Los explantes de retina enteras de pollo embriones para Tratamientos electroporación y Reactivos Químicos

Resumen

Este protocolo describe un método para diseccionar, experimentalmente manipular y explantes de cultivo completo de la retina a partir de embriones de pollo. Los cultivos de explantes son útiles cuando alta tasa de éxito, la eficacia y reproducibilidad son necesarios para probar los efectos de plásmidos para la electroporación y / o sustancias de reactivos, es decir, inhibidores enzimáticos.

Resumen

La retina es un buen modelo para el sistema nervioso central en desarrollo. El gran tamaño del ojo y lo más importante la accesibilidad para las manipulaciones experimentales en ovo / in vivo hace que el pollo retina embrionaria un modelo experimental versátil y muy eficiente. Aunque la retina de pollo es fácil dirigirse in ovo mediante inyecciones intraoculares o la electroporación, la concentración eficaz y exacta de los reactivos dentro de la retina puede ser difícil de controlar completamente. Esto puede ser debido a las variaciones de la zona de inyección exacta, la fuga desde el ojo o desigual difusión de las sustancias. Además, la frecuencia de malformaciones y mortalidad después de manipulaciones invasivos tales como la electroporación es bastante alta.

Este protocolo describe un ex ovo técnica para el cultivo de explantes de retina enteros a partir de embriones de pollo y proporciona un método para la exposición controlada de la retina a los reactivos. El protocol describe cómo diseccionar, experimentalmente manipular y explantes de cultivo enteros de la retina a partir de embriones de pollo. Los explantes pueden cultivarse durante aproximadamente 24 h, y ser sometidos a diferentes manipulaciones tales como la electroporación. Las principales ventajas son que el experimento no es dependiente de la supervivencia del embrión y que la concentración del reactivo introducido se puede variar y controlado con el fin de determinar y optimizar la concentración efectiva. Además, la técnica es rápida, barata y junto con su alta tasa de éxito experimental, se asegura reproducible resultados. Cabe destacar que sirve como un excelente complemento para los experimentos realizados in ovo.

Introducción

La retina es parte del sistema nervioso central y es, con su relativa simplicidad y la arquitectura celular bien caracterizada, un modelo popular para estudiar el desarrollo del sistema nervioso central. El ojo del embrión de pollo es relativamente grande en comparación con el resto del embrión. Por tanto, es de fácil acceso en ovo de manipulaciones experimentales, tales como inyecciones o electroporación, y sirve como una excelente herramienta para adquirir conocimientos sobre las células de la retina y la biología del desarrollo in vivo. A pesar de estas ventajas importantes, la supervivencia de los embriones puede ser baja cuando los experimentos son invasivas como con electroporaciones, inyecciones repetidas, o manipulaciones experimentales combinados.

La electroporación de plásmidos de ADN en el embrión de pollo in ovo es un importante y bien establecida técnica ^1. Permite para el etiquetado de las neuronas, la localización del destino celular, así como tractos neuronales en el centro de nervous sistema y permite ectópico expresión génica para analizar la función de proteínas in vivo. La técnica ha sido utilizada para los estudios de tubo neural ^2, hindbrain ^{3, 4} y la retina. Electroporación de retina embrionaria in ovo tiene algunas dificultades experimentales que están relacionados con la situación in vivo. La posición del ojo, debido a la plegado craneal del embrión, es relativamente cerca del corazón. Esta proximidad aumenta el riesgo de un paro cardíaco después de la electroporación, y el riesgo aumenta con la edad del embrión. Por otra parte, para acceder al ojo, es necesario abrir las membranas embrionarias, aumentando así el riesgo de sangrado, malformaciones y posterior viabilidad reducida. Al probar y optimizar un nuevo plásmido de ADN a menudo sin un resultado fenotípico conocido, estas limitaciones pueden disminuir la eficacia y el poder del método incluso para un experimentalista experimentado. Tal como se presenta en este protocolo, la cultura de la wexplante agujero retinal, que se define como a toda la retina neural con el epitelio de pigmento eliminado, es un método eficaz que complementa el enfoque en ovo.

