إإكسبلنتس الشبكية كاملة من الدجاج الأجنة لعلاج Electroporation للوالكيميائية الكاشف

Summary

يصف هذا البروتوكول وسيلة لتشريح، والتعامل معها بشكل تجريبي وإإكسبلنتس الشبكية ثقافة بأكملها من أجنة الدجاج. ثقافات يزدرع هي مفيدة عند نسبة نجاح عالية والفعالية واستنساخ هناك حاجة لاختبار آثار البلازميدات ل electroporation و / أو المواد كاشف، أي مثبطات الأنزيمية.

Abstract

شبكية العين هي نموذج جيد للجهاز العصبي المركزي النامية. حجم كبير للعين والأهم من ذلك الوصول للتلاعب التجريبية في البيضة / في الجسم الحي يجعل من الدجاج شبكية العين الجنينية نموذج تجريبي تنوعا وفعالة جدا. على الرغم من أن شبكية العين الدجاج سهلة لاستهداف في البيضة عن طريق الحقن داخل العين أو Electroporation لل، والتركيز الفعال والدقيق للالكواشف داخل شبكية العين قد يكون من الصعب السيطرة عليها بشكل كامل. قد يكون هذا بسبب الاختلافات في موقع الحقن الدقيق، والتسرب من العين أو نشرها متفاوتة من المواد. وعلاوة على ذلك، وتواتر التشوهات والوفيات بعد التلاعب الغازية مثل Electroporation للمرتفع إلى حد ما.

يصف هذا البروتوكول والبيضة السابقين تقنية لزراعة إإكسبلنتس شبكية العين كلها من أجنة الدجاج ويوفر طريقة للتعرض للرقابة في شبكية العين إلى الكواشف. بروتويصف العقيد كيفية تشريح، تجريبيا التلاعب، وإإكسبلنتس الشبكية ثقافة بأكملها من أجنة الدجاج. لل explants يمكن تربيتها لحوالي 24 ساعة وأن تخضع للتلاعب مختلفة مثل Electroporation لل. المزايا الرئيسية هي أن التجربة ليست متوقفة على بقاء الجنين وأن تركيز الكاشف قدم يمكن أن تختلف والسيطرة من أجل تحديد وتحسين التركيز الفعال. وعلاوة على ذلك، والتقنية هي سريعة ورخيصة وجنبا إلى جنب مع ارتفاع نسبة النجاح التجريبية، فإنه يضمن استنساخه النتائج. وينبغي التأكيد على أنه بمثابة مكمل ممتاز لتجارب أجريت في البيضة.

Introduction

شبكية العين هي جزء من الجهاز العصبي المركزي وأنه هو، مع بساطتها النسبية والهندسة المعمارية الخلوية تتميز جيدا، وهذا نموذج شعبية لدراسة تطوير النظام العصبي المركزي. عين الجنين الدجاج كبيرة نسبيا بالمقارنة مع بقية الجنين. وبالتالي فإنه يمكن الوصول إليه بسهولة في البيضة للتلاعب التجريبية، مثل الحقن أو Electroporation لل، وبمثابة أداة ممتازة لاكتساب المعرفة حول خلايا شبكية والبيولوجيا التطورية في الجسم الحي. على الرغم من هذه المزايا الرئيسية، ويمكن البقاء على قيد الحياة من الأجنة تكون منخفضة عند التجارب هي الغازية مثل مع electroporations، تكرار الحقن، أو التلاعب التجريبية مجتمعة.

