Анти-вирулентных Срыв патогенных биопленки с помощью конструктивных Кворум-тушения Lactonases

Резюме

Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.

Аннотация

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm's tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.

Введение

Варианты лечения инфекционных заболеваний осложняется быстрым ростом множественной лекарственной устойчивостью бактерий, которые устойчивы к широкому спектру антибиотиков ^1. С высокой заболеваемости и смертности от устойчивых бактерий-опосредованные инфекции, существует необходимость эскалации процессов развития наркотиков и / или исследовать более антибактериальными альтернативы для улучшения терапевтических возможностей. В последнее время, подход анти-вирулентность набирает интерес, учитывая его потенциал в предотвращении вирулентность не через бактерицидные методы, следовательно, смягчению рисков механизмов сопротивления ^2.

Кворум зондирования является «главный выключатель" в бактериальной вирулентности и нарушение этого явления сигнализации является перспективным методом борьбы с вирулентность против патогенезе ^3. Наступление вирулентности требует накопления кворума молекул в внеклеточной среде после критического бактериального плотность населения достигается. Как-квоМолекулы ром диффундируют обратно в внутриклеточного матрикса, связывание с их родственными рецепторами приводит к активации факторов вирулентности, а также генов, ассоциированных с устойчивостью к антибиотикам и биопленки ^4. В общем, нарушение кворума зондирования включает ингибирование кворума молекулу и взаимодействие рецептора, не затрагивая основных метаболических путей. Следовательно, он не имеет никакого прямого последствия на рост клеток. Так фитнес не будет нарушена, есть минимальное давление отбора для бактерий развиваться и сопротивление против таких методов лечения ⁵ получить. Кроме того, нарушение кворума зондирования может мешать присущих бактериальных защитных механизмов, как в случае образования биопленки, который обеспечивает защиту от антибактериальных агентов и иммунного ответа.

Считается, что 99% микробов на Земле существуют в сложных биопленки, как матриц, присвоении важные преимущества выживания для микроорганизмов, обитающих внутри йESE структуры ^6. Что еще более важно, формирование этих сидячих доменов является причиной самых упорных и хронических внутрибольничных инфекций ^7. Acinetobacter baumannii является одним из основных человеческих патогенов, что связано с глобальными внутрибольничных инфекций и его вирулентность в значительной степени объясняется кворума зондирования -опосредованной образование биопленки ^8. Кворум-тушения ферменты были успешно использованы в срыве кворума опосредованной трансдукции сигнала от ориентации группу соединений, известных как N-ацил гомосериндегидрогеназу лактонов (AHLs), которые производятся грамотрицательных бактерий ^9. Несколько исследований также расширены с использованием этих ферментов блокировать бактериальный патогенез путем уменьшения экспрессии фактором вирулентности и клеточных чисел в биопленок ^10,11. К сожалению, остается отсутствие ощутимой демонстрацией эффективного использования кворума закалки ферментов против образования биопленки бактериальными патогенами.Re были попытки использовать ингибиторы кворума (AHL), аналоги вместо кворума закалки ферменты, чтобы сорвать А. baumannii образование биопленки ^12. Хотя этот метод с использованием ингибиторов малых молекул является действительным подход, поддерживая его биодоступность в трансляционных использования может быть проблемой. Напротив, использование каталитических кворумных закалки ферментов может обойти проблему биодоступность, как ферменты более пригодными в сторону иммобилизации на поверхности биомедицинских устройств для терапевтического воздействия.

Здесь мы опишем оценку последствий инженерных кворума закалки lactonases из Geobacillus kaustophilus (ГКЛ) ¹³ об образовании бактериальной биопленки, используя кристалл фиолетовый окрашивание и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). Это исследование является первым успешная демонстрация нарушения биопленки в клинически значимых А. baumannii S1 напряжение с помощью кворума закалки ферменты. Описанные методыв данном исследовании являются полезными для оценки эффективности других кворума закалки ферментов в последующих терапевтических усилий в области развития против патогенных грамотрицательных бактерий.

протокол

1. Кристалл Фиолетовый Количественное образование биопленки в А. baumannii S1

1. Растут культуры 5 мл А. baumannii S1 в лизогении бульона (LB) (триптон 10 г / л, дрожжевой экстракт 5 г / л) при 30 ° С в инкубаторе со встряхиванием (220 оборотов в минуту) в течение 16 часов.
2. Отрегулируйте культуры А. baumannii S1 до желаемого _OD 600 0,8. Использование 96-луночного планшета, инокуляции бактерий культуры (разведение 1: 100) в свежем LB, содержащей 10 мкл очищенного фермента ГКЛ (40 мг / мл); Окончательный объем новой культуры составляет 100 мкл.
3. Подготовка управления культуры, а также, это не содержит каких-либо фермент. Повторите аналогичные условия, с получением желаемого количества повторов.
4. Накройте тарелку с крышкой и поместить его в герметичный 10 л пластиковый контейнер. