تعطيل المضادة للضراوة من الممرضة الأغشية الحيوية باستخدام المهندسة النصاب القانوني-التبريد Lactonases

Summary

Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.

Abstract

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm's tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.

Introduction

خيارات العلاج للأمراض المعدية قد تعقدت بسبب الزيادة السريعة في البكتيريا المقاومة للأدوية المتعددة التي هي في مأمن من مجموعة واسعة من المضادات الحيوية ^1. مع ارتفاع معدلات المراضة والوفيات من مقاومة العدوى البكتيريا بوساطة، هناك حاجة لتصعيد عمليات التنمية المخدرات و / أو البحث عن بدائل مضادة للبكتيريا أفضل لتحسين الخيارات العلاجية. في الآونة الأخيرة، ونهج معاداة الفوعة تكتسب الفائدة نظرا إمكاناتها في منع الفوعة عبر وسائل غير جراثيم، وبالتالي التخفيف من مخاطر آليات المقاومة ^2.

النصاب الاستشعار هو "المفتاح الرئيسي في الفوعة البكتيرية وتعطل هذه الظاهرة يشير هو وسيلة لمكافحة الفوعة واعد ضد المرضية ^3. بداية الفوعة يتطلب تراكم الجزيئات النصاب في البيئة خارج الخلية بعد الوصول إلى الكثافة السكانية البكتيرية حرجة. كما الراهنجزيئات الروم منتشر مرة أخرى إلى مصفوفة الخلايا، ملزم مع مستقبلاتها وما شابه ذلك يؤدي إلى تفعيل عوامل الفوعة وكذلك الجينات المرتبطة بمقاومة المضادات الحيوية وتشكيل بيوفيلم ^4. في العام، واختلال نصاب الاستشعار ينطوي على تثبيط جزيء النصاب والتفاعل مستقبلات دون التأثير على المسارات الأيضية الأساسية. وبالتالي، فإنه ليس لديها أي تأثير مباشر على نمو الخلايا. لأنه لا شبهة اللياقة البدنية، وهناك الحد الأدنى من ضغط اختيار البكتيريا في التطور واكتساب مقاومة ضد مثل هذه العلاجات ^5. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تعطيل النصاب الاستشعار تتداخل مع آليات الحماية البكتيرية الكامنة، كما في حالة تشكيل بيوفيلم، الذي يوفر حماية من العوامل المضادة للبكتيريا واستضافة الاستجابات المناعية.

وتشير التقديرات إلى أن 99٪ من الميكروبات على الأرض موجودة في المصفوفات مثل بيوفيلم معقدة، منح مزايا البقاء على قيد الحياة حاسمة في الكائنات الحية الدقيقة التي تعيش داخل الهياكل جنوب شرقي ^6. الأهم من ذلك، تشكيل هذه المجالات اطئة هو سبب العدوى المكتسبة من المستشفيات الأكثر المستمرة والمزمنة ^7. راكدة بومانية هي واحدة من مسببات الأمراض البشرية الكبرى مقترن العدوى المكتسبة من المستشفيات العالمية ويعزى الفوعة إلى حد كبير إلى النصاب الاستشعار تشكيل بيوفيلم بوساطة ^8. وقد استخدمت إنزيمات التبريد النصاب القانوني بنجاح في تعطيل النصاب بوساطة نقل الإشارة من خلال استهداف مجموعة من المركبات المعروفة باسم N -acyl اكتونات homoserine (AHLs) التي تنتجها البكتيريا سالبة الجرام ^9. وقد وسعت العديد من الدراسات أيضا على استخدام هذه الانزيمات لمنع المرضية البكتيرية من خلال الحد من أعداد عامل الفوعة التعبير وخلية في الأغشية الحيوية ^10،11. للأسف، لا يزال هناك نقص في مظاهرة اضح من الاستخدام الفعال للإنزيمات التبريد النصاب القانوني ضد تشكيل بيوفيلم عن طريق الجراثيم البكتيرية. الوقد تم إعادة محاولات لاستخدام مثبطات النصاب (نظائرها AHL)، بدلا من الانزيمات التبريد النصاب، لتعطيل A. تشكيل بيوفيلم baumannii ^12. على الرغم من أن هذه الطريقة من استخدام الجزيئات الصغيرة مثبطات هو نهج صحيح، واستدامة التوافر البيولوجي في استخدامات متعدية يمكن أن يشكل تحديا. على العكس من ذلك، يمكن استخدام إنزيمات التبريد النصاب الحفازة تحايل على قضية التوافر البيولوجي كإنزيمات اكثر سهولة نحو تجميد على أسطح الطبية الأجهزة الآثار العلاجية.

