일렉트로 화학 시약 트리트먼트의 닭 배아에서 전체 망막의 Explants

요약

이 프로토콜은, 해부 실험 조작과 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법을 설명합니다. 높은 성공률, 효능 및 재현성은 전기 및 / 또는 시약의 물질, 즉, 효소 억제제 플라스미드의 효과를 테스트하기 위해 필요할 때 이식편 배양 물은 유용하다.

초록

망막은 개발 중추 신경계에 대한 좋은 모델입니다. OVO / 생체 내에서 실험 조작에 대한 눈의 큰 규모와 가장 중요한 것은 접근성은 닭 배아 망막 다양하고 매우 효율적인 실험 모델을 만든다. 닭 인공 망막은 주사 또는 일렉트로 포 레이션에 의한 오보 타겟팅하기 쉽지만, 망막 내의 시약의 정확한 농도 및 효과가 충분히 제어하는 것이 어려울 수있다. 이것은 눈 또는 물질의 요철 확산에서 정확한 주사 부위, 누설의 변화에​​ 기인 할 수있다. 또한, 이러한 전기 천공 등 침습적 조작 후 기형 및 사망률의 주파수는 다소 높다.

이 프로토콜은 닭의 배아에서 전체 망막 외식을 배양하기위한 기술 비켜 예를 설명하고 시약에 망막의 제어 노출하는 방법을 제공한다. 프로토COL은 실험적으로, 해부 조작하고, 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법에 대해 설명합니다. 이식편은 약 24 시간 동안 배양 될 수 있으며, 이러한 전기 천공과 같은 다른 조작을 실시한다. 주요 장점은 실험 배아의 생존 및 도입 시약의 농도가 다양하고 효과적인 농도를 결정하고 최적화하기 위해 제어 될 수 의존하지 않는 것이있다. 또한, 기술은 높은 실험 성공률과 함께 신속한 저렴하고, 그것을 재현 보장 결과. 그것은 비켜에서 수행 실험에 훌륭한 보완의 역할을 강조한다.

서문

망막은 중추 신경계의 일부이며 그 단순함과 잘 특성화 셀룰러 아키텍처, 중추 신경계 발달을 연구하기위한 인기있는 모델이다. 닭 배아의 눈은 배아의 나머지 부분에 비해 상대적으로 크다. 따라서 이러한 주사 또는 전기로 실험 조작에 대한 OVO에 쉽게 접근 할 수 있으며, 망막 세포와 생체 내에서 발생 생물학에 대한 지식을 얻을 수있는 훌륭한 도구 역할을한다. 실험 electroporations, 반복 주사, 또는 결합 된 실험 조작과 같은 침략 때 이러한 주요 장점에도 불구하고, 배아의 생존율이 낮을 수있다.

OVO에서 닭 배아에 DNA 플라스미드의 전기가 중요하고 잘 확립 된 기술 ^1입니다. 그것은 중앙 NERV에서 세포의 운명뿐만 아니라 신경 책자의 추적, 뉴런의 표시를 허용시스템의 OU하며 생체 내에서 단백질의 기능 분석 이소성 유전자 발현을 허용한다. 이 기술은 ³ 후뇌, ⁴ 망막 신경 튜브 ^(2)의 연구에 사용되었다. OVO의 배아 망막의 전기는 생체 내 상황에 관련된 몇 가지 실험적인 어려움이있다. 태아의 뇌 폴딩으로 인한 눈의 위치, 중심에 비교적 가깝다. 이 근접 전기 다음 심장 마비의 위험 및 배아의 나이와 위험 증가를 증가시킨다. 또한, 눈에 액세스하기 위해서는 이에 출혈, 기형 및 후속 감소 가능성에 대한 위험을 증가 배아 멤브레인을 열 필요가있다. 테스트 및 공지 표현형 결과없이 종종 새로운 DNA 플라스미드를 최적화 할 때, 이러한 한계는 심지어 숙련 된 실험자 방법의 효능 및 전력을 감소시킬 수있다. 이 프로토콜, W의 문화에 제시된 바와 같이제거 색소 상피 세포와 전체 신경 망막으로 정의 구멍 망막 이식편은 비켜 접근 방식을 보완하는 효율적인 방법이다.

