鸡胚全视网膜外植体电穿孔和化学试剂处理

摘要

本协议描述的方法来剖析，实验操作和鸡胚培养全视网膜植。当高的成功率，有效性和再现性都需要测试质粒电穿孔和/或试剂的物质， 即，酶抑制剂的效应的外植体培养是有用的。

摘要

视网膜是显影中枢神经系统的良好模型。眼睛的大尺寸和最重要的是可访问的实验操作卵/体内使鸡胚胎视网膜一种多用途和非常有效的实验模型。虽然鸡视网膜容易靶向卵内通过眼内注射或电穿孔，视网膜内的试剂的有效和确切浓度可能难以完全控制。这可能是由于精确注射部位，泄漏从眼睛或物质的不均匀扩散的变体。此外，畸形和死亡率的侵入性操作，如电穿孔后的频率是相当高的。

这个协议描述一个前卵技术培养来自鸡胚整个视网膜植并提供对视网膜试剂的受控曝光的方法。该原COL介绍如何解剖，实验操作，并从鸡胚培养全视网膜植。外植体可以培养约24小时，并可以以不同的操作，例如电穿孔。的主要优点是，该实验是不依赖于胚胎的生存，并且所引入的试剂的浓度可以变化，并为了确定和优化的有效浓度来控制。此外，该技术具有快速，价格便宜，再加上其高实验的成功率，它保证可重复 结果。应当强调的是，它作为一个很好的补充卵内进行的实验。

引言

视网膜是中枢神经系统的一部分，它是，与它相对简单和充分表征的细胞结构，一个流行的用于研究的中枢神经系统的发展模式。鸡胚胎的眼睛是相比于胚胎的其余部分比较大。因此， 在卵内进行实验操作，如注射或电方便，而且作为一个优秀的工具来获取知识有关的视网膜细胞和体内发育生物学。尽管有这些主要优势，胚胎的存活率可低时的实验是侵入性的，如与电穿孔，重复注射，或结合实验操作。

电穿孔DNA质粒的进入蛋内的鸡胚是一个重要的和成熟的技术^1。它允许神经元的标签，在中央NERV跟踪细胞命运以及神经脊髓束的OU系统和它允许异位基因表达来分析蛋白质的功能在体内 。该技术已用于神经管²的研究，后脑^3和视网膜^4。胚胎视网膜卵内电穿孔具有的相关的体内情况的一些实验困难。眼睛的位置，由于胚胎的颅折叠，相对靠近心脏。这样的接近会增加心脏骤停的下列电穿孔的风险，并与胚胎的年龄的风险增加。此外，访问眼，有必要打开胚胎膜，从而增加出血，畸形和随后的存活率下降的风险。当测试和经常优化新的DNA的质粒没有已知的表型的结果，这些限制可能会降低该方法的有效性和功率甚至对于有经验的实验者。作为呈现在这个协议中，的瓦特的培养孔视网膜外植体，其定义为整个神经视网膜与色素上皮除去，是在卵内的方法补充了一种有效的方法。

化学试剂眼内注射是比较容易的卵内进行。然而，神经视网膜内注射试剂的有效和确切浓度可能难以完全控制。所注入的体积可能由于渗漏和注射的确切位点可以影响眼睛内的试剂的两个分布并通过玻璃体的扩散。变异将对时即一种酶抑制剂的剂量反应曲线被确定的结果的解释主要影响;特别是如果效果小及效果的时间窗口很窄。而且，只有一个单一的眼睛可以从每个胚卵实验执行时使用，由于通过血液流潜在的全身效应到对侧眼。研究开发与处理和控制的胚胎可能会导致额外的实验变异之间的个体差异时，年龄匹配是非常重要的。

