Whole Retinal Explantaten aus Hühnerembryonen für die Elektroporation und Reagens-Behandlungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um zu sezieren, experimentell zu manipulieren und Kultur ganze Retina-Explantaten aus Hühnerembryonen. Das Explantat-Kulturen sind nützlich, wenn hohe Erfolgsrate, Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit sind notwendig, um die Auswirkungen von Plasmiden für die Elektroporation und / oder Reagenz Substanzen, dh, enzymatischer Inhibitoren zu testen.

Zusammenfassung

Die Retina ist ein gutes Modell für die Entwicklung des zentralen Nervensystems. Die Größe des Auges und vor allem die Zugänglichkeit für experimentelle Manipulationen in ovo / in vivo macht das Huhn embryonalen Netzhaut eine vielseitige und sehr effiziente Versuchsmodell. Obwohl das Huhn Netzhaut ist leicht, in ovo durch intraokulare Injektion oder Elektroporation Ziel kann die effektive und genaue Konzentration der Reagenzien in der Netzhaut schwierig zu voll Kontrolle. Dies kann aufgrund von Abweichungen von der genauen Injektionsstelle, Leckage aus dem Auge oder unebenen Diffusion der Substanzen sein. Ferner wird die Frequenz von Fehlbildungen und Mortalität nach invasive Manipulationen wie Elektroporation ziemlich hoch.

Dieses Protokoll beschreibt einen ex ovo Technik zum Züchten gesamte Retina Explantaten aus Hühnerembryonen und liefert ein Verfahren zur kontrollierten Exposition der Retina Reagenzien. Die protocol beschreibt, wie zu zerlegen, experimentell zu manipulieren, und Kultur ganze Retina-Explantaten aus Hühnerembryonen. Die Explantate können die etwa 24 h, kultiviert werden und verschiedene Manipulationen wie Elektroporation unterworfen werden. Die wesentlichen Vorteile sind, dass der Versuch nicht abhängig vom Überleben der Embryos und daß die Konzentration des eingebrachten Reagens kann variieren, und um zu bestimmen und zu optimieren, die effektive Konzentration gesteuert werden. Weiterhin ist die Technik eine schnelle, billige und zusammen mit ihren hohen experimentellen Erfolgsquote, reproduzierbar sichergestellt, Ergebnisse. Es sollte betont werden, dass es als eine ausgezeichnete Ergänzung zum Experiment in ovo ausgeführt dient.

Einleitung

Die Retina ist ein Teil des zentralen Nervensystems, und es ist mit seiner relativen Einfachheit und gut charakterisierte Zellarchitektur, ein beliebtes Modell zum Studium der Entwicklung des zentralen Nervensystems. Das Auge des Hühnerembryo ist im Vergleich zu dem Rest des Embryos relativ groß. Es ist daher in ovo für experimentelle Manipulationen, wie Injektionen oder Elektroporation leicht zugänglich ist, und dient als ein hervorragendes Werkzeug, um das Wissen über Netzhaut Zell- und Entwicklungsbiologie in vivo zu gewinnen. Trotz dieser großen Vorteile, kann das Überleben der Embryonen niedrig sein, wenn Experimente sind invasive, wie mit Elektroporationen, wiederholte Injektionen oder kombinierte experimentelle Manipulationen.

Elektroporation von DNA-Plasmiden in den Hühnerembryo in ovo ist ein wichtiges und gut etablierte Technik ^1. Es ermöglicht die Kennzeichnung von Neuronen, das Aufspüren des Zellschicksals und neuronalen Bahnen im zentralen nervous System und es ermöglicht die ektopische Genexpression auf Proteinfunktion in vivo zu analysieren. Die Technik hat sich für die Untersuchung der neuronalen ^Rohr 2 eingesetzt wurde, Rautenhirn ^{3 und 4} Retina. Elektroporation der embryonalen Retina in ovo hat einige experimentellen Schwierigkeiten, die der Situation in vivo in Zusammenhang stehen. Die Position des Auges, durch den Schädel Faltung des Embryos, relativ nahe an das Herz. Diese Nähe erhöht das Risiko von Herzstillstand nach der Elektroporation und das Risiko steigt mit dem Alter des Embryos. Darüber hinaus, um das Auge gelangen, ist es notwendig, die Eihüllen zu öffnen, wodurch das Risiko für Blutungen, Fehlbildungen und anschließende verminderte Lebensfähigkeit zu. Bei der Prüfung und Optimierung einer neuen DNA-Plasmid, oft ohne bekannte phänotypische Ergebnis können diese Einschränkungen der Wirksamkeit und Leistung des Verfahrens selbst für einen erfahrenen Experimentator zu verringern. Wie in diesem Protokoll der Kultur der w vorgestelltLoch retinalen Explantat, definiert als die gesamte neurale Retina mit Pigmentepithel entfernt wird, ist eine effiziente Methode, die in ovo Ansatz ergänzt.