화학 시약의 안구 내 주사는 비켜에서 수행하기가 비교적 쉽다. 그러나, 신경 망막 내 시약의 주입 효과적이고 정확한 농도는 완전히 제어하기 어려울 수있다. 주입 된 부피는 누설에 따라 다를 수 있으며, 주사의 정확한 위치는 눈 내부의 시약의 유통 및 유리체를 통해 확산 모두에 영향을 미칠 수 있습니다. 가변성 즉, 효소 억제제에 대한 투여 량 반응 곡선을 결정 결과의 해석에 중요한 의미를 가질 것이다; 효과는 적고, 효과의 시간 창이 좁 경우 특히. 오보 실험에서 또한 수행 할 때, 단일 눈 인한 혈류를 통한 전신 효과 전위 각 배아에서 사용될 수있다반대편 눈 위에. 개발 및 처리 및 제어 배아 추가 실험 변동 될 수 있습니다 사이의 개별 변동을 연구 할 때 나이 일치가 중요하다.

이러한 이유로, 닭 배아 망막 이식편에 기초한 방법 오보 EX가되는 신경 망막을 균일하게 노출 될 수 있으며, 시험 관내에서의 실험 조건을 제어, 개발되었다. 본 프로토콜은 이전 프로토콜 ^5-9를 기반으로 개발되었다. 스테이지로부터 망막 이식편 (세인트) ST31 20 (3 배아 일 [E])을 (E7)는 닭 배아는 배양 해부 및 일렉트로 정의 DNA 플라스미드 농도 또는 화학 시약의 규정 농도를 함유하는 배지에 노출시켰다. 여기에 제시된 프로토콜은 성공적 KU55933, SB 218,078 및 109,555 NSC dito 같은 DNA 손상 경로의 레귤레이터를 포함하여 여러 가지 화학 시약을 사용하여, 최근의 간행물에서 구현 된이러한는 Cdk1 / 2 ^10,11 III 억제제로서 sylate 및 세포주기.

프로토콜

이 프로토콜은 "비전과 안과 연구 협회의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 가이드"의 권장 사항에 따라 수행된다.

1. 계란 취급과 눈 모음

1. 일주보다 더 이상에 대해 12 ~ 14 ℃에서 흰색 레그혼 계란을 저장합니다. 가능한 경우, 수정란을 저장하는 냉장 와인 쿨러를 사용한다.
   참고 : 낮은 온도가 사망률을 증가하면서 높은 저장 온도, 태아의 이상 개발로 이어집니다. 확장 된 저장 시간은 사망률과 이상 발생시 모두 증가.
2. 부드러운은 24 시간 당 5 배의 주파수에서 락으로 37.5 ° C 계란 60 % 가습 계란 인큐베이터를 품어.
3. 원하는 배아 나이에 계란 인큐베이터에서 배양 알을 제거합니다.
   주 : 닭 배아의 연령은 인큐베이션 시간으로 결정되고, 배아 일 (E) 또는 단계로 표시된다 (세인트을), 햄버거 해밀턴 ^(12)에 의해 설명 된 발달 단계의 일련의 제조 방법.
4. 층류 후드에서 선택한 알을 놓습니다. 배아의 오염을 방지하기 위해 70 %의 에탄올로 달걀 껍질을 닦습니다.
   참고 : 멸균 솔루션을 무균 상태에서 모든 절차를 실시 http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions 및 악기.
5. 계란을 개방 균열 단단히 하드 표면에 계란의 측면을 누릅니다. 100mm 페트리 접시의 콘텐츠를 배치합니다. 마르지 않도록 조직 예열 (37 ° C) 1X PBS를 함유하는 35mm 페트리 접시에 배아를 전송할 작은 스푼을 사용한다.
6. 층류 후드에서 양안 스테레오 비젼 해부 현미경에 배아 조직을 포함하는 35mm 페트리 접시를 놓습니다. 미세 집게로 목을 곤란하게하여 배아를 참살하고 시신을 버리십시오.
7. 번째 절개를 만들기 위해 미세 집게를 사용하여눈에 복부 거친 입,. 절개 부위부터 전체 눈 주변 조직을 오픈 찢어. 시신경을 조이고 눈 소켓에서 그대로 눈을 제거합니다. 제어 또는 처리 중 눈으로 사용하기 위해 동일한 배아로부터 좌측 및 우측 눈 모두 모아서.
8. 예열 (37 ° C) 1X PBS를 함유하는 새로운 35mm 페트리 접시에 눈을 전송할 작은 스푼을 사용한다.

