Os explantes de retina inteiras de frango embriões para tratamentos de reagentes Eletroporação e Chemical

Resumo

Este protocolo descreve um método para dissecar, experimentalmente manipular e explantes de retina cultura completa de embriões de galinha. As culturas de explantes são úteis quando a taxa de sucesso elevada, eficácia e reprodutibilidade são necessários para testar os efeitos de plasmídeos para a electroporação e / ou substâncias de reagentes, isto é, inibidores enzimáticos.

Resumo

A retina é um bom modelo para o sistema nervoso central em desenvolvimento. O grande tamanho do olho e, mais importante a acessibilidade para manipulações experimentais em ovo / in vivo torna o frango retina embrionária um modelo experimental versátil e muito eficiente. Embora a retina da galinha é fácil de atingir in ovo por injecções intra-oculares ou electroporação, e a concentração eficaz exacta dos reagentes no interior da retina pode ser difícil de controlar totalmente. Isto pode ser devido a variações do local da injecção exacta, vazamento a partir do olho ou difusão desigual das substâncias. Além disso, a frequência de malformações e mortalidade após manipulações invasivos, tais como electroporação é bastante elevada.

Este protocolo descreve uma técnica ex ovo para a cultura de explantes de retina inteiras a partir de embriões de galinha e proporciona um método para a exposição controlada da retina para reagentes. O protocol descreve como dissecar, experimentalmente manipular e explantes de retina cultura inteiros a partir de embriões de galinha. Os explantes podem ser cultivados durante cerca de 24 horas e ser submetidos a manipulações diferentes, tais como electroporação. As principais vantagens são que a experiência não é dependente a sobrevivência do embrião e que a concentração do reagente introduzido pode ser variado e controlado, a fim de determinar e optimizar a concentração eficaz. Além disso, a técnica é rápida, barata e juntamente com a sua elevada taxa de sucesso experimental, que garante reprodutível resultados. Deve-se ressaltar que ele serve como um excelente complemento para experimentos realizados in ovo.

Introdução

A retina é parte do sistema nervoso central e é, com a sua relativa simplicidade e arquitetura celular bem caracterizada, um modelo popular para estudar o desenvolvimento do sistema nervoso central. O olho de embrião de galinha é relativamente grande em comparação com o resto do embrião. É, portanto, facilmente acessível in ovo para manipulações experimentais, tais como injecções ou eletroporação, e serve como uma ferramenta excelente para adquirir conhecimento sobre células da retina e biologia do desenvolvimento in vivo. Apesar destas vantagens principais, a sobrevivência dos embriões pode ser baixo quando as experiências são invasivos, como com electroporations, injeções repetidas, ou manipulações experimentais combinados.

A electroporação de plasmídeos de ADN para o embrião de galinha in ovo é uma técnica importante e bem estabelecido ^1. Ela permite a marcação de neurónios, o rastreio de destino celular, bem como vias neuronais no centro nervous sistema e que permite a expressão ectópica de genes para analisar a função da proteína in vivo. A técnica tem sido utilizada para estudos de tubo neural ^2, rombencéfalo ^{3, 4} e da retina. Eletroporação de retina embrionária in ovo tem algumas dificuldades experimentais que estão relacionados com a situação in vivo. A posição do olho, devido à dobragem cranial do embrião, é relativamente perto do coração. Esta proximidade aumenta o risco de paragem cardíaca após a electroporação, e o risco aumenta com a idade do embrião. Além disso, para aceder ao olho, que é necessário para abrir as membranas embrionárias, aumentando assim o risco de sangramento, malformações e subsequente viabilidade reduzida. Ao testar e otimizar um novo plasmídeo DNA, muitas vezes sem um resultado fenotípico conhecido, as limitações podem diminuir a eficácia e poder do método, mesmo para um experimentalista experiente. Conforme apresentado neste protocolo, a cultura do wfuro explante da retina, definida como toda a retina neural com o epitélio pigmentar removido, é um método eficiente em que complementa a abordagem in ovo.