Intraokulare Injektionen von chemischen Reagenzien sind relativ einfach in ovo auszuführen. Jedoch kann die effektive und genaue Konzentration der injizierten Reagenzien innerhalb des neuralen Retina schwierig, vollständig zu steuern. Das injizierte Volumen durch Lecks variieren und die genaue Stelle der Injektion kann sowohl die Verteilung des Reagens in das Auge und die Diffusion durch den Glaskörper zu beeinflussen. Die Variabilität wird erhebliche Auswirkungen auf die Interpretation der Ergebnisse, wenn dh eine Dosis-Antwort-Kurve für einen Enzym-Inhibitor festgestellt haben; Insbesondere, wenn der Effekt klein ist und die Zeitfenster der Effekt ist gering. Darüber hinaus nur ein einziges Auge kann von jedem Embryo bei der Durchführung von in-ovo-Experimente durch, um mögliche systemische Wirkungen über den Blutstrom verwendet werdenauf das andere Auge. Alter Anpassung ist wichtig, wenn das Studium der Entwicklung und die individuelle Variabilität zwischen behandelten und Kontroll Embryonen zu zusätzlichen experimentellen Variabilität führen.

Aus diesen Gründen wurde ein ex ovo Verfahren basierend auf retinale Explantaten aus Hühnerembryos entwickelt, bei dem das neurale Retina kann zu einer gleichmäßigen und kontrollierten ausgesetzt experimentellen Bedingungen in vitro werden. Die vorliegende Protokoll wurde auf der Grundlage früherer Protokolle ^5-9 entwickelt. Retinal Explantate aus Stufe (St) 20 (embryonalen Tagen [E] 3) bis ST31 (E7) Hühnerembryonen wurden präpariert, kultiviert und Elektroporation mit einer definierten DNA-Plasmid-Konzentration oder zu einem Medium, das eine definierte Konzentration eines chemischen Reagens ausgesetzt wird. Das hier vorgestellte Protokoll wurde erfolgreich in jüngsten Veröffentlichungen implementiert, unter Verwendung mehrerer verschiedener chemischer Reagenzien, einschließlich Regulatoren der DNA-Schaden-Weges, wie KU55933, SB 218.078 und NSC 109555 ditosylate und der Zellzyklus wie Cdk1 / 2-Inhibitor III ^10,11.

Protokoll

Dieses Protokoll wird in Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von der Association for Research in Vision und Augenheilkunde" durchgeführt.

1. Egg Handhabung und Augen Sammlung

1. Bewahren weißen Leghorn Eier bei 12-14 ° C nicht länger als 1 Woche. Falls verfügbar, verwenden Sie einen gekühlten Weinkühler, um die befruchtete Eier zu speichern.
   Hinweis: Höhere Speichertemperaturen führen zu abnormalen Entwicklung von Embryonen, niedrigere Temperaturen erhöht Sterblichkeit. Erweiterte Speicherzeit erhöht sowohl die Mortalität und abnorme Entwicklung.
2. Die Eier in einer 37,5 ° C und 60% befeuchteter Eibrutkasten inkubiere unter leichtem Schütteln bei einer Frequenz von 5 mal pro 24 Stunden.
3. Entfernen Sie die eingelegten Bruteier aus dem Eibrutkasten an der gewünschten embryonalen Alter.
   Hinweis: Das Alter des Hühnerembryo ist als die Zeit der Inkubation bestimmt und als embryonale Tagen (E) oder als Stufen bezeichnet (st) Entsprechend der Reihe der von Hamburger und Hamilton ¹² beschriebenen Entwicklungsstadien wirksam.
4. Legen Sie die ausgewählten Eier im Laminarströmungshaube. Wischen der Eischale mit 70% Ethanol, um eine Verunreinigung des Embryos zu vermeiden.
   Hinweis: Führen Sie alle Verfahren unter aseptischen Bedingungen mit sterilen Lösungen http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions und Instrumente.
5. Tippen Sie auf die Seite des Eis fest gegen eine harte Oberfläche zu knacken das Ei. Platzieren Sie den Inhalt in einer 100 mm Petrischale. Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um den Embryo auf eine 35 mm Petrischale mit vorgewärmten (37 ° C) 1x PBS, um das Gewebe vor dem Austrocknen zu verhindern, übertragen.
6. Legen Sie die 35 mm Petrischale mit den embryonalen Gewebes auf eine binokulare Stereo Binokular in der Sterilbank. Enthaupten den Embryo durch Kneifen der Hals mit feinen Pinzetten und entsorgen Sie den Körper.
7. Verwenden feinen Pinzette, um einen Einschnitt th machenGrob der Mund, Bauch für das Auge. Beginnend an der Stelle des Einschnitts, der das gesamte Auge umgebende Gewebe aufzureißen. Kneifen Sie den Sehnerv und aus der Augenhöhle zu entfernen die intakte Auge. Sammeln sowohl das linke und rechte Auge von der gleichen Embryos zur Verwendung als entweder die Kontrolle oder die behandelten Auge.
8. Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um die Augen zu einem neuen 35-mm-Petrischale mit vorgewärmten (37 ° C) 1x PBS übertragen.

