エレクトロポレーションおよび化学試薬の治療のための鶏胚からの全網膜の外植片

要約

このプロトコルは、解剖実験的に操作し、ニワトリ胚の培養全体の網膜外植する方法について説明します。高い成功率、有効性と再現性をエレクトロポレーションおよび/ ​​または試薬物質、 すなわち、酵素阻害剤のためのプラスミドの効果をテストするために必要な場合、外植片培養は便利です。

要約

網膜は、発展途上の中枢神経系のための優れたモデルです。 OVO / in vivoでの実験操作のための目のサイズが大きいと、最も重要なアクセシビリティ鶏胚網膜汎用性と非常に効率的な実験モデルを作成します。鶏の網膜は眼内注射またはエレクトロポレーションによって卵内標的にするのは簡単ですが、網膜内の試薬 ​​の効果的かつ正確な濃度は、完全に制御することが困難な場合があります。これは、眼または物質の不均一な拡散の正確な注射部位、漏れの変動に起因し得ます。さらに、このようなエレクトロポレーションなどの侵襲的な操作後の奇形や死亡の頻度はかなり高いです。

このプロトコルは、ニワトリ胚から全網膜の外植片を培養する技術OVO EXを記述し、試薬に網膜の制御された露光のための方法を提供します。プロトcolが実験的に、解剖操作、ニワトリ胚の培養全体の網膜の外植する方法について説明します。外植片は、約24時間培養することができ、例えば、エレクトロポレーションのような別の操作に付すこと。主な利点は、実験は、胚の生存に導入試薬の濃度を変化させると効果的な濃度を決定し、最適化するために制御することができる依存しないことです。さらに、この技術は、その高い実験成功率とともに、迅速、安価であり、それは再現性を保証します 結果。それは卵内行われた実験に優れた補完するものとして機能していることを強調すべきです。

概要

網膜は中枢神経系の一部であり、その相対的な簡単さと十分に特徴付け細胞構造、中枢神経系の発達を研究するための人気のあるモデルです。ニワトリ胚の眼は、胚の残りの部分に比べて相対的に大きいです。従って、このような注射またはエレクトロポレーションなどの実験操作のための卵内に容易にアクセスでき、網膜細胞や生体内で発生生物学に関する知識を得るための優れたツールとして機能します。実験は、エレクトロポレーション、反復注射、または組み合わせた実験操作と同様に侵襲的であるとき、これらの主要な利点にもかかわらず、胚の生存率は低くすることができます。

卵内ニワトリ胚へのDNAプラスミドのエレクトロポレーションは重要であり、十分に確立された技術¹です。これは、神経細胞の標識化を可能にする細胞の運命の追跡だけでなく、中央NERVにおける神経管OUのシステムは、それがインビボでタンパク質機能を解析するための異所性の遺伝子発現を可能にします。技術は^、3後脳、および⁴網膜、神経管²の研究のために使用されてきました。 卵内胚網膜のエレクトロポレーションは、in vivoでの状況に関連したいくつかの実験の困難を持っています。胚の頭蓋折りたたみに起因する目の位置は、心臓に比較的近いです。この接近は、エレクトロポレーション後の心停止のリスク、および胚の年齢とともにリスク増加が増加します。また、目にアクセスするために、それによって出血、奇形およびその後の生存率減少のリスクを増加させる、胚の膜を開くことが必要です。既知の表現型の結果なしで、多くの場合、新たなDNAプラスミドをテストし、最適化する場合、これらの制限はあっても、経験豊富な実験者のための方法の有効性とパワーを減少させることができます。このプロトコルは、Wの文化の中で提示したよう削除色素上皮と神経網膜全体として形成された孔網膜外植は、OVOのアプローチで補完する効率的な方法です。

化学試薬の眼内注射は 、OVO で実行するのが比較的容易です。しかし、神経網膜内注射、試薬の有効かつ正確な濃度は、完全に制御することが困難な場合があります。注入量は、漏れに変えることができ、注射の正確な部位は、眼内の試薬の分布と硝子体を通して拡散の両方に影響を与える可能性があります。酵素阻害剤のための、すなわち、用量応答曲線を決定する際の変動は、結果の解釈のために主要な影響を有することになります。特に効果が小さく、効果の時間窓が狭い場合。血流を介し潜在的な全身作用のために、OVOの実験で行うときにまた、唯一の目には、各胚から使用することができます反対側の眼へ。開発および処置および対照胚は、追加実験の変動につながる可能性の間の個体差を検討する際に年齢のマッチングが重要です。