Inyecciones intraoculares de reactivos químicos son relativamente fáciles de realizar in ovo. Sin embargo, la concentración eficaz y exacta de los reactivos inyectados dentro de la retina neural puede ser difícil de controlar totalmente. El volumen inyectado puede variar debido a las fugas y el sitio exacto de la inyección puede afectar tanto a la distribución del reactivo dentro del ojo y de la difusión a través del cuerpo vítreo. La variabilidad tendrá importantes implicaciones para la interpretación de los resultados cuando es decir, se determina una curva dosis-respuesta para un inhibidor de la enzima; particularmente si el efecto es pequeño y la ventana temporal del efecto es estrecho. Por otra parte, un solo ojo puede ser utilizado de cada embrión cuando se realiza en experimentos in ovo debido a los posibles efectos sistémicos a través del torrente sanguíneosobre el ojo contralateral. Coincidente edad es importante a la hora de estudiar el desarrollo y la variabilidad individual entre tratados y los embriones de control pueden conducir a la variabilidad experimental adicional.

Por estas razones, un ex ovo método basado en explantes de retina de embriones de pollo fue desarrollado, en el que la retina neural puede ser expuesto a un uniforme y controlada condición experimental in vitro. El presente protocolo fue desarrollado en base a protocolos anteriores ^5-9. Explantes de retina de la etapa (st) 20 (días embrionarias [E] 3) a ST31 (E7) embriones de pollo fueron disecados, culta y electroporación con una concentración de ADN plásmido definido o expuestos a un medio que contiene una concentración definida de un reactivo químico. El protocolo que aquí se presenta ha sido implementado con éxito en publicaciones recientes, utilizando varios reactivos químicos diferentes, incluyendo los reguladores de la vía de daño en el ADN, como KU55933, SB 218078 y NSC 109555 ditosylate, y el ciclo celular, tal como Cdk1 / 2 inhibidor III ^10,11.

Protocolo

Este protocolo se realiza de acuerdo con las recomendaciones de la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología".

1. Manipulación del huevo y la recogida de los ojos

1. Almacene los huevos Leghorn blancas a 12-14 ° C durante no más de 1 semana. Si está disponible, utilice un enfriador de vino refrigerada para almacenar los huevos fertilizados.
   Nota: Las temperaturas más altas del almacén conducen a un desarrollo anormal de los embriones, mientras que las temperaturas más bajas aumenta la mortalidad. Tiempo de almacenamiento extendido aumenta tanto la mortalidad y el desarrollo anormal.
2. Incubar los huevos en un 37,5 ° C y 60% humidificado incubadora de huevos con suave balanceo a una frecuencia de 5 veces por 24 horas.
3. Retire los huevos incubados de la incubadora de huevos a la edad embrionaria deseado.
   Nota: La edad del embrión de pollo se determina como el tiempo de incubación y se denota como día embrionario (E) o como etapas (st), De acuerdo con la serie de etapas de desarrollo descritos por Hamburguesa y Hamilton ^12.
4. Coloque los huevos seleccionados en la campana de flujo laminar. Limpiar la cáscara del huevo con etanol al 70% para evitar la contaminación del embrión.
   Nota: Llevar a cabo todos los procedimientos en condiciones asépticas con soluciones estériles http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions e instrumentos.
5. Toque en el lado del huevo firmemente contra una superficie dura para abrir una grieta en el huevo. Coloque el contenido en un 100 mm placa de Petri. Use una pequeña cuchara para transferir el embrión a una placa de Petri de 35 mm que contiene precalentado (37 ° C) 1x PBS para evitar que el tejido de secado.
6. Coloque la placa de Petri de 35 mm que contiene el tejido embrionario en un microscopio de disección estereoscópica binocular en la campana de flujo laminar. Decapitar el embrión apretando el cuello con unas pinzas finas y descartar el cuerpo.
7. Utilice unas pinzas finas para hacer una incisión ªáspera la boca, ventral a la vista. Comenzando en el sitio de la incisión, rasgar el tejido que rodea todo el ojo. Pellizcar el nervio óptico y quitar el ojo intacto de la cuenca del ojo. Recoge tanto el ojo izquierdo y derecho desde el mismo embrión para su uso, ya sea como el control o el ojo tratado.
8. Use una cuchara pequeña para transferir los ojos a una nueva placa de Petri de 35 mm que contiene precalentado (37 ° C) 1x PBS.