由于这些原因， 卵内的方法的当然基于来自鸡胚视网膜植被开发，其中，所述视网膜神经可暴露于均匀的和体外控制的实验条件下。本协议是根据以前的协议^5-9开发。来自阶段视网膜外植体（ST）20（胚胎天[E] 3）〜ST31（E7）鸡胚进行解剖，培养和电穿孔以限定的DNA质粒浓度或暴露于包含一个限定的化学试剂的浓度的介质。这里介绍的协议已经成功地实施了最近的出版物，使用几种不同的化学试剂，包括DNA损伤通路的调节，如KU55933，SB 218078和NSC 109555 DITOsylate，和细胞周期，如CDK1 / 2抑制剂III ^10,11。

研究方案

该协议是根据"指南为协会的实验动物的护理和使用的研究视觉与眼科"，在这些建议进行的。

1.鸡蛋处理和眼收集

1. 存储白来航鸡蛋在12-14℃下不超过1周。如果可能，请使用冷藏酒柜储存受精卵。
   注:更高的存储温度导致胚胎发育异常，而较低温度增加了死亡率。延长贮存时间增加了死亡率和畸形发展。
2. 孵育在37.5℃下的鸡蛋和60％湿度的蛋孵化器轻轻摇动以每24小时5次的频率。
3. 从卵孵化在期望胚胎年龄除去温育卵。
   注意:鸡胚的年龄被确定为孵育的时间和被表示为胚胎天（E）或作为阶段（ST），根据该系列由汉堡包和汉密尔顿^12中所述发育阶段。
4. 将所选鸡蛋在层流罩。擦拭用70％乙醇的蛋壳以避免胚胎的污染。
   注:进行与无菌溶液无菌条件下的所有程序 http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions 和仪器。
5. 点击蛋这一边抵住硬表面敲​​开鸡蛋。放置在100毫米培养皿中的内容。用一个小勺子的胚胎移植到含预热（37℃）PBS洗涤，防止干燥组织35毫米的培养皿。
6. 把这个包含胚胎组织上在层流罩一双目视觉解剖显微镜35毫米的培养皿。由俭用细镊子颈部杀头的胚胎和丢弃的尸体。
7. 用细镊子做一个切口日粗糙口，腹的眼睛。起始于切口部位，撕开围绕整个眼组织。夹断视神经并从眼窝中删除完整的眼球。从相同胚胎，以用作对照或处理过的眼睛收集的左和右眼。
8. 用一个小勺子的目光转移到含预热（37°C）1X PBS一个新的35mm平皿。

2.准备工作全视网膜外植体

1. 用细镊子清除所有的组织在眼部周围，包括巩膜原基。
   注意:所述的组织将分离容易留下玻璃体和晶状体视网膜与色素上皮完整（图1A-B）。
2. 用细镊子夹住的小切口插入色素上皮在眼睛的背部，而不会损坏神经视网膜（图1C）。
3. 用细镊子轻轻撕开色素上皮starti纳克在切口部位，而使透镜和连接到玻璃体（图1D）的整个视网膜。保持眼睛在温暖（37℃）的1×PBS以利于除去的色素上皮。
   注意:色素上皮可能难以除去，尤其是沿瞳孔周围睫状体，在眼睛的前部区域，并沿着脉络膜裂。因此，一些的色素上皮细胞可能会留在神经视网膜（图1E-F）。

3.治疗全视网膜外植体

1. 全视网膜外植体电穿孔
   注:整个视网膜植电穿孔可以直接步骤2之后进行。
   1. 制备含有1培养基:1的DMEM:F12营养混合物，10％FBS，10U / ml青霉素链霉素，5微克/毫升胰岛素，和2mM L-谷氨酰胺。
   2. 切断1.5 ml的一次性塑料比色皿（12.5毫米×12.5毫米×45米米）（或任何小容器能够保持300-400微升溶液）约8毫米从底部用细刃锯。
   3. 选择在1xDPBS的DNA质粒稀释至0.1微克/微升的最终浓度。
   4. 打开电穿孔和设置参数到15 V为ST20 - ST25（E3-E4）视网膜以及20V ST26 - ST27（E5）视网膜。设置脉冲重复序列5的脉冲50毫秒脉冲长度为1秒的间隔。使用可以由脚踏地板上被控制作为双手将需要保持电极以代替脉冲发生器。
   5. 铂电极（图2A）连接两个桨形（4毫米扁平，圆形直径），以在脉冲发生器的输出插座。
      注:在本协议中所使用的铂电极，由大学研讨会上提出。将电极0.1毫米的铂金板"rondelles"（:950铂/ 5铜铂金级）制成。该连接0.8毫米无线重复使用的塑料管是绝缘的。
   6. 小心地从2.3步使用聚乙烯巴斯德吸管切断以获得合适的烙铁头，开口尺寸为视网膜外植体顶端的比色皿（或相当小容器）转让全视网膜外植体。避免使用枪头为视网膜容易附着在塑料和撕裂。
   7. 使用100微升吸管轻轻地去除整个1X PBS周边视网膜外植体，注意不要接触视网膜，避免撕裂。
   8. 加入100微升的质粒溶液，以反应杯以覆盖整个视网膜外植体。轻轻下压视网膜外植体用钳子，如果它浮在顶部。使用镊子或电极来定位透镜面对反应杯和视神经的任一侧，以比色皿的底部。
   9. 放置在正极中的透镜和视网膜（图2A）的后面的负电极的前面，而不接触所述组织。
   10. 通过按下脚踏施加的电流。检查气泡在电极上表示成功出院。
   11. 使用100μl的移液管除去从试管所有质粒混合，而不会损坏视网膜。所述质粒组合可以重复使用的三到五倍。
   12. 填满预温（37℃）的1×PBS的试管。使用镊子从试管的壁轻轻分离视网膜外植体。电穿孔后视网膜有时覆盖有气泡，这使得它粘附在反应杯的壁。
   13. 使用聚乙烯巴斯德吸管向整个视网膜外植体转移到含有1ml预热（37℃），每孔培养基中的24孔平板。每孵育井一视网膜外植体。
   14. 孵育视网膜外植体在37℃下在旋转器上摇动，用50rpm的恒定速度，细胞培养箱，用5％ _的 CO 2 24小时内。旋转是，以确保最大暴露于介质和preve视网膜至24孔板的底部nt的粘合性。
   15. 继续执行步骤4。
2. 全视网膜外植体的化学试剂处理
   注:化学处理的整个视网膜植可以直接步骤2之后进行。
   1. 制备含有1培养基:1的DMEM:F12营养混合物，10％FBS，10U / ml青霉素链霉素，5微克/毫升胰岛素，和2mM L-谷氨酰胺。
   2. 用小勺子从步骤2.3传输视网膜植于24孔板含有1ml每孔预温（37℃）的培养基。每孵育井一视网膜外植体。
   3. 加入化学试剂或媒介物之前孵育整个视网膜外植体60分钟，在37℃在旋转器上摇动，用50rpm的恒定速度，细胞培养箱，用_5％的CO 2的内部。
   4. 制备的化学溶液，例如CDK1 / 2抑制剂III，M相进展¹³的抑制剂，在最终为30μm的DMSO浓度。
   5. 除去24孔板，包含整个视网膜外植体，从细胞培养箱。直接添加10μl的化学试剂或载体（DMSO）给视网膜介质，导致为300nM CDK1 / 2抑制剂III在0.01％DMSO的最终浓度。手动旋转24孔板以允许均匀分布在溶液中的化学试剂或车辆。
   6. 孵育视网膜植于37℃在旋转器上摇动，用50rpm的恒定速度，保温箱，用_5％的CO 2所需的时间（长达24小时）内。
   7. 继续执行步骤4。