これらの理由のために、ニワトリ胚の網膜外植片に基づく方法卵EXは、神経網膜を均一に露出し、 インビトロで実験条件を制御することが可能で、開発されました。現在のプロトコルは、以前のプロトコル^5-9に基づいて開発されました。ステージからの網膜外植体（ST）、ST31〜20（3胚日[E]）は、（E7）は、ニワトリ胚を培養し、解剖し、エレクトロポレーション定義DNAプラスミドの濃度または化学試薬の規定された濃度を含有する培地に曝露しました。ここで紹介するプロトコルは成功し、このようなKU55933、SB 218078、およびNSC 109555 DITOなどのDNA損傷経路の調節因子を含む、いくつかの異なる化学試薬を使用して、最近の出版物に実装されましたこのようするCdk1 / 2阻害剤III ^10,11としてsylate、および細胞周期、。

プロトコル

このプロトコルは、「ビジョンと眼科での研究のための協会の実験動物の管理と使用に関する指針」の推奨事項に従って行われます。

1.卵取り扱いとアイコレクション

1. 1週間以上、もはや用に12〜14℃の白色レグホン卵を保管してください。可能な場合は、受精卵を保存する冷蔵ワインクーラーを使用しています。
   注意：より低い温度では死亡率を増加させながら、高い店の温度は、胚の異常な開発につながります。拡張ストレージ時間が死亡し、異常な開発の両方を向上させます。
2. 穏やかに24時間あたり5回の頻度でロッキングと37.5°Cで卵と60％の加湿卵インキュベーターをインキュベートします。
3. 希望胚年齢で卵のインキュベーターから培養した卵を削除します。
   注：ニワトリ胚の年齢は、インキュベーションの時間として決定され、胚日（E）として、または段階として示される（ST）、ハンバーガーとハミルトン^12で説明した発達段階の一連に従って。
4. 層流フード内で選択された卵を置きます。胚の汚染を避けるために70％エタノールで卵殻を拭きます。
   注：滅菌溶液を無菌条件下ですべての手順を実施 http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions そして、楽器。
5. 卵を開いてクラックするのは難しい表面に対してしっかりと卵の側をタップします。 100ミリメートルペトリ皿内のコンテンツを配置します。乾燥から組織を防止するために、予め温めた（37℃）1×PBSを含む35 mmのペトリ皿に胚を転送する小スプーンを使用します。
6. 層流フード内で両眼立体視の解剖顕微鏡上に胚組織を含む35ミリメートルペトリ皿を置きます。細かい鉗子で首をつまんで胚を刎ねると体を捨てます。
7. 切開目を作るために細かい鉗子を使用して、ラフ、口、目に腹。切開部位から開始し、全体の眼の周囲の組織を開いて涙。視神経をピンチオフし、目のソケットからそのまま目を削除します。制御または処置した眼のいずれかとして使用するために同じ胚からの左と右眼の両方を収集します。
8. 予め温めた（37℃）1×PBSを含む新しい35ミリメートルペトリ皿に目を転送するために、小さなスプーンを使用してください。

全網膜外植片の作製

1. 強膜原基を含む眼の周りのすべての組織を除去するために微細な鉗子を使用してください。
   注：組織は、色素上皮そのまま（ 図1A-B）と硝子体とレンズで網膜を残して簡単に取り外します。
2. 神経網膜（ 図1C）を損傷することなく、眼の背側部分の色素上皮に小さな切開を挟ま細かい鉗子を使用してください。
3. 優しく色素上皮startiを開き引き裂く細かい鉗子を使用して、レンズと硝子体（ 図1D）に接続されている網膜全体を残して、切開部位でngの。色素上皮の除去を容易にするために、温かい（37℃）1×PBS中で目を離さありません。
   注：色素上皮は、眼の前方領域であり、脈絡膜の亀裂に沿って、瞳孔の周りの毛様体に沿って具体的には、除去するのが困難な場合があります。したがって、色素上皮の一部が神経網膜（ 図1E-F）上に残してもよいです。

