizações da mesma molécula em vários quadros ²² e não através da divisão do limite de difracção com a raiz quadrada do número de fotões detectados. Quanto ao tamanho do pixel da imagem renderizada, 10 nm é um bom ponto de partida; definir esse valor muito baixo resultará em desnecessariamente grandes arquivos de imagem para vistas sem ampliação.
   5. Clique no botão Render para gerar a imagem PALM. Use os ícones +/- ampliação na barra de ferramentas da janela de figura para zoom in e out.
   6. Opcional: Realizar análise de cluster da imagem PALM reconstruído usando o teste K de Ripley ou outros mecanismos, como auxiliado por simulação DBSCAN (SAD) ^23. Nota: No pacote palma costume, tanto de Ripley K e análise SAD já está construído em; para coordenadas gerados a partir de outro software, as mesmas análises podem ser realizadas com scripts personalizados adicionais.

3. única molécula de Rastreamento em células vivas

1. Tratar a superfície de cultura de tecidos e as células de placa tal como descrito no protocolo 2. Uma vez que a temperatura e / ou CO ₂ fase controlada pode necessitar de uma determinada placa de cultura, assegurar-se de que a lamela tem a espessura apropriada (0,17 mm) para a configuração de microscopia.
   1. Transfectar células se fazer uma expressão transitória e efectuar quaisquer tratamentos necessários para a experiência, tal como a tetraciclina para induzir a expressão, e incuba-se como necessário. Este também é o mesmo que o descrito no protocolo 2.
   2. Coloque a placa de cultura em uma incubadora no palco. Deixe o prato se estabelecer no palco por alguns minutos até que a temperatura ea _{concentração} de CO 2 estabilizar toda vez que após a montagem da placa de cultura ou de se mudar para uma nova região de interesse. Lasers de bloco nesta etapa. Se CO ₂ controle não estiver disponível, mudar para uma CO ₂ meios de comunicação independentes direita antes de imagem, tais como Leibovitz do G-15.
      Nota: médio Fenol-vermelho-livre é recomendado para o fundo deprimente fluorescência.
2. Aquisição de imagens como no Protocolo 2. No entanto, definir um tempo de exposição adequado (tipicamente 25-50 ms para PAmCherry1).
   Nota: A densidade molécula deve ser menor do que para as células fixas de modo que podem ser gravados trajectórias sem sobreposição uns com os outros. As poucas dezenas de moléculas especificadas é típico para uma aquisição de 256x256 pixel por pixel tamanho de cerca de 160 nm. A densidade de potência do laser 561 nm foi ajustada para 0,8 kW / ^cm2 para manter uma boa relação sinal-ruído, reduzindo a fototoxicidade de células e o aumento do comprimento médio de trajectória.
3. Processar as imagens.
   1. Extrair coordenadas de moléculas individuais com o pacote wfiread como descrito no Protocolo nº 2, ou com outro pacote.
   2. Reconstruir trajetórias de partículas utilizando rastreamento (SPT) pacotes de vária única partícula com base em diferentes algoritmos encontradosem outro lugar ^24. Nota: Como alternativa, este passo pode ser realizada utilizando casa construída pacote Matlab (possivelmente disponível em futuras revisões em http://www.ohsu.edu/nan.
   3. Opcional: Após a reconstrução, use um pacote SPT ²⁴ para calcular deslocamento e de difusão constantes das trajetórias. Além disso, utilizar variacional Bayes-tracking única partícula (vbSPT) ²⁵ para determinar estados de difusão das proteínas alvo. pacote e documentação vbSPT Matlab pode ser encontrada em seu sítio oficial Sourceforge: http://vbspt.sourceforge.net/.

Resultados

O exemplo BiFC-PALM mostrado é KRAS mutante G12D interagindo com os Ras domínio de ligação (RBD) de Craf (Figura 1A). Como discutido, a RN ou fragmentos RC não foram etiquetadas para o C-terminal de Ras porque iria perturbar a localização da membrana e, portanto, a actividade biológica de Ras. Isto reduziu as combinações possíveis de oito para quatro (Figura 1B). Cada um destes quatro combinações foi introduzido em células U2OS utilizando infecção lentiviral. As células...