هنا، نحن تصف تقييم آثار المهندسة lactonases-التبريد النصاب القانوني من Geobacillus kaustophilus (GKL) ¹³ على تشكيل بيوفيلم البكتيرية، وذلك باستخدام تلطيخ البنفسجي الكريستال ومتحد البؤر المجهر الليزر (CLSM). هذه الدراسة هي أول مظاهرة ناجحة تعطل بيوفيلم في A. ذات الصلة سريريا سلالة baumannii S1 باستخدام أنزيمات التبريد النصاب. الطرق وصفتفي هذه الدراسة هي مفيدة لتقييم فعالية أخرى إنزيمات التبريد النصاب القانوني في جهود التنمية العلاجية اللاحقة ضد الجراثيم سلبية الغرام المسببة للأمراض.

Protocol

1. كريستال البنفسج الكميات من تشكيل بيوفيلم في A. baumannii S1

1. تنمو ثقافة 5 مل من A. baumannii S1 في استذابة مرق (LB) (تريبتون 10 ز / L، خلاصة الخميرة 5 جم / لتر) عند 30 درجة مئوية في حاضنة تهتز (220 دورة في الدقيقة) لمدة 16 ساعة.
2. ضبط ثقافة A. baumannii S1 إلى OD المطلوب _{600 من} 0.8. باستخدام لوحة 96-جيدا، تطعيم ثقافة البكتيريا (1: 100 تمييع) في LB الطازجة التي تحتوي على 10 ميكرولتر من تنقية GKL انزيم (40 ملغ / مل). الحجم النهائي الثقافة الجديدة هو 100 ميكرولتر.
3. إعداد ثقافة السيطرة كذلك؛ هذا لن يحتوي على أي الانزيم. كرر ظروف مماثلة لانتاج العدد المطلوب من مكررات.
4. تغطية لوحة مع غطاء ووضعه في 10 L عاء من البلاستيك مختوم. احتضان لوحة عند 30 درجة مئوية لمدة 3 ساعات قبل إزالة بلطف وسائل الإعلام.
5. إضافة 100 ميكرولتر آخر من الطازجة المتوسطة LB إلى البئر واحتضان لوحة لمدة 21 ساعة على 30 ° C.
6. بعد الفترة الثانية من الحضانة، وإزالة بلطف كافة وسائل الإعلام. يغسل البكتيريا خلية العوالق مع 200 ميكرولتر الماء المعقم. ضمان أنه لا يوجد سوى اضطراب الحد الأدنى للخلايا أثناء الغسل.
7. إضافة 100 ميكرولتر من 1٪ محلول الكريستال البنفسجي إلى كل بئر واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT. إزالة الحل الكريستال البنفسجي غسل جيدا مع 200 ميكرولتر الماء المعقم. تكرار غسل مرتين أكثر.
8. إضافة 100 ميكرولتر من حامض الخليك 33٪ على كل بئر واحتضان لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز لطيف؛ هذا سوف تذوب الصبغة.
9. Quantitate كمية بيوفيلم تشكلت من خلال قياس الامتصاصية من الكريستال البنفسجي في 600 نانومتر. كمية من الكريستال البنفسجي يتناسب مع كمية بيوفيلم تشكيلها.