全網膜外植片の3治療

1. 全体の網膜の外植片のエレクトロポレーション
   注：全体の網膜外植片のエレクトロポレーションはステップ2の後に直接実行することができます。
   1. 1 DMEM：F12の栄養ミックス、10％のFBS、10 U / mlペニシリンストレプトマイシン、5μg/ mlのインスリン、および2mM L-グルタミン1を含む培地を準備します。
   2. 1.5ミリリットル使い捨てプラスチックキュベットをカット（12.5ミリメートル×12.5ミリメートルのx 45メートルM）（または微ブレードソーを用いて底部から）約8mmの300-400μlの溶液を保持することが可能な任意の小容器。
   3. 0.1μgの/μlの最終濃度に1xDPBSにおける選択肢のDNAプラスミドを希釈します。
   4. ST20のために15 Vにエレクトロと設定パラメータをオンにします - ST25（E3-E4）網膜とST26のための20のV - ST27（E5）網膜。 1秒間隔で50ミリ秒パルス長の5パルスにパルス繰り返しを設定します。両手が所定の位置に電極を保持するために必要とされるように床に足ペダルで制御することができるパルス発生器を使用してください。
   5. 形の2パドル（フラット、円形DIAM 4 mm）の白金電極（ 図2A）は 、パルス発生器の出力ソケットに接続します。
      注：このプロトコルで使用される白金電極は、大学のワークショップによって作られました。電極は、0.1ミリメートルの白金板」rondelles」（：950のPt / 5銅プラチナグレード）から作られました。接続0.8ミリメートルののwi再プラスチックチューブを用いて絶縁しました。
   6. 慎重に網膜の外植片のための右先端開口サイズを取得するためにカットオフ先端を有するポリエチレンパスツールピペットを用いて、キュベット（または同等の小型容器）へのステップ2.3からの全網膜外植片を移します。網膜は、プラスチックに付着し、引き裂くする傾向があるとして、ピペットチップを使用しないでください。
   7. 優しく引き裂きを回避するために、網膜に触れないように注意して網膜の外植片を取り巻く全体の1×PBSを除去するために、100μlのピペットを使用してください。
   8. 全体の網膜の外植片をカバーするためにキュベットに100μlのプラスミド溶液を追加します。それがトップに浮上する場合は慎重にピンセットで網膜の外植片を押し下げます。キュベットの底にキュベットおよび視神経のいずれかの側を向くようにレンズを配置する鉗子又は電極を使用してください。
   9. 組織に触れることなく、レンズと網膜（ 図2A）の背後にある負極の前で正極を配置します。
   10. フットペダルを押し下げて電流を適用します。成功した放電を示す電極での泡のために確認してください。
   11. 網膜を損傷することなく、キュベットからすべてのプラスミドミックスを除去するために、100μlのピペットを使用してください。プラスミド混合物は、3〜5回再利用することができます。
   12. 予め温めた（37℃）1×PBSでキュベットを埋めます。優しくキュベットの壁から網膜外植片を分離するために鉗子を使用してください。エレクトロポレーション後、網膜は、時にはそれがキュベットの壁に付着させる泡で覆われています。
   13. ウェルあたり1ミリリットル予め温め（37℃）培地を含む24ウェルプレートに全体の網膜の外植片を転送するためにポリエチレンパスツールピペットを使用してください。ウェルあたり1網膜外植片をインキュベートします。
   14. 24時間_、5％CO 2で細胞インキュベーターの内部で、毎分50回転の一定速度で、回転子シェーカー上で37℃での網膜外植をインキュベートします。回転を培地にし、preveに最大の露出を確保することです24ウェルプレートの底に網膜のNT接着。
   15. ステップ4に進みます。
2. 化学試薬を用いた全網膜外植片の治療
   注意：全体の網膜の外植片の化学的処理は、ステップ2の後に直接実行することができます。
   1. 1 DMEM：F12の栄養ミックス、10％のFBS、10 U / mlペニシリンストレプトマイシン、5μg/ mlのインスリン、および2mM L-グルタミン1を含む培地を準備します。
   2. 1ミリリットルにウェル当たり予め温め（37℃）培地を含む24ウェルプレートにステップ2.3から網膜外植片を転送するために、小さなスプーンを使用してください。ウェルあたり1網膜外植片をインキュベートします。
   3. 化学試薬またはビヒクルを添加する前に5％CO ₂での細胞培養器の内部で、50 rpmの一定速度で、回転子シェーカー上で37℃で60分間、全網膜外植片をインキュベートします。
   4. 例えば、薬液を調製するCdk1 / 2阻害剤III、最終的にM期の進行¹³の阻害剤DMSO中、30μMの濃度。
   5. 細胞インキュベーターから、全体の網膜の外植片を含む、24ウェルプレートを取り外します。 0.01％DMSO中300 nMのCdk1の/ 2阻害剤IIIの最終濃度で、その結果、網膜の中に直接化学試薬またはビヒクル（DMSO）の10μLを追加します。手動で、溶液中の化学試薬または車両の均一な分布を可能にするために、24ウェルプレートを回転させます。
   6. 希望の時間（最大24時間_）、5％CO 2のインキュベーターの内側に、毎分50回転の一定速度で、回転子シェーカー上で37℃での網膜外植片をインキュベートします。
   7. ステップ4に進みます。