2. Preparación de toda la retina explantes

1. Utilice unas pinzas finas para retirar todo el tejido alrededor del ojo incluyendo la anlage escleral.
   Nota: El tejido se separará fácilmente dejando la retina en el cuerpo vítreo y la lente con el epitelio de pigmento intacta (Figura 1A-B).
2. Utilice unas pinzas finas pellizcar una pequeña incisión en el epitelio pigmentario en la parte dorsal del ojo sin dañar la retina neural (Figura 1C).
3. Utilice unas pinzas finas para arrancar suavemente abra la starti epitelio pigmentariong en el sitio de incisión, dejando la lente y toda la retina unido al cuerpo vítreo (Figura 1D). Mantener el ojo en caliente (37 ° C) 1x PBS para facilitar la eliminación del epitelio pigmentario.
   Nota: El epitelio de pigmento puede ser difícil de eliminar, en particular, a lo largo del cuerpo ciliar alrededor de la pupila, en la región anterior del ojo, ya lo largo de la fisura coroides. Por lo tanto, algunos de epitelio pigmentario se puede dejar en la retina neural (Figura 1E-F).

3. El tratamiento de toda la retina explantes

1. Electroporación de explantes de retina enteros
   Nota: La electroporación de los explantes de retina enteros puede realizarse directamente después de la etapa 2.
   1. Preparar medio de cultivo que contiene 1: 1 DMEM: F12 mezcla de nutrientes, 10% de FBS, 10 U / ml de penicilina estreptomicina, 5 mg / ml de insulina, y 2 mM L-glutamina.
   2. Corte un 1,5 ml desechables cubeta de plástico (12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm) (o cualquier pequeño recipiente capaz de contener la solución de 300-400 l) aproximadamente 8 mm de la parte inferior usando una sierra de hoja fina.
   3. Diluir el plásmido de ADN de elección en 1xDPBS a una concentración final de 0,1 mg / l.
   4. Encienda los parámetros electroporador y set de 15 V para ST20 - ST25 (E3-E4) retina y 20 V para ST26 - ST27 (E5) retina. Ajuste los pulsos repeticiones de 5 pulsos de 50 ms de pulso de longitud con intervalos de 1 seg. Utilice un generador de impulsos que puede ser controlado por un pedal en el suelo como se necesitarán ambas manos para sostener los electrodos en su lugar.
   5. Conecte dos paleta en forma de (, diam circular plana. 4 mm) electrodos de platino (Figura 2A) a la toma de salida del generador de impulsos.
      Nota: Los electrodos de platino utilizados en este protocolo fueron hechas por el taller de la universidad. Los electrodos fueron hechas de placa de platino de 0,1 mm "rondelles" (grado de platino: 950 Pt / 5 Cu). La conexión de 0,8 mm wire se aisló utilizando un tubo de plástico.
   6. Transferir cuidadosamente todo el explante de la retina desde el paso 2.3 a la cubeta (o recipiente pequeño equivalente) usando una pipeta Pasteur de polietileno con la punta cortada para adquirir el tamaño adecuado punta de apertura para el explante de la retina. Evite el uso de puntas de pipeta como la retina tiende a unir a la de plástico y desgarrar.
   7. Utilice una pipeta 100 l para eliminar suavemente todo el 1x PBS que rodea el explante teniendo cuidado de no tocar la retina la retina para evitar que se rompa.