Electroporation للمن البلازميدات الحمض النووي في الجنين الدجاج في البيضة هي تقنية مهمة وراسخة ^1. انها تسمح لوصفها من الخلايا العصبية والبحث عن المفقودين من مصير المحمولة، فضلا عن مساحات العصبية في NERV المركزينظام الأوس ويسمح للتعبير عن الجينات خارج الرحم لتحليل وظيفة البروتين في الجسم الحي. وقد استخدمت هذه التقنية للدراسات الأنبوب العصبي ^2، الدماغ المؤخر ^3، وشبكية العين ^4. Electroporation للمن شبكية العين الجنينية في البيضة لديه بعض الصعوبات التجريبية التي ترتبط الوضع في الجسم الحي. موقف العين، ويرجع ذلك إلى لطي الجمجمة الجنين، نسبيا قريبة إلى القلب. هذا القرب يزيد من خطر الإصابة بالسكتة القلبية بعد Electroporation لل، وتتزايد المخاطر مع تزايد عمر الجنين. وعلاوة على ذلك، للوصول إلى العين، فمن الضروري لفتح الأغشية الجنينية، مما يزيد من خطر النزيف والتشوهات وانخفاض الجدوى لاحقة. عند اختبار وتحسين البلازميد الحمض النووي الجديد في كثير من الأحيان دون نتيجة المظهرية معروفة، هذه القيود قد يقلل من فعالية وقوة الأسلوب حتى لالتجريبي من ذوي الخبرة. كما وردت في هذا البروتوكول، وثقافة ثثقب يزدرع الشبكية، الذي يعرف بأنه الشبكية العصبية كاملة مع الظهارة الصبغية إزالتها، وسيلة فعالة أن يكمل في نهج البيضة.

الحقن داخل العين من الكواشف الكيميائية هي سهلة نسبيا لأداء في البيضة. ومع ذلك، فإن التركيز الفعال والدقيق الكواشف حقن داخل الشبكية العصبية قد يكون من الصعب السيطرة عليها بشكل كامل. قد تختلف حجم حقن بسبب التسرب والموقع الدقيق للحقن قد تؤثر على كل من توزيع كاشف داخل العين ونشرها من خلال والجسم الزجاجي. سوف تقلب لها آثار كبيرة على تفسير النتائج عند أي يتم تحديد منحنى الاستجابة للجرعة لمثبطات الانزيم. ولا سيما إذا كان تأثير صغير ونافذة الزمني للتأثير ضيق. وعلاوة على ذلك، سوى عين واحدة يمكن استخدامها من كل جنين عند إجراء التجارب في البيضة وذلك بسبب الآثار النظامية المحتملة عبر مجرى الدمعلى العين المقابل. العمر مطابقة مهم عند دراسة التنمية والتغير الفردي بين المعالجة ويمكن أن يؤدي الأجنة التحكم لتقلب التجريبية إضافية.

لهذه الأسباب، وضعت البيضة السابقين أسلوب يعتمد على إإكسبلنتس الشبكية من أجنة الدجاج، والتي يمكن أن يتعرض العصبية في الشبكية إلى موحدة وتسيطر حالة تجريبية في المختبر. وقد تم تطوير هذا البروتوكول على أساس البروتوكولات السابقة ^5-9. إإكسبلنتس الشبكية من مرحلة (ش) 20 (أيام الجنينية [E] 3) لst31 (E7) تم تشريح أجنة الدجاج، مثقف و electroporated مع تركيز الحمض النووي البلازميد محددة أو يتعرض إلى المتوسطة التي تحتوي على تركيز محددة من كاشف كيميائي. تم تنفيذ بروتوكول المعروضة هنا بنجاح في المنشورات الحديثة، وذلك باستخدام العديد من الكواشف الكيميائية المختلفة، بما في ذلك المنظمين من الحمض النووي من التلف الطريق، مثل KU55933، SB 218078، وNSC 109555 ديتوsylate، ودورة الخلية، مثل Cdk1 / 2 المانع الثالث ^10،11.

Protocol

يتم تنفيذ هذا البروتوكول وفقا للتوصيات الواردة في "دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية لجمعية البحوث في الرؤية وطب العيون".