2. Herstellung von Whole Retinal Explantate

1. Verwenden feinen Pinzette, um alle Gewebe um das Auge zu entfernen, einschließlich der skleralen anlage.
   Hinweis: Das Gewebe wird leicht lösen Verlassen der Netzhaut auf den Glaskörper und die Linse mit dem Pigmentepithel intakt (1A-B).
2. Verwenden feinen Pinzette, ein kleiner Schnitt in die Pigmentepithel an der dorsalen Teil des Auges, ohne die neuronale Netzhaut (1C) einklemmen.
3. Verwenden feinen Pinzette vorsichtig aufreißen das Pigmentepithel starting an der Stelle des Einschnitts, wobei das Objektiv und die gesamte Netzhaut in den Glaskörper (1D) befestigt ist. Das Auge halten in warmem (37 ° C) 1x PBS, um das Entfernen des Pigmentepithels erleichtern.
   Anmerkung: Die Pigmentepithel schwierig sein kann, zu entfernen, insbesondere entlang der Ziliarkörper um die Pupille in die vordere Augenbereich, und entlang der Ader Fissur. Daher können einige der Pigmentepithel auf der neuronalen Netzhaut (1E-F) verbleiben.

3. Behandlung von Whole Retinal Explantate

1. Elektroporation von ganzen Netzhaut-Explantate
   Anmerkung: Die Elektroporation ganzer retinalen Explantate können direkt nach der Stufe 2 durchgeführt werden.
   1. Vorbereitung Kulturmedium, das 1: 1 DMEM: F12 Nutrient Mix, 10% FBS, 10 U / ml Penicillin-Streptomycin, 5 ug / ml Insulin und 2 mM L-Glutamin.
   2. Schneiden Sie ein 1,5-ml-Einweg-Kunststoff-Küvetten (12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm) (oder einem kleinen Behälter halten können 300-400 & mgr; l Lösung) etwa 8 mm von der Unterseite mit einem feinen Blatt-Säge.
   3. Verdünnt das DNA-Plasmid der Wahl in 1xDPBS bis zu einer Endkonzentration von 0,1 ug / ul.
   4. Schalten Sie die Elektroporator und eingestellten Parameter auf 15 V für ST20 - ST25 (E3-E4) Netzhaut und 20 V für ST26 - ST27 (E5) Netzhaut. Stellen Sie die Pulswiederholungen bis 5 Impulsen von 50 ms Pulslänge bei 1 sec Intervallen. Verwenden Sie einen Impulsgenerator, der von einem Fußpedal auf dem Boden gesteuert werden können, da beide Hände benötigt werden, um die Elektroden in Position zu halten sein werden.
   5. Schließen Sie zwei Paddle-förmig (flach, rund Durchm. 4 mm) von Platinelektroden (2A) an die Ausgangsbuchse des Impulsgenerators.
      Hinweis: Die Platinelektroden in diesem Protokoll verwendet wurden von der Universität Werkstatt. Die Elektroden wurden aus 0,1 mm Platinplatte "Rondelle" (950 Pt / Cu 5 Platin-grade) hergestellt. Das Verbindungs ​​0,8 mm wire wurde mit Kunststoffschlauch isoliert.
   6. Die ganze Netzhaut Explantation sorgfältig über aus Schritt 2.3 in die Küvette (oder gleichwertig kleinen Behälter) mit einem Polyethylen Pasteur-Pipette mit der Spitze abgeschnitten, um den richtigen Tipp-Öffnungsgröße für die Netzhaut Explantation zu erwerben. Vermeiden Sie die Verwendung von Pipettenspitzen, wie die Netzhaut neigt dazu, mit dem Kunststoffbringen und zu zerreißen.
   7. Verwenden Sie ein 100 ul Pipette vorsichtig die gesamte 1x PBS rund um die Netzhaut Explantation die Betreuung der Netzhaut, um nicht zu zerreißen nicht zu berühren.