4.固定全体網膜Eexplantsの凍結

1. 細胞インキュベーターから治療全体の網膜外植片を含む24ウェルプレートを取り外します。
2. 1×PBSで1ミリリットル/ウェルの氷冷4％パラホルムアルデヒドを含む24ウェルプレートに網膜外植片を転送するために、小さなスプーンを使用してください。 Incuba15分間氷上でTE。
3. 網膜を洗浄するために1ミリリットル/ウェルの氷冷を1×PBSを含む24ウェルプレートに全体の網膜の外植片を転送するために、小さなスプーンを使用してください。氷上で10分間インキュベートします。
4. 1ミリリットル/を1×PBSでよく氷冷30％スクロースを含む24ウェルプレートに全体の網膜の外植片を転送するために、小さなスプーンを使用してください。網膜の日胚に応じて1〜3時間、氷上でインキュベートします。 ST20について - ST25（E3）網膜は、1時間インキュベート、古い網膜は、スクロースより長いインキュベーション時間を必要としています。
5. 約500μlのクライオスタット凍結マウンティング培地を含むパラフィンフィルム上に全体の網膜の外植片を転送するために、小さなスプーンを使用してください。そっと小さなスプーンを使用して、凍結培地の網膜外植片を移動させることにより、できるだけ多くのショ糖、できるだけ削除します。
6. 凍結培地を含む埋め込む型に網膜外植を転送します。将来の切片を容易にするために、目の位置を調整します。 DRの全網膜外植片を含む埋め込む型を入れて中までのy氷は固体凍結されます。 -80℃で保存してください。

結果

このプロトコルは、ニワトリ胚からの全体の網膜の外植片の準備（ 図1A-F）および培養について説明します。このプロトコルが正常にST31にST20（E3）の胚からの全体の網膜外植（E7）のために使用されています。

全網膜外植片へのDNAプラスミドのエレクトロポレーションは、網膜前駆細胞の標識および追跡のためにまたは過剰発現の異なる遺伝子産物のことが?...

ディスカッション

この作品では、切開、エレクトロポレーションまたは化学的処理、およびニワトリ胚からの全体の網膜の外植片を培養するための詳細なプロトコルが提示されています。このプロトコルは、迅速、簡単であり、高い成功率と再現性の両方を可能にします 結果。

全網膜外植片のエレクトロポレーションは、対象の遺伝子構築物を発現する細胞の大部分を生成?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1xPBS (tablet)	Life technologies	18912-014
10x DPBS	Life technologies	14080-048
100 mm Petri dish	VWR	734-0006
100 μl pipette tips	VWR	613-0798
1.5 ml disposable plastic cuvette	Thomas Scientific	8495V01
24-well plate	Sigma Aldrich	D7039
35 mm Petri dish	VWR	391-1998
70% ethanol	Solveco	1054
Cdk1/2 inhibitor III	217714	Calbiochem	300 nM in 0.01% DMSO
Cell culture incubator	Thermo Forma
Dissecting microscope	Leica
DMEM	Life Technologies	41966-029
Electrodes			Platina, custom made
Electro square porator ECM 830	Harvard Apparatus
F12 Nutrient mix	Life Technologies	31331-028
FBS	Life Technologies	16140-071
Forceps	AgnThos	0108-5-PS
Freezing medium NEG50	Cellab, Sweden	6502
GFP expressing DNA plasmid (pZGs)
Humidified incubator	Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany	8204
Insulin	Sigma Aldrich	I9278-5ML
L-glutamine	Life Technologies	25030024
Mounting medium ProLong Gold with DAPI	Life Technologies	P36935
Paraffin film	VWR	291-1214P
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	16005-1KG-R
Peel-A-Way embedding mold	Sigma Aldrich	E6032
Penicillin streptomycin	Life Technologies	15140-122
PhosphoHistone 3 (PH3)	Millipore	06-570	Dilution 1/4,000
Platinum electrodes (custom made from "rondelles")	Sargenta	390-R (rondeller)	Dia: 4mm, 0.1 mm thickness
Platimun electrodes	Sonidel	CUY700P4L	Dia: 4 mm
Polyethylene pasteur pipette	VWR	612-2853
Rotator shaker	VWR	444-2900
Small spoon	VWR	231-2151
Sucrose	VWR	443815S
White Leghorn eggs			Local supplier
Wine cooler	WineMaster 24, Caso, Berlin Germany