1. التعامل مع البيض وجمع العين

1. تخزين البيض ليفورنو البيضاء في 12-14 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 1 في الاسبوع. إذا كانت متوفرة، واستخدام برودة النبيذ تبريد لتخزين البويضات المخصبة.
   ملاحظة: درجات الحرارة متجر ارتفاع تؤدي إلى نمو غير طبيعي للأجنة، في حين انخفضت درجات الحرارة إلى زيادة معدل الوفيات. مددت فترة التخزين يزيد على حد سواء وفيات والتنمية غير طبيعي.
2. احتضان البيض في 37.5 درجة مئوية و 60٪ البيض مرطب حاضنة مع هزاز لطيف على تردد 5 مرات في 24 ساعة.
3. إزالة البيض المحتضنة من حاضنة البيض في سن الجنينية المطلوب.
   ملاحظة: يتم تحديد عمر الجنين الدجاج لأن الوقت من الحضانة وكما تدل أيام الجنينية (E) أو المراحل (ش)، وفقا لسلسلة من مراحل النمو التي وصفها همبرغر وهاميلتون ^12.
4. وضع البيض المحدد في غطاء تدفق الصفحي. مسح قشر البيض مع 70٪ من الإيثانول لتجنب التلوث من الجنين.
   ملاحظة: إجراء كافة الإجراءات تحت ظروف معقمة مع حلول عقيمة http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions والصكوك.
5. اضغط على جانب من البيض بحزم ضد سطح صلب لاتخاذ اجراءات فتح البيض. وضع المحتوى في طبق بيتري 100 ملم. استخدام ملعقة صغيرة لنقل الجنين الى طبق بيتري 35 ملم تحتوي مسبقا تحسنت (37 ° C) برنامج تلفزيوني 1X لمنع الأنسجة من التجفيف.
6. وضع طبق بيتري 35 ملم تحتوي على الأنسجة الجنينية في الصعود إلى مجهر مجهر stereovision تشريح في غطاء تدفق الصفحي. قطع رأس الجنين عن طريق معسر الرقبة مع ملقط غرامة والتخلص من الجسم.
7. استخدام ملقط غرامة لإجراء شق عشرالخام الفم، البطني للعين. بدءا من موقع شق، المسيل للدموع مفتوحة الأنسجة المحيطة بالعين بأكملها. قرصت العصب البصري وإزالة العين سليمة من محجر العين. جمع كل من اليسار والعين اليمنى من نفس الجنين للاستخدام إما السيطرة أو العين المعالجة.
8. استخدام ملعقة صغيرة لنقل وجهة نظر إلى 35 مم طبق بتري جديدة تحتوي مسبقا تحسنت (37 ° C) برنامج تلفزيوني 1X.

2. إعداد الجامع الشبكية إإكسبلنتس

1. استخدام ملقط غرامة لإزالة جميع الأنسجة حول العين بما في ذلك بدأة صلبوية.
   ملاحظة: سوف الأنسجة مما يسهل فصل شبكية العين على الجسم الزجاجي والعدسة مع الظهارة الصبغية سليمة (الشكل 1A-B).
2. استخدام ملقط غرامة لقرصة شق صغير في ظهارة الصباغ في الجزء الظهري من العين دون الإضرار العصبية في الشبكية (الشكل 1C).
3. استخدام ملقط غرامة المسيل للدموع بلطف فتح starti الظهارة الصبغيةنانوغرام في موقع شق، وترك العدسة والشبكية كلها تعلق على الجسم الزجاجي (1D الشكل). إبقاء العين في دافئ (37 درجة مئوية) برنامج تلفزيوني 1X لتسهيل إزالة الظهارة الصبغية.
   ملاحظة: قد يكون من الصعب الظهارة الصبغية لإزالة، وخصوصا على طول الجسم الهدبي حول التلميذ، في المنطقة الأمامية للعين، وعلى طول الشق المشيمية. ولذلك، فإن بعض ظهارة الصباغ قد يكون غادر على الشبكية العصبية (الشكل 1E-F).