Discussão

BiFC tem sido uma técnica vulgarmente utilizada para a detecção e a visualização de IPP em células, enquanto palma é uma técnica de microscopia recente única molécula SuperResolution que permite imagens em nanoescala de amostras biológicas intactas. A combinação de BiFC com PALM alcançado imagem seletiva de PPIs dentro de uma célula com resolução espacial nanométrica e sensibilidade única molécula. BiFC-PALM estende a utilidade de ambas as técnicas, e como demonstrado neste trabalho, mostra uma gran...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope frame	Nikon	Ti-U
60X oil immersion TIRF objective with 1.49 NA	Nikon	CFI Apo TIRF 60x H
EMCCD camera	Andor	iXon Ultra 897
561 nm laser	Opto Engine	MGL-FN-561
405 nm laser	Coherent	CUBE-405 50mW
561 nm dichroic mirror	Semrock	Di01-R405/488/561/635-25x36
561 nm filter	Semrock	FF01-525/45-25
405/561 nm notch filter	Semrock	NF01-405/488/568-25
Temperature and CO2 controlled stage	Tokai Hit	INUBG2ATW-PLAM
pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS	Addgene	60545
pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS	Addgene	60546
pcDNA3.2-DEST	Life Technologies	12489-019
pLenti-DEST	Addgene		http://www.addgene.org/Eric_Campeau/
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-531
In-Fusion HD Cloning	Clontech	639649
LR Clonase	Life Technologies	11791
Vira Power Lentivirus Packaging	Life Technologies	K497500
X-tremeGENE Transfection Reagent	Roche	13873800
Lab-Tek II Chambered Coverglass	Thermo Scientific	155409	#1.5 glass bottom dishes
U2OS cells	ATCC	HTB-96
293T/17 cells	ATCC	CRL-11268
DMEM with phenol red	Life Technologies	11995
DMEM no phenol red	Life Technologies	21063
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082
Leibovit's L-15, no phenol red	Life Technologies	21083-027
Reduced serum medium	Life Technologies	31985
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	14040
Syringe	BD Biosciences	309604
Syringe filter	Millipore	SLHV033RB
Lentiviral concentrator	Clontech	631231
Retroviral concentrator	Clontech	631455
10 cm culture dish	BD Biosciences	353003
6-well culture plate	BD Biosciences	353046
Polybrene	Sigma	107689
Puromycin	Life Technologies	A11138
G-418	Calbiochem	345812	Neomycin
Doxycyline	Fisher	BP2653
Tris base	Fisher	BP152
EDTA	Sigma	EDS
Sodium Hydroxide	Sigma	S5881
Paraformaldehyde	Sigma	158127
Glutaraldehyde	Sigma	G6257
PIPES	Sigma	P6757
HEPES	Sigma	H4034
EGTA	Sigma	3777
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643
Potassium Hydroxide	Sigma	221473
Sodium chloride	Fisher	BP358
Magnesium chloride	Fisher	M33
100 nm gold particles	BBI Solutions	EM.GC100
Molecular grade water	Life Technologies	10977
Dpn1	New England Biolabs	R0176
PCR purification kit	Qiagen	28104
Miniprep kit	Qiagen	27104
Midiprep kit	Macherey-Nagel	740410
0.6 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-120
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-137
15 ml tubes	Fisher	05-539-12
5 ml polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352063
14 ml polypropylene round-bottom tubes	BD Biosciences	352059
50 ml tube	BD Biosciences	352070
PCR tube	GeneMate	C-3328-1
SOC medium	Life Technologies	15544
LB broth	BD Biosciences	244610
Kanamycin sulfate	Fisher	BP906
Competent cells	Life Technologies	C4040
Matlab	Mathworks