   8. Añadir solución de plásmido 100 l a la cubeta para cubrir todo el explante de la retina. Presione suavemente el explante de la retina con pinzas si flota a la cima. El uso de fórceps o electrodos de situar el objetivo hacer frente a cualquier un lado de la cubeta y el nervio óptico hasta el fondo de la cubeta.
   9. Coloque el electrodo positivo en frente de la lente y el electrodo negativo detrás de la retina (Figura 2A), sin tocar el tejido.
   10. Aplique la corriente presionando el pedal. Compruebe si hay burbujas en los electrodos que indican la descarga con éxito.
   11. Usar una pipeta de 100 l para eliminar toda la mezcla de plásmido a partir de la cubeta sin dañar la retina. La mezcla de plásmido puede ser reutilizado tres a cinco veces.
   12. Llenar la cubeta con precalentado (37 ° C) 1x PBS. El uso de fórceps para desprender suavemente el explante de la retina de la pared de la cubeta. Después de la electroporación la retina a veces se cubrió con burbujas, lo que hace que se adhiera a la pared de la cubeta.
   13. Utilice la pipeta Pasteur de polietileno para transferir todo el explante de la retina en una placa de 24 pocillos que contenía 1 ml precalentado (37 ° C) medio de cultivo por pocillo. Incubar un explante de la retina por pocillo.
   14. Incubar el explante de la retina a 37 ° C en un agitador rotatorio, con una velocidad constante de 50 rpm, dentro de un incubador de células con 5% de CO ₂ durante 24 horas. La rotación es asegurar la máxima exposición al medio y para prevent adherencia de la retina a la parte inferior de la placa de 24 pocillos.
   15. Continúe con el paso 4.
2. El tratamiento de los explantes de retina enteras con reactivos químicos
   Nota: El tratamiento químico de los explantes de retina enteros puede realizarse directamente después de la etapa 2.
   1. Preparar medio de cultivo que contiene 1: 1 DMEM: F12 mezcla de nutrientes, 10% de FBS, 10 U / ml de penicilina estreptomicina, 5 mg / ml de insulina, y 2 mM L-glutamina.
   2. Use una cuchara pequeña para transferir el explante de la retina desde el paso 2.3 en una placa de 24 pocillos que contenía 1 ml precalentado (37 ° C) medio de cultivo por pocillo. Incubar un explante de la retina por pocillo.
   3. Incubar toda la retina explante durante 60 min a 37 ° C en un agitador rotatorio, con una velocidad constante de 50 rpm, dentro de un incubador de células con 5% de CO ₂ antes de añadir un reactivo químico o vehículo.
   4. Preparar la solución química, por ejemplo Cdk1 / 2 inhibidor III, un inhibidor de la progresión de la fase ^M-13, en una finalconcentración de 30 mM en DMSO.
   5. Retire la placa de 24 pocillos, que contiene todo el explante de la retina, de la incubadora celular. Añadir 10 l de reactivo químico o el vehículo (DMSO) directamente al medio de la retina, resultando en una concentración final de 300 nM Cdk1 / 2 inhibidor III en 0,01% de DMSO. Girar manualmente la placa de 24 pocillos para permitir una distribución uniforme del reactivo químico o vehículo en la solución.
   6. Incubar los explantes de retina a 37 ° C en un agitador rotatorio, con una velocidad constante de 50 rpm, dentro de un incubador con 5% de CO ₂ durante el tiempo deseado (hasta 24 h).
   7. Continúe con el paso 4.