   8. 100 l Plasmid-Lösung in die Küvette, die gesamte Netzhaut Explantation zu decken. Drücken Sie vorsichtig den Netzhaut Explantat mit einer Pinzette, wenn es an die Spitze treibt. Verwenden einer Pinzette oder Elektroden, um die Linse zu positionieren, um jede der einen Seite der Küvette und den Sehnerv zum Boden der Küvette zugewandt.
   9. Platzieren der positiven Elektrode vor der Linse und der negativen Elektrode hinter der Netzhaut (2A), ohne Berührung des Gewebes.
   10. Übernehmen Sie die aktuelle durch Niederdrücken des Fußpedals. Prüfen Sie, ob Luftblasen an den Elektroden anzeigt erfolgreiche Entlastung.
   11. Verwenden Sie ein 100 ul-Pipette, um alle, die das Plasmid-Mix aus der Küvette ohne Beschädigung der Netzhaut zu entfernen. Die Plasmid-Mix kann drei bis fünf mal wiederverwendet werden.
   12. Füllen Sie die Küvette mit vorgewärmten (37 ° C) 1x PBS. Verwenden einer Pinzette vorsichtig entfernen Sie die Netzhaut Explantation von der Wand der Küvette. Nach der Elektroporation der Retina wird manchmal mit Blasen bedeckt ist, die sie an die Wand der Küvette haften lässt.
   13. Verwenden Sie die Polyethylen Pasteur-Pipette, um die gesamte Netzhaut Explantation in eine 24-Well-Platte mit 1 ml vorgewärmten (37 ° C) Kulturmedium pro Vertiefung übertragen. Inkubieren einer Netzhaut Explantat pro Vertiefung.
   14. Inkubieren retinalen Explantat bei 37 ° C auf einem Rotator Treuer, mit einer konstanten Geschwindigkeit von 50 UpM in einer Zelle Inkubator mit _5% CO 2 für 24 Std. Die Rotation ist, um maximale Exposition gegenüber dem Medium und preve sicherzustellen,nt Haftung der Netzhaut an der Unterseite der Platte mit 24 Vertiefungen.
   15. Fahren Sie mit Schritt 4.
2. Behandlung der gesamten Retina Explantate mit chemischen Reagenzien
   Hinweis: Die chemische Behandlung der gesamten Netzhaut Explantate können direkt nach der Stufe 2 durchgeführt werden.
   1. Vorbereitung Kulturmedium, das 1: 1 DMEM: F12 Nutrient Mix, 10% FBS, 10 U / ml Penicillin-Streptomycin, 5 ug / ml Insulin und 2 mM L-Glutamin.
   2. Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um die Netzhaut Explantation aus Schritt 2.3 in eine 24-Well-Platte mit 1 ml vorgewärmten (37 ° C) Kulturmedium pro Vertiefung übertragen. Inkubieren einer Netzhaut Explantat pro Vertiefung.
   3. Inkubieren des gesamten Retina Explantat für 60 min bei 37 ° C auf einem Rotator Treuer, mit einer konstanten Geschwindigkeit von 50 UpM in einer Zelle Inkubator mit 5% CO _{2 vor der} Zugabe eines chemischen Reagens oder Vehikel.
   4. Vorbereitung der chemischen Lösung, beispielsweise Cdk1 / 2-Inhibitor III, einem Inhibitor der M-Phasenverlauf ¹³ in einer endgültigenKonzentration von 30 & mgr; M in DMSO.
   5. Entfernen Sie den 24-Well-Platte, das die gesamte Netzhaut Explantation, aus der Zelle Inkubator. Zugabe von 10 ul des chemischen Reagens oder Vehikel (DMSO) direkt auf die Netzhaut-Medium, was zu einer Endkonzentration von 300 nM Cdk1 / 2-Inhibitor III in 0,01% DMSO. Manuell drehen Sie den 24-Well-Platte, um für eine gleichmäßige Verteilung des chemischen Reagens oder ein Fahrzeug in der Lösung zu ermöglichen.
   6. Das Retina Explantate bei 37 ° C inkubieren, auf einem Rotator Treuer, mit einer konstanten Geschwindigkeit von 50 Umdrehungen pro Minute, in einer Brutschrank mit _5% CO 2 für die gewünschte Zeit (bis zu 24 h).
   7. Fahren Sie mit Schritt 4.