Injecções intra-ocular de reagentes químicos são relativamente fáceis de executar in ovo. No entanto, a concentração eficaz e exacta de reagentes injectados dentro da retina neural pode ser difícil de controlar totalmente. O volume injectado pode variar devido a fugas e o local exacto de injecção podem afetar tanto a distribuição do reagente no interior do olho e a difusão através do corpo vítreo. A variabilidade terá grandes implicações para a interpretação dos resultados, quando isto é, uma curva dose-resposta para um inibidor da enzima é determinada; particularmente se o efeito é pequeno e a janela temporal do efeito é estreita. Além disso, apenas um único olho pode ser usado de cada embrião quando realizando experiências in ovo devido a possíveis efeitos sistémicos através da corrente sanguíneapara o olho contralateral. Combinando a idade é importante quando se estuda o desenvolvimento ea variabilidade individual entre tratados e embriões de controle pode levar a variabilidade experimental adicional.

Por estas razões, um ex ovo método baseado em explantes de retina de embriões de galinha foi desenvolvido, em que a retina neural pode ser exposto a uma uniforme e controlada condição experimental in vitro. O presente protocolo foi desenvolvido com base em protocolos anteriores ^5-9. Explantes de retina de fase (ST) 20 (dias embrionárias [E] 3) para ST31 (E7) embriões de galinha foram dissecadas, e cultivadas a electroporação com um plasmídeo de ADN definida concentração ou expostos a um meio contendo uma concentração definida de um reagente químico. O protocolo apresentado aqui foi implementado com sucesso em publicações recentes, usando vários reagentes químicos diferentes, incluindo reguladores da via danos no DNA, tais como KU55933, SB 218078, 109555 e NSC ditosylate, e o ciclo celular, tais como Cdk1 / 2 inibidor III ^10,11.

Protocolo

Este protocolo é realizada de acordo com as recomendações contidas no "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia".

1. Egg Manuseio e coleção dos olhos

1. Armazenar ovos brancos Leghorn em 12-14 ° C durante não mais de uma semana. Se possível, use um refrigerador de vinho refrigerado para armazenar os ovos fertilizados.
   Nota: temperaturas mais elevadas armazenar levar ao desenvolvimento anormal dos embriões, enquanto temperaturas mais baixas aumenta a mortalidade. Tempo de armazenamento prolongado aumenta a mortalidade e desenvolvimento anormal.
2. Incubar os ovos em uma de 37,5 ° C e 60% incubadora de ovos umidificado com balanço delicado a uma frequência de 5 vezes por 24 horas.
3. Remover os ovos incubados na incubadora de ovos com a idade embrionária pretendida.
   Nota: A idade do embrião de galinha é determinada como o tempo de incubação e é denotado como dia embrionário (E) ou como fases (r), De acordo com a série de estágios de desenvolvimento descritas por Hamburger e Hamilton ^12.
4. Coloque os ovos selecionados na capela de fluxo laminar. Limpar a casca de ovo com 70% de etanol para evitar a contaminação do embrião.
   Nota: Realizar todos os procedimentos sob condições assépticas com soluções estéreis http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions e instrumentos.
5. Toque no lado do ovo firmemente contra uma superfície dura para rachar o ovo. Coloque o conteúdo em uma placa de Petri de 100 milímetros. Utilize uma pequena colher a transferência do embrião para um prato de 35 mm de Petri contendo pré-aquecido (37 ° C) 1x PBS para evitar que o tecido de secagem.
6. Coloque o prato de 35 milímetros Petri contendo o tecido embrionário em um microscópio binocular de dissecação estereovisão na capela de fluxo laminar. Decapitar o embrião por beliscar o pescoço com uma pinça fina e descartar o corpo.
7. Use uma pinça fina para fazer uma incisão tháspero boca, ventral para o olho. Começando no local da incisão, rasgar o tecido circundante o olho inteiro. Beliscar fora do nervo óptico e remover o olho intacto de cavidade ocular. Recolha tanto o olho esquerdo e direito do mesmo embrião para o uso como o controle ou o olho tratado.
8. Utilize uma pequena colher para transferir os olhos para uma nova placa de Petri 35 mm contendo pré-aquecido (37 ° C) PBS 1x.