전체 망막의 Explants 2. 준비

1. 공막 anlage을 포함하여 눈 주위의 모든 조직을 제거하는 미세 집게를 사용합니다.
   주 : 조직은 쉽게 색소 상피 손상 (도 1A-B)와 유리체 및 망막에 렌즈를두고 분리된다.
2. 신경 망막 (그림 1C)을 손상시키지 않고 눈의 지느러미 부분에 색소 상피 세포에 작은 절개를 끼지 미세 집게를 사용합니다.
3. 부드럽게 색소 상피의 starti을 열고 눈물 미세 집게를 사용하여절개 부위에 겨 렌즈와 유리체 (도 1D)에 연결된 전체 망막을 떠나. 색소 상피 세포의 제거를 용이하게 따뜻한 (37 ℃)에서 1X PBS 주시.
   색소 상피 세포는 눈의 전방 영역, 동공 주위 모양체 따라, 특히 분리하기가 어려울 수 있고, 맥락막 열창 따라 참고. 따라서, 색소 상피 세포의 일부가 망막 신경 (도 1E-F)에 남아있을 수있다.

전체 망막의 Explants 3. 치료

1. 전체 망막 외식의 전기
   참고 : 전체 망막 외식의 일렉트로는 2 단계 후 직접 수행 할 수 있습니다.
   1. 1 DMEM : F12 영양소 혼합물, 10 % FBS, 10 U / ml의 페니실린 스트렙토 마이신, 5 μg의 / ㎖ 인슐린, 및 2 mM L- 글루타민을 함유 한 배양 배지를 준비한다.
   2. 1.5 ml의 일회용 플라스틱 큐벳을 잘라 (12.5 mm X 12.5 mm X 45mM) (또는 미세 블레이드 톱을 사용하여 바닥에서) 약 8mm를 300 ~ 400 μL 솔루션을 보유 할 수있는 작은 용기.
   3. 0.1 μg의 / μL의 최종 농도 1xDPBS 선택의 DNA 플라스미드를 희석.
   4. ST20 15 V에 electroporator 및 설정 매개 변수를 켜십시오 - ST25 (E3-E4) 망막 및 ST26 20 V - ST27 (E5) 망막. 1 초 간격으로 50 밀리 초 펄스 길이의 5 펄스 펄스 반복을 설정합니다. 양손 곳에 전극을 유지하는 데 필요한 것 같이 바닥에 발 페달에 의해 제어 될 수있는 펄스 발생기를 사용한다.
   5. 두 개의 패들 형 (평면, 원형 DIAM을. 4mm) 연결 백금 전극 (그림 2A)를 펄스 발생기의 출력 소켓에.
      참고 :이 프로토콜에 사용되는 백금 전극 대학 워크샵에 의해 만들어졌다. 전극은 0.1 mm의 백금 판 "rondelles"(: 950 편 / 5 구리 백금 등급)에서 만들어졌다. 연결 0.8 mm 위스콘신재는 플라스틱 배관을 이용하여 절연 하였다.
   6. 조심스럽게 망막 절편에 맞는 팁 개방 크기를 취득 잘라 끝 폴리에틸렌 파스퇴르 피펫을 사용하여 큐벳 (또는 이에 상응하는 작은 용기) 단계 2.3에서 전체 망막 절편을 전송합니다. 망막은 플라스틱에 부착 떨어져 눈물 경향이 피펫 팁을 사용하지 마십시오.
   7. 부드럽게 찢어지지 않도록 망막을 만지지 않도록 망막 절편 돌보는 주변 전체 1X PBS를 제거하기 위해 100 μL 피펫을 사용합니다.
   8. 전체 망막 절편을 충당하기 위해 큐벳에 100 μL 플라스미드 솔루션을 추가합니다. 그것은 정상에 수레 경우 부드럽게 집게로 망막 절편을 누릅니다. 큐벳의 바닥 큐벳 및 시신경의 어느 한 쪽을 향하도록 렌즈를 위치 시키거나 집게 전극을 사용한다.
   9. 조직을 건드리지 않고, 렌즈와 망막 (도 2A) 뒤에 부극 앞에 정극을 배치.
   10. 발 페달을 눌러 전류를 적용합니다. 성공적인 방전을 나타내는 전극에 거품이 있는지 확인합니다.
   11. 망막을 손상시키지 않고, 큐벳 모든 플라스미드를 제거하기 위해 믹스 100 ㎕를 피펫을 사용한다. 플라스미드 믹스 3-5 번 재사용 할 수 있습니다.
   12. 사전 예열 (37 ° C) 1X PBS로 큐벳을 입력합니다. 부드럽게 큐벳의 벽에서 망막 절편을 분리 집게를 사용합니다. 전기 천공 후 망막은 때때로 큐벳의 벽에 부착하게하는 거품으로 덮여있다.
   13. 웰 당 1ml를 예열 된 (37 ℃) 배양 배지를 함유하는 24- 웰 플레이트에 전체 망막 이식편을 전송 폴리에틸렌 파스퇴르 피펫을 사용한다. 물론 당 하나의 망막 절편을 품어.
   14. 24 시간 동안 5 % CO ₂ 세포 배양기 안에, 50 RPM의 일정한 속도로, 회전 진탕 기에서 37 ° C에서 배양 한 망막 이식편. 회전 매체와 preve에 노출을 최대화하는 것이다24- 웰 플레이트의 바닥에 망막의 NT 밀착성.
   15. 4 단계로 진행합니다.
2. 화학 시약 전체 망막 외식의 치료
   주 : 전체 망막 이식편의 화학적 처리는 2 단계 후 직접 수행 될 수있다.
   1. 1 DMEM : F12 영양소 혼합물, 10 % FBS, 10 U / ml의 페니실린 스트렙토 마이신, 5 μg의 / ㎖ 인슐린, 및 2 mM L- 글루타민을 함유 한 배양 배지를 준비한다.
   2. 물론 당 (37 ° C를) 배지 예열 1 ml에 포함 된 24 웰 플레이트로 단계 2.3에서 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 물론 당 하나의 망막 절편을 품어.
   3. 화학 반응물 또는 비히클을 첨가하기 전에 5 % CO ₂ 세포 배양기 안에 50 RPM의 일정한 속도로, 회전 진탕 기에서 37 ℃에서 60 분 동안 전 배양 한 망막 이식편.
   4. 예를 들면, 화학 용액을 제조는 Cdk1 / 2 억제제 III, 최종 단계에서 M ^(13)의 진행 억제제,DMSO 30 μM의 농도.
   5. 세포 배양기에서, 전체 망막 절편을 포함, 24 웰 플레이트를 제거합니다. 0.01 % DMSO에서 300nm의는 Cdk1 / 2 억제제 III의 최종 농도 결과 망막 매체에 직접 화학 반응물 또는 비히클 (DMSO)의 10 μL를 추가한다. 수동 용액에서 화학 시약 또는 비히클의 균일 한 분포를 허용하도록, 24 웰 플레이트를 회전한다.
   6. 소정 시간 (최대 24 시간) 5 % CO ₂ 인큐베이터 안에 50 RPM의 일정한 속도로, 회전 진탕 기에서 37 ° C에서 배양 한 망막 이식편.
   7. 4 단계로 진행합니다.