4.固定和全视网膜Eexplants的冻结

1. 除去含有从细胞培养箱的处理的全视网膜外植的24孔板中。
2. 用一个小勺子视网膜外植体转移到24孔板含1毫升/冰冷的1XPBS 4％多聚甲醛。 Incuba德在冰上15分钟。
3. 用一个小勺子整个视网膜外植体转移到一个24孔平板含有1ml /孔冰冷1XPBS洗涤视网膜。冰上孵育10分钟。
4. 用小勺子给整个视网膜外植体转移到24孔板含1毫升/在1XPBS以及冰冷的30％的蔗糖。在冰上孵育1-3小时取决于视网膜的胚胎天。对于ST20 - ST25（E3）视网膜，孵育1小时后，较旧的视网膜需要在蔗糖更长的温育时间。
5. 用小勺子给整个视网膜外植体转移到含有约500微升冻结的低温恒温器安装介质的石蜡膜。通过使用小勺子轻轻移动视网膜外植体在冷冻介质删除尽可能多的蔗糖越好。
6. 视网膜外植体转移到含有冻结介质的嵌入模具。放置眼以方便日后切片。将载有关于博士全视网膜外植体嵌入模具Ÿ冰，直到媒体被冻成冰。储存在-80℃。

结果

这个协议描述了从鸡胚整个视网膜植制备（图1A-F）和培养。此协议已被成功地用于整个视网膜植从ST20（E3）的胚胎ST31（E7）。

DNA质粒成整体视网膜外植体电穿孔允许视网膜祖细胞的标记和追踪或过度表达的不同基因产物。对于电的实验中，色素上皮细胞进行了仔细的从ST25（E4½）胚胎的去核眼中除去。整个视网膜外植体，然后放置在含有该DNA的质粒...

讨论

在这项工作中对于夹层，电穿孔或化学处理，并从鸡胚整个视网膜外植培养一个详细的协议，提出。该协议是简单，快捷，可为高的成功率和可重复性 结果。

全视网膜外植体电穿孔产生大面积细胞表达目的基因构建的。这是很容易正确地定位在电极和到视网膜的特定部分暴露到规定DNA质粒浓度。这种方法允许一种可靠的方法，调查与相比卵电穿孔一个通?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1xPBS (tablet)	Life technologies	18912-014
10x DPBS	Life technologies	14080-048
100 mm Petri dish	VWR	734-0006
100 μl pipette tips	VWR	613-0798
1.5 ml disposable plastic cuvette	Thomas Scientific	8495V01
24-well plate	Sigma Aldrich	D7039
35 mm Petri dish	VWR	391-1998
70% ethanol	Solveco	1054
Cdk1/2 inhibitor III	217714	Calbiochem	300 nM in 0.01% DMSO
Cell culture incubator	Thermo Forma
Dissecting microscope	Leica
DMEM	Life Technologies	41966-029
Electrodes			Platina, custom made
Electro square porator ECM 830	Harvard Apparatus
F12 Nutrient mix	Life Technologies	31331-028
FBS	Life Technologies	16140-071
Forceps	AgnThos	0108-5-PS
Freezing medium NEG50	Cellab, Sweden	6502
GFP expressing DNA plasmid (pZGs)
Humidified incubator	Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany	8204
Insulin	Sigma Aldrich	I9278-5ML
L-glutamine	Life Technologies	25030024
Mounting medium ProLong Gold with DAPI	Life Technologies	P36935
Paraffin film	VWR	291-1214P
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	16005-1KG-R
Peel-A-Way embedding mold	Sigma Aldrich	E6032
Penicillin streptomycin	Life Technologies	15140-122
PhosphoHistone 3 (PH3)	Millipore	06-570	Dilution 1/4,000
Platinum electrodes (custom made from "rondelles")	Sargenta	390-R (rondeller)	Dia: 4mm, 0.1 mm thickness
Platimun electrodes	Sonidel	CUY700P4L	Dia: 4 mm
Polyethylene pasteur pipette	VWR	612-2853
Rotator shaker	VWR	444-2900
Small spoon	VWR	231-2151
Sucrose	VWR	443815S
White Leghorn eggs			Local supplier
Wine cooler	WineMaster 24, Caso, Berlin Germany