2. Preparação de explantes de retina inteiras

1. Use uma pinça fina para remover todo o tecido em volta do olho incluindo a anlage escleral.
   Nota: O tecido irá separar facilmente deixando a retina no corpo vítreo e a lente com o epitélio pigmentar intacta (Figura 1A-B).
2. Utilize uma pinça fina para comprimir uma pequena incisão no epitélio pigmentado na parte dorsal do olho sem danificar a retina neural (Figura 1C).
3. Utilize uma pinça fina para rasgar suavemente abrir o epitélio pigmentar starting no local da incisão, deixando a lente e a retina inteira ligada ao corpo vítreo (Figura 1D). Manter o olho em água morna (37 ° C) 1x PBS para facilitar a remoção do epitélio de pigmento.
   Nota: O epitélio do pigmento podem ser difíceis de remover, em particular ao longo do corpo ciliar em torno da pupila, na região anterior do olho, e ao longo da fissura coróide. Portanto, alguns do epitélio de pigmento pode ser deixada sobre a retina neural (Figura 1E-F).

3. Tratamento de toda retinianas explantes

1. A electroporação de explantes de retina inteiras
   Nota: A electroporação de explantes de retina inteiras pode ser realizada directamente após o passo 2.
   1. Prepare meio de cultura contendo 1: 1 DMEM: F12 mistura de nutrientes, 10% de FBS, 10 U / ml de penicilina estreptomicina, 5 ug / ml de insulina, e 2 mM de L-glutamina.
   2. Cortar um 1,5 ml cuvette de plástico descartável (12,5 mm x 12,5 milímetros x 45 mm) (ou qualquer recipiente pequeno capaz de conter uma solução de 300-400 uL) de aproximadamente 8 mm a partir do fundo usando uma serra de lâminas finas.
   3. Dilui-se o plasmídeo de ADN de escolha em 1xDPBS a uma concentração final de 0,1 ug / ul.
   4. Ligue os parâmetros electroporador e definido para 15 V para ST20 - ST25 (E3-E4) retina e 20 V para ST26 - st27 (E5) retina. Defina as Pulso-repetições para 5 pulsos de 50 ms de pulso de comprimento com intervalos de 1 segundo. Usar um gerador de impulsos que pode ser controlada por um pedal de pé sobre o chão, como será necessário duas mãos para segurar os eléctrodos no lugar.
   5. Conecte dois pá em forma (flat, diam circular. 4 mm) eletrodos de platina (Figura 2A) à tomada de saída no gerador de impulsos.
      Nota: Os eletrodos de platina utilizados neste protocolo foram feitas pela oficina da universidade. Os eléctrodos foram feitos a partir de 0,1 mm placa de platina "rondelles" (grau de platina: Pt 950 / Cu 5). O conectando 0,8 milímetros wire foi isolada usando tubos de plástico.
   6. Transferir cuidadosamente todo o explante de retina a partir do passo 2.3 para a tina (ou pequeno recipiente equivalente) usando uma pipeta de Pasteur de polietileno com a ponta cortada para adquirir o tamanho da ponta de abertura certo para o explante de retina. Evite o uso de pontas de pipeta como a retina tende a anexar ao plástico e rasgar.
   7. Use uma pipeta de 100 mL para remover suavemente toda a 1x PBS em torno do explante retina tomando cuidado para não tocar na retina para evitar rasgar.