4. 고정 및 전체 망막 Eexplants의 동결

1. 세포 배양기에서 처리 된 전체 망막 절편을 포함하는 24 웰 플레이트를 제거합니다.
2. 1 x PBS를 1 mL의 IN / 웰 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드를 함유하는 24 웰 플레이트에 망막 이식편을 전송할 작은 스푼을 사용한다. Incuba15 분 동안 얼음에 테.
3. 망막을 씻어 1 ㎖ / 잘 차가운 얼음 x PBS를 포함 된 24 웰 플레이트에 전체 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 10 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
4. 1 ㎖ / x PBS를 잘 차가운 얼음 30 % 자당을 포함하는 24 웰 플레이트에 전체 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 1-3 시간이 망막의 배아 일에 따라 얼음 위에서 배양한다. ST20은 - ST25 (E3) 망막은, 1 시간 동안 품어, 이전 망막은 자당에 이상 배양 시간이 필요합니다.
5. 약 500 μL 저온 유지 동결 설치 매체를 포함하는 파라핀 필름에 전체 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 부드럽게 작은 스푼을 사용하여 동결 배지에서 망막 이식편을 이동시킴으로써만큼 수크로오스 최대한 제거한다.
6. 동결 배지를 함유하는 주형에 매립 망막 이식편 옮긴다. 미래의 단면을 용이하게하기 위해 눈을 놓습니다. DR에 전체 망막 이식편을 함유하는 틀 매립 넣어매체까지 Y 얼음이 얼어있다. -80 ° C에서 보관하십시오.

결과

이 프로토콜은 닭의 배아에서 전체 망막 외식의 준비 (그림 1A-F)과 배양에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 성공적으로 ST31에 ST20 (E3)의 배아에서 전체 망막 외식 (E7) 사용되어왔다.

전체 망막 이식편으로 플라스미드 DNA의 전기 망막 전구 세포의 표지 및 추적 또는 과발현 다른 유전자 생성물의 허용한다. 전기 실험의 경우, 색소 상피 신중 ST25 (E4 ½) 배아의 세포핵...

토론

이 작품에서 해부, 전기 또는 화학 처리, 닭 배아에서 전체 망막 외식의 배양을위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 빠르고 용이하고 모두 높은 성공률을 허용하고 재현성 결과.

전체 망막 이식편의 전기 천공은 관심 유전자 구조를 발현하는 세포의 큰 영역을 생성한다. 올바르게 전극을 배치하고, 정의 된 플라스미드 DNA 농도 망막의 특정 부분을 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1xPBS (tablet)	Life technologies	18912-014
10x DPBS	Life technologies	14080-048
100 mm Petri dish	VWR	734-0006
100 μl pipette tips	VWR	613-0798
1.5 ml disposable plastic cuvette	Thomas Scientific	8495V01
24-well plate	Sigma Aldrich	D7039
35 mm Petri dish	VWR	391-1998
70% ethanol	Solveco	1054
Cdk1/2 inhibitor III	217714	Calbiochem	300 nM in 0.01% DMSO
Cell culture incubator	Thermo Forma
Dissecting microscope	Leica
DMEM	Life Technologies	41966-029
Electrodes			Platina, custom made
Electro square porator ECM 830	Harvard Apparatus
F12 Nutrient mix	Life Technologies	31331-028
FBS	Life Technologies	16140-071
Forceps	AgnThos	0108-5-PS
Freezing medium NEG50	Cellab, Sweden	6502
GFP expressing DNA plasmid (pZGs)
Humidified incubator	Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany	8204
Insulin	Sigma Aldrich	I9278-5ML
L-glutamine	Life Technologies	25030024
Mounting medium ProLong Gold with DAPI	Life Technologies	P36935
Paraffin film	VWR	291-1214P
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	16005-1KG-R
Peel-A-Way embedding mold	Sigma Aldrich	E6032
Penicillin streptomycin	Life Technologies	15140-122
PhosphoHistone 3 (PH3)	Millipore	06-570	Dilution 1/4,000
Platinum electrodes (custom made from "rondelles")	Sargenta	390-R (rondeller)	Dia: 4mm, 0.1 mm thickness
Platimun electrodes	Sonidel	CUY700P4L	Dia: 4 mm
Polyethylene pasteur pipette	VWR	612-2853
Rotator shaker	VWR	444-2900
Small spoon	VWR	231-2151
Sucrose	VWR	443815S
White Leghorn eggs			Local supplier
Wine cooler	WineMaster 24, Caso, Berlin Germany