3. علاج الجامعة الشبكية إإكسبلنتس

1. Electroporation للمن إإكسبلنتس شبكية العين كلها
   ملاحظة: Electroporation للمن إإكسبلنتس شبكية العين كلها لا يمكن أن يؤديها مباشرة بعد الخطوة 2.
   1. إعداد مستنبت تحتوي على 1: 1 DMEM: F12 مزيج العناصر الغذائية، و 10٪ FBS، 10 U / مل البنسلين الستربتومايسين، 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، و2 مم L-الجلوتامين.
   2. قطع 1.5 مل القابل للتصرف كفيت البلاستيك (12،5 مم × 12.5 مم × 45 مم) (أو أي حاوية صغيرة قادرة على اجراء حل 300-400 ميكرولتر) حوالي 8 ملم من أسفل باستخدام منشار غرامة ذات نصول.
   3. تمييع DNA البلازميد الاختيار في 1xDPBS إلى تركيز النهائي من 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر.
   4. بدوره على electroporator ومجموعة المعلمات إلى 15 V لST20 - st25 (E3-E4) شبكية العين و 20 V لst26 - st27 (E5) شبكية العين. تعيين نبض يكرر إلى 5 نبضات من 50 مللي ثانية نبض طول مع 1 فترات ثانية. استخدام مولد النبض التي يمكن السيطرة عليها من قبل دواسة القدم على الأرض كما ستكون هناك حاجة بكلتا يديه لعقد الأقطاب في المكان.
   5. ربط اثنين مجداف على شكل (شقة، بقطر دائري. 4 ملم) أقطاب البلاتين (الشكل 2A) إلى مقبس إخراج على مولد النبض.
      ملاحظة: أدلى الأقطاب البلاتين المستخدمة في هذا البروتوكول من قبل ورشة عمل الجامعة. وأدلى الأقطاب الكهربائية من 0.1 ملم لوحة البلاتين "rondelles" (البلاتين الصف: 950 PT / 5 النحاس). وربط 0.8 ملم وايإعادة ومعزول باستخدام الأنابيب البلاستيكية.
   6. نقل بعناية يزدرع الشبكية كله من الخطوة 2.3 إلى كفيت (أو وعاء صغير ما يعادلها) باستخدام ماصة باستير البولي ايثيلين مع طرف قطع للحصول على الحجم الصحيح طرف فتح ليزدرع الشبكية. تجنب استخدام نصائح ماصة كما تميل الشبكية لنعلق على البلاستيك وتمزيق.
   7. استخدام ماصة 100 ميكرولتر لإزالة بلطف كامل برنامج تلفزيوني 1X المحيطة الشبكية اتخاذ يزدرع الحرص على عدم لمس شبكية العين لتجنب تمزق.
   8. إضافة 100 ميكرولتر حل البلازميد كفيت لتغطية يزدرع الشبكية كله. دفع برفق يزدرع الشبكية بالملقط إذا كان يطفو إلى الأعلى. استخدام ملقط أو أقطاب من وضع العدسة لمواجهة أي جانب واحد من كفيت والعصب البصري إلى أسفل كفيت.
   9. وضع القطب الموجب أمام العدسة والقطب السالب وراء شبكية العين (الشكل 2A)، دون لمس الأنسجة.
   10. تطبيق الحالية عن طريق الضغط على أسفل دواسة القدم. التحقق من وجود فقاعات في الأقطاب مشيرا إلى تفريغ ناجحة.