   8. Adicionar 100 ul de solução de plasmídeo para a cuvete para cobrir todo o explante da retina. Pressione cuidadosamente o explante de retina com uma pinça se ele flutua para cima. Use uma pinça ou eléctrodos para posicionar a lente para uma face lateral da cuvete e do nervo óptico qualquer para o fundo da tina.
   9. Colocar o eléctrodo positivo em frente da lente e o eléctrodo negativo atrás da retina (Figura 2A), sem tocar no tecido.
   10. Aplique o atual pressionando para baixo o pé-pedal. Verifique se há bolhas nos eletrodos indicando descarga bem sucedido.
   11. Usar uma pipeta de 100 uL para remover toda a mistura de plasmídeo a partir da cuvete sem danificar a retina. A mistura de plasmídeo pode ser reutilizada de três a cinco vezes.
   12. Encha-se a cuvete com pré-aquecido (37 ° C) PBS 1x. Utilize uma pinça para separar suavemente o explante da retina a partir da parede da cuvete. Após a electroporação, por vezes, a retina está coberta com bolhas, o que torna aderir à parede da cuvete.
   13. Utilizar a pipeta de Pasteur de polietileno para transferir toda a retina explante em uma placa de 24 poços contendo 1 ml de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura por poço. Incubar um explante da retina por poço.
   14. Incubar o explante da retina, a 37 ° C num agitador rotor, com uma velocidade constante de 50 rpm, no interior de uma célula incubadora com 5% de CO ₂ durante 24 horas. A rotação é garantir o máximo de exposição ao meio e prevent adesão da retina para o fundo da placa de 24 poços.
   15. Vá para a etapa 4.
2. O tratamento de explantes de retina inteiras com reagentes químicos
   Nota: O tratamento químico de explantes de retina inteiras pode ser realizada directamente após o passo 2.
   1. Prepare meio de cultura contendo 1: 1 DMEM: F12 mistura de nutrientes, 10% de FBS, 10 U / ml de penicilina estreptomicina, 5 ug / ml de insulina, e 2 mM de L-glutamina.
   2. Utilize uma pequena colher para transferir o explante da retina a partir do passo 2.3 em uma placa de 24 poços contendo 1 ml de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura por poço. Incubar um explante da retina por poço.
   3. Incubar todo o explante de retina durante 60 minutos a 37 ° C num agitador rotor, com uma velocidade constante de 50 rpm, no interior de uma célula incubadora com _5% de CO2 antes da adição de um reagente químico ou veículo.
   4. Preparar a solução química, por exemplo Cdk1 / 2 inibidor III, um inibidor da progressão da fase M ^13, no final de umconcentração de 30 uM em DMSO.
   5. Remova a placa de 24 poços, contendo todo o explante da retina, da incubadora celular. Adicionam-se 10 ul do reagente químico ou o veículo (DMSO) directamente ao meio da retina, o que resulta numa concentração final de 300 nM Cdk1 / 2 inibidor III em 0,01% de DMSO. Rodar manualmente a placa de 24 poços para permitir uma distribuição uniforme do reagente químico ou veículo na solução.
   6. Incubar os explantes de retina, a 37 ° C num agitador rotor, com uma velocidade constante de 50 rpm, dentro de uma incubadora com 5% de CO ₂ durante o tempo desejado (até 24 horas).
   7. Vá para a etapa 4.