2. متحد البؤر الليزر الضوئي المجهري للA. baumannii S1 بيوفيلم

1. تنمو ثقافة 5 مل من A. baumannii S1 في LB عند 30 درجة مئوية في حاضنة تهتز (220 دورة في الدقيقة) لمدة 16 ساعة.
2. ميلاديمجرد ثقافة A. baumannii S1 إلى OD المطلوب _{600 من} 0.8. باستخدام 35 ملم ذات القاع الزجاجي μ-الصحن، تطعيم ثقافة البكتيريا (1: 100 تمييع) في LB الطازجة التي تحتوي على 30 ميكرولتر من تنقية GKL انزيم (40 ملغ / مل). الحجم النهائي الثقافة الجديدة هو 1 مل.
3. تغطية μ-صحن مع غطاء ووضعه في 10 L عاء من البلاستيك مختوم. احتضان μ-الطبق عند 30 درجة مئوية لمدة 3 ساعات قبل إزالة بلطف وسائل الإعلام. إضافة 30 ميكرولتر من تنقية إنزيم GKL ومتوسطة جديدة، ليصل إلى الحجم الكلي لل1 مل. احتضان لمدة ساعة 21 آخرين في 30 ° C.
4. كرر الخطوة 2.3 واحتضان μ-طبق لمدة 24 ساعة أخرى في 30 ° C. ثم، وإزالة وسائل الإعلام بلطف.
5. إضافة 500 ميكرولتر من 5 ميكروغرام / مل اليكس فلوو 488 مترافق جنين القمح راصة (WGA) الذائب في محلول ملحي متوازن هانك (HBSS) إلى μ-صحن واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. هذا وصمة عار على بيوفيلم تشكيلها. إزالة حل تلطيخ وغسل رانه ميكرون-صحن 2 مل من HBSS. كرر الخطوة غسل واحد مزيد من الوقت.
6. إضافة 500 ميكرولتر من 3.7٪ الفورمالديهايد الذائبة في HBSS واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. هذا سوف إصلاح بيوفيلم على μ-الصحن. يغسل μ-الطبق مرة واحدة مع 2 مل من HBSS ثم قم بإزالة الحل تماما. يمكن تخزين μ-صحن ثابت مع بيوفيلم في الظلام في 4 درجات مئوية قبل التصوير CLSM.
7. للتصوير CLSM والتحليل، استخدم 63 مرات التكبير لتوليد 97 رزمة لكل صورة مع فاصل من 0.21 ميكرون في كومة.

النتائج

في التجربة الكميات الكريستال البنفسجي، واستخدمت اثنين من الانزيمات والتبريد النصاب القانوني لإثبات جدوى في تعطيل تشكيل بيوفيلم: من النوع البري GKL وتحسين متحولة مزدوج GKL (E101G / R230C). وقد تبين أن كلا من الأنزيمات لإثبات النشاط lactonase ضد 3-هيدروكسي-decanoyl-L-hom...

Discussion

في كلتا المجموعتين من التجربة، A. تم مثقف baumannii S1 في LB سائل الإعلام دون كلوريد الصوديوم حيث تركيز الملح العالية قد يقلل من كمية بيوفيلم التي شكلتها البكتيريا ^15. وجود مثل هذه الأداة يمكن أن نقلل من كمية بيوفيلم تشكيلها، وكذلك آثار إنزيمات التبريد النصاب ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	BD	211705
Yeast Extract	BD	212750
96-well plate	Costar	3596
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C6158
Acetic Acid	Lab-Scan	PLA00654X	Caution: Flammable
μ-Dish	Ibidi	80136
Alex Fluo 488-conjugated WGA	Invitrogen	W11261
Hank’s balanced salt solution	Invitrogen	141475095
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Caution: Corrosive
Synergy HT Microplate Reader	BioTek
1X-81 Inverted Fluorescence Microscope	Olympus