   11. استخدام ماصة 100 ميكرولتر لإزالة كافة مزيج من البلازميد كفيت دون الإضرار شبكية العين. هذا المزيج البلازميد يمكن إعادة استخدامها 3-5 مرات.
   12. تملأ كفيت مع ما قبل تحسنت (37 ° C) برنامج تلفزيوني 1X. استخدام ملقط لفصل بلطف يزدرع الشبكية من جدار كفيت. بعد Electroporation للشبكية العين وتغطي في بعض الأحيان مع فقاعات، مما يجعل من التمسك جدار كفيت.
   13. استخدام ماصة باستور البولي ايثيلين لنقل يزدرع الشبكية كله في 24 لوحة جيدا تحتوي على 1 مل قبل تحسنت (37 ° C) مستنبت لكل بئر. احتضان يزدرع الشبكية واحد لكل بئر.
   14. احتضان يزدرع الشبكية عند 37 درجة مئوية على شاكر المدورة، مع سرعة ثابتة من 50 دورة في الدقيقة، داخل الخلية الحاضنة مع 5٪ CO ₂ لمدة 24 ساعة. تناوب هو ضمان أقصى قدر من التعرض إلى المتوسطة وpreveالإقليم الشمالي التصاق الشبكية في الجزء السفلي من لوحة 24-جيدا.
   15. انتقل إلى الخطوة 4.
2. علاج إإكسبلنتس الشبكية كاملة مع الكواشف الكيميائية
   ملاحظة: العلاج الكيميائي للإإكسبلنتس شبكية العين كلها يمكن القيام بها مباشرة بعد الخطوة 2.
   1. إعداد مستنبت تحتوي على 1: 1 DMEM: F12 مزيج العناصر الغذائية، و 10٪ FBS، 10 U / مل البنسلين الستربتومايسين، 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، و2 مم L-الجلوتامين.
   2. استخدام ملعقة صغيرة لنقل يزدرع الشبكية من الخطوة 2.3 إلى 24 لوحة جيدا تحتوي على 1 مل قبل حرارة (37 درجة مئوية) مستنبت لكل بئر. احتضان يزدرع الشبكية واحد لكل بئر.
   3. احتضان يزدرع الشبكية كامل لمدة 60 دقيقة في 37 ° C على شاكر المدورة، مع سرعة ثابتة من 50 دورة في الدقيقة، داخل الخلية الحاضنة مع CO ₂ 5٪ قبل إضافة كاشف كيميائي أو مركبة.
   4. تحضير المحلول الكيميائي، على سبيل المثال Cdk1 / 2 المانع الثالث، مثبط لM-مرحلة تطور ^13، في المباراة النهائيةتركيز 30 ميكرومتر في DMSO.
   5. إزالة 24 لوحة جيدا، وتحتوي على يزدرع الشبكية كله، من الخلية الحاضنة. إضافة 10 ميكرولتر من كاشف كيميائي أو السيارة (DMSO) مباشرة إلى المتوسطة في شبكية العين، مما أدى إلى تركيز النهائي من 300 نانومتر Cdk1 / 2 المانع الثالث في 0.01٪ DMSO. تدوير يدويا لوحة 24-جيدا للسماح حتى توزيع الكاشف الكيميائي أو مركبة في الحل.
   6. احتضان لل explants الشبكية عند 37 درجة مئوية على شاكر المدورة، مع سرعة ثابتة من 50 دورة في الدقيقة، داخل حاضنة مع 5٪ CO ₂ في الوقت المطلوب (تصل إلى 24 ساعة).
   7. انتقل إلى الخطوة 4.