4. Fijación y Congelación de Whole Retina Eexplants

1. Retire la placa de 24 pocillos que contiene el explante de la retina entera tratada de la incubadora celular.
2. Use una cuchara pequeña para transferir el explante de la retina a una placa de 24 pocillos que contienen 1 ml / pocillo helada paraformaldehído al 4% en 1xPBS. Incubate en hielo durante 15 min.
3. Use una cuchara pequeña para transferir todo el explante de la retina a una placa de 24 pocillos que contienen 1 ml / pocillo 1xPBS frío de hielo para lavar la retina. Incubar en hielo durante 10 min.
4. Use una cuchara pequeña para transferir todo el explante de la retina a una placa de 24 pocillos que contienen 1 ml / pocillo frío hielo sacarosa 30% en 1xPBS. Incubar en hielo durante 1-3 hr dependiendo del día embrionario de la retina. Para ST20 - ST25 (E3) retinas, se incuban durante 1 hora, retinas mayores necesitan más tiempo de incubación en sacarosa.
5. Use una cuchara pequeña para transferir todo el explante de la retina sobre una película de parafina con un contenido medio de montaje de aproximadamente 500 l de congelación criostato. Retire la mayor cantidad de sacarosa posible moviendo suavemente el explante de la retina en el medio de congelación utilizando la cuchara pequeña.
6. Transferir el explante de la retina a un molde de inclusión que contiene medio de congelación. Coloque el ojo para facilitar la futura seccionamiento. Ponga el molde de inclusión que contiene todo el explante de la retina en dry hielo hasta que el medio se congela sólido. Almacenar a -80 ° C.

Resultados

Este protocolo describe la preparación (Figura 1A-F) y el cultivo de los explantes de retina enteros a partir de embriones de pollo. Este protocolo se ha usado con éxito para explantes de retina a partir de embriones enteros de ST20 (E3) a ST31 (E7).

La electroporación de plásmidos de ADN en explantes de retina enteros permite para el etiquetado y el rastreo de las células progenitoras de la retina o sobre-expresión de diferentes productos génicos. Para los experiment...

Discusión

En este trabajo se presenta un protocolo detallado para la disección, la electroporación o tratamiento químico, y el cultivo de los explantes enteros retina de embriones de pollo. Este protocolo es fácil, rápido y permite tanto una alta tasa de éxito y reproducible resultados.

Electroporación de explantes de retina enteros produce grandes áreas de células que expresan el constructo de gen de interés. Es fácil de colocar correctamente los electrodos y para expone...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1xPBS (tablet)	Life technologies	18912-014
10x DPBS	Life technologies	14080-048
100 mm Petri dish	VWR	734-0006
100 μl pipette tips	VWR	613-0798
1.5 ml disposable plastic cuvette	Thomas Scientific	8495V01
24-well plate	Sigma Aldrich	D7039
35 mm Petri dish	VWR	391-1998
70% ethanol	Solveco	1054
Cdk1/2 inhibitor III	217714	Calbiochem	300 nM in 0.01% DMSO
Cell culture incubator	Thermo Forma
Dissecting microscope	Leica
DMEM	Life Technologies	41966-029
Electrodes			Platina, custom made
Electro square porator ECM 830	Harvard Apparatus
F12 Nutrient mix	Life Technologies	31331-028
FBS	Life Technologies	16140-071
Forceps	AgnThos	0108-5-PS
Freezing medium NEG50	Cellab, Sweden	6502
GFP expressing DNA plasmid (pZGs)
Humidified incubator	Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany	8204
Insulin	Sigma Aldrich	I9278-5ML
L-glutamine	Life Technologies	25030024
Mounting medium ProLong Gold with DAPI	Life Technologies	P36935
Paraffin film	VWR	291-1214P
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	16005-1KG-R
Peel-A-Way embedding mold	Sigma Aldrich	E6032
Penicillin streptomycin	Life Technologies	15140-122
PhosphoHistone 3 (PH3)	Millipore	06-570	Dilution 1/4,000
Platinum electrodes (custom made from "rondelles")	Sargenta	390-R (rondeller)	Dia: 4mm, 0.1 mm thickness
Platimun electrodes	Sonidel	CUY700P4L	Dia: 4 mm
Polyethylene pasteur pipette	VWR	612-2853
Rotator shaker	VWR	444-2900
Small spoon	VWR	231-2151
Sucrose	VWR	443815S
White Leghorn eggs			Local supplier
Wine cooler	WineMaster 24, Caso, Berlin Germany