4. Fixação e Congelamento de Whole Retinal Eexplants

1. Remova a placa de 24 poços, que contém todo o explante da retina tratadas da incubadora celular.
2. Utilize uma pequena colher para transferir o explante da retina para uma placa de 24 poços contendo 1 ml / poço de gelo frio paraformaldeído a 4% em 1xPBS. Incubate em gelo durante 15 min.
3. Utilize uma pequena colher para transferir todo o explante da retina para uma placa de 24 poços contendo 1 mL / poço 1xPBS geladas para lavar a retina. Incubar em gelo durante 10 min.
4. Utilize uma pequena colher para transferir todo o explante da retina para uma placa de 24 poços contendo 1 ml / poço de gelo frio de sacarose a 30% em 1xPBS. Incubar em gelo durante 1-3 horas dependendo do dia embrionário da retina. Para ST20 - ST25 (E3) as retinas, incubar durante 1 hora, as retinas idosos necessitam de mais tempo de incubação em sacarose.
5. Use uma colher pequena para transferir todo o explante de retina para uma película de parafina contendo cerca de 500 ul congelamento cryostat meio de montagem. Remover o máximo possível de sacarose como movendo-se delicadamente o explante da retina no meio de congelamento, utilizando a pequena colher.
6. Transferir o explante da retina para um molde contendo a incorporação de meio de congelação. Posicione o olho para facilitar futuro seccionamento. Coloque o molde contendo a incorporação de todo o explante de retina no dry gelo até o meio é congelado. Armazenar a -80 ° C.

Resultados

Este protocolo descreve a preparação (Figura 1A-M) e a cultura de explantes de retina inteiras a partir de embriões de galinha. Este protocolo foi usado com sucesso para a retina a partir de explantes de embriões inteiros de ST20 (E3) para ST31 (E7).

Eletroporação de plasmídeos de DNA em explantes de retina inteiras permite a rotulagem e rastreamento de células progenitoras da retina ou a sobre-expressão de diferentes produtos de genes. Para as experiências de elec...

Discussão

Neste trabalho, um protocolo detalhado para dissecção, eletroporação ou tratamento químico, e cultivo de explantes de retina inteiras de embriões de galinha é apresentado. Este protocolo é fácil, rápido e permite tanto uma elevada taxa de sucesso e reprodutível resultados.

A electroporação de explantes de retina inteiros produz grandes áreas de células que expressam a construção de gene de interesse. É fácil de posicionar correctamente os eléctrodos e p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1xPBS (tablet)	Life technologies	18912-014
10x DPBS	Life technologies	14080-048
100 mm Petri dish	VWR	734-0006
100 μl pipette tips	VWR	613-0798
1.5 ml disposable plastic cuvette	Thomas Scientific	8495V01
24-well plate	Sigma Aldrich	D7039
35 mm Petri dish	VWR	391-1998
70% ethanol	Solveco	1054
Cdk1/2 inhibitor III	217714	Calbiochem	300 nM in 0.01% DMSO
Cell culture incubator	Thermo Forma
Dissecting microscope	Leica
DMEM	Life Technologies	41966-029
Electrodes			Platina, custom made
Electro square porator ECM 830	Harvard Apparatus
F12 Nutrient mix	Life Technologies	31331-028
FBS	Life Technologies	16140-071
Forceps	AgnThos	0108-5-PS
Freezing medium NEG50	Cellab, Sweden	6502
GFP expressing DNA plasmid (pZGs)
Humidified incubator	Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany	8204
Insulin	Sigma Aldrich	I9278-5ML
L-glutamine	Life Technologies	25030024
Mounting medium ProLong Gold with DAPI	Life Technologies	P36935
Paraffin film	VWR	291-1214P
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	16005-1KG-R
Peel-A-Way embedding mold	Sigma Aldrich	E6032
Penicillin streptomycin	Life Technologies	15140-122
PhosphoHistone 3 (PH3)	Millipore	06-570	Dilution 1/4,000
Platinum electrodes (custom made from "rondelles")	Sargenta	390-R (rondeller)	Dia: 4mm, 0.1 mm thickness
Platimun electrodes	Sonidel	CUY700P4L	Dia: 4 mm
Polyethylene pasteur pipette	VWR	612-2853
Rotator shaker	VWR	444-2900
Small spoon	VWR	231-2151
Sucrose	VWR	443815S
White Leghorn eggs			Local supplier
Wine cooler	WineMaster 24, Caso, Berlin Germany