4. التثبيت وتجميد الجامعة الشبكية Eexplants

1. إزالة 24 لوحة جيدا تحتوي على تعامل يزدرع الشبكية كله من الخلية الحاضنة.
2. استخدام ملعقة صغيرة لنقل يزدرع الشبكية لوحة 24-جيدا تحتوي على 1 مل / بئر الجليد البارد 4٪ لامتصاص العرق في 1XPBS. Incubaالشركة المصرية للاتصالات على الجليد لمدة 15 دقيقة.
3. استخدام ملعقة صغيرة لنقل يزدرع الشبكية كله إلى لوحة 24-جيدا تحتوي على 1 مل / جيد 1XPBS المثلجة لغسل شبكية العين. احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
4. استخدام ملعقة صغيرة لنقل يزدرع الشبكية كله إلى لوحة 24-جيدا تحتوي على 1 مل / بئر الجليد الباردة السكروز 30٪ في 1XPBS. احتضان على الجليد لمدة 1-3 ساعة اعتمادا على يوم الجنينية لشبكية العين. لST20 - st25 (E3) شبكية العين، احتضان لمدة 1 ساعة، شبكية العين السن يحتاجون وقتا أطول في الحضانة السكروز.
5. استخدام ملعقة صغيرة لنقل يزدرع الشبكية كله على فيلم البارافين تحتوي على ما يقرب من 500 ميكرولتر ناظم البرد تجميد المتوسطة المتزايدة. إزالة أكبر السكروز أقصى حد ممكن عن طريق تحريك بلطف يزدرع الشبكية في المتوسط ​​تجميد باستخدام ملعقة صغيرة.
6. نقل يزدرع الشبكية إلى قالب التضمين التي تحتوي على تجميد المتوسطة. وضع العين لتسهيل باجتزاء في المستقبل. وضع قالب التضمين التي تحتوي على يزدرع الشبكية كله على الدكتورذ الجليد حتى المتوسطة يتم تجميد الصلبة. تخزين في -80 ° C.

النتائج

يصف هذا البروتوكول إعداد (الشكل 1A-F) وزراعة شبكية العين من إإكسبلنتس كاملة من أجنة الدجاج. وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لإإكسبلنتس كلها الشبكية من الأجنة من ST20 (E3) لst31 (E7).

Electroporation للمن البلازميدات الحمض النووي في إإكسب...

Discussion

في هذا العمل قدم بروتوكول مفصلة للتشريح، Electroporation للأو العلاج الكيميائي، وزراعة شبكية العين من إإكسبلنتس كاملة من أجنة الدجاج. هذا البروتوكول هو سهل وسريع ويسمح لكل من نسبة نجاح عالية واستنساخه النتائج.

Electroporation للمن إ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1xPBS (tablet)	Life technologies	18912-014
10x DPBS	Life technologies	14080-048
100 mm Petri dish	VWR	734-0006
100 μl pipette tips	VWR	613-0798
1.5 ml disposable plastic cuvette	Thomas Scientific	8495V01
24-well plate	Sigma Aldrich	D7039
35 mm Petri dish	VWR	391-1998
70% ethanol	Solveco	1054
Cdk1/2 inhibitor III	217714	Calbiochem	300 nM in 0.01% DMSO
Cell culture incubator	Thermo Forma
Dissecting microscope	Leica
DMEM	Life Technologies	41966-029
Electrodes			Platina, custom made
Electro square porator ECM 830	Harvard Apparatus
F12 Nutrient mix	Life Technologies	31331-028
FBS	Life Technologies	16140-071
Forceps	AgnThos	0108-5-PS
Freezing medium NEG50	Cellab, Sweden	6502
GFP expressing DNA plasmid (pZGs)
Humidified incubator	Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany	8204
Insulin	Sigma Aldrich	I9278-5ML
L-glutamine	Life Technologies	25030024
Mounting medium ProLong Gold with DAPI	Life Technologies	P36935
Paraffin film	VWR	291-1214P
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	16005-1KG-R
Peel-A-Way embedding mold	Sigma Aldrich	E6032
Penicillin streptomycin	Life Technologies	15140-122
PhosphoHistone 3 (PH3)	Millipore	06-570	Dilution 1/4,000
Platinum electrodes (custom made from "rondelles")	Sargenta	390-R (rondeller)	Dia: 4mm, 0.1 mm thickness
Platimun electrodes	Sonidel	CUY700P4L	Dia: 4 mm
Polyethylene pasteur pipette	VWR	612-2853
Rotator shaker	VWR	444-2900
Small spoon	VWR	231-2151
Sucrose	VWR	443815S
White Leghorn eggs			Local supplier
Wine cooler	WineMaster 24, Caso, Berlin Germany