4. Fixierung und Einfrieren von Whole Retinal Eexplants

1. Entfernen Sie die Platte mit 24 Vertiefungen, die das behandelte gesamte Netzhaut Explantation aus der Zelle Inkubator.
2. Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um die Netzhaut Explantation auf eine 24-Well-Platte mit 1 ml / Vertiefung eiskaltem 4% Paraformaldehyd in 1xPBS übertragen. Incubate auf Eis für 15 min.
3. Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um die gesamte Netzhaut Explantation auf eine 24-Well-Platte mit 1 ml / Vertiefung eiskalt 1xPBS um die Netzhaut zu waschen übertragen. Inkubieren auf Eis für 10 min.
4. Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um die gesamte Netzhaut Explantation auf eine 24-Well-Platte mit 1 ml / Vertiefung eiskaltem 30% Saccharose in 1xPBS übertragen. Inkubieren auf Eis für 1-3 h in Abhängigkeit von der embryonalen Tag der Retina. Für ST20 - ST25 (E3) der Netzhaut, Inkubation für 1 h, müssen ältere Retina längere Inkubationszeit in Saccharose.
5. Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um die gesamte Netzhaut Explantation auf eine Paraffinschicht, die etwa 500 & mgr; Kryostaten Einfrieren Montagemedium zu übertragen. Entfernen Sie so viel Saccharose wie möglich durch leichtes Bewegen des retinalen Explantation im Gefriermedium mit dem kleinen Löffel.
6. Übertragen Sie die Netzhaut Explantation auf eine Einbettform haltige Gefriermedium. Positionieren Sie den Blick auf künftige Schnitte erleichtern. Legen Sie die Einbettform, das die gesamte Netzhaut Explantation auf dry Eis, bis das Medium fest gefroren. Bei -80 ° C.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung (1A-F) und das Kultivieren der gesamten Netzhaut Explantaten aus Hühnerembryonen. Dieses Protokoll wurde erfolgreich für die gesamte Netzhaut Explantaten aus Embryonen von st20 (E3) zu ST31 (E7) verwendet.

Elektroporation von DNA-Plasmiden zu ganzen Netzhaut-Explantate ermöglicht die Kennzeichnung und Rückverfolgung von retinalen Vorläuferzellen oder Überexpression von verschiedenen Genprodukten. Zur Elektroporation Experimen...

Diskussion

In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll für die Präparation, Elektroporation oder chemische Behandlung, und das Kultivieren der gesamten Netzhaut Explantaten aus Hühnerembryonen wird vorgestellt. Dieses Protokoll ist einfach, schnell und ermöglicht sowohl eine hohe Erfolgsrate und reproduzierbare Ergebnisse.

Elektroporation von ganzen Netzhaut-Explantate produziert große Bereiche der Zellen, die das Gen-Konstrukt von Interesse exprimieren. Es ist leicht, die...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1xPBS (tablet)	Life technologies	18912-014
10x DPBS	Life technologies	14080-048
100 mm Petri dish	VWR	734-0006
100 μl pipette tips	VWR	613-0798
1.5 ml disposable plastic cuvette	Thomas Scientific	8495V01
24-well plate	Sigma Aldrich	D7039
35 mm Petri dish	VWR	391-1998
70% ethanol	Solveco	1054
Cdk1/2 inhibitor III	217714	Calbiochem	300 nM in 0.01% DMSO
Cell culture incubator	Thermo Forma
Dissecting microscope	Leica
DMEM	Life Technologies	41966-029
Electrodes			Platina, custom made
Electro square porator ECM 830	Harvard Apparatus
F12 Nutrient mix	Life Technologies	31331-028
FBS	Life Technologies	16140-071
Forceps	AgnThos	0108-5-PS
Freezing medium NEG50	Cellab, Sweden	6502
GFP expressing DNA plasmid (pZGs)
Humidified incubator	Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany	8204
Insulin	Sigma Aldrich	I9278-5ML
L-glutamine	Life Technologies	25030024
Mounting medium ProLong Gold with DAPI	Life Technologies	P36935
Paraffin film	VWR	291-1214P
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	16005-1KG-R
Peel-A-Way embedding mold	Sigma Aldrich	E6032
Penicillin streptomycin	Life Technologies	15140-122
PhosphoHistone 3 (PH3)	Millipore	06-570	Dilution 1/4,000
Platinum electrodes (custom made from "rondelles")	Sargenta	390-R (rondeller)	Dia: 4mm, 0.1 mm thickness
Platimun electrodes	Sonidel	CUY700P4L	Dia: 4 mm
Polyethylene pasteur pipette	VWR	612-2853
Rotator shaker	VWR	444-2900
Small spoon	VWR	231-2151
Sucrose	VWR	443815S
White Leghorn eggs			Local supplier
Wine cooler	WineMaster 24, Caso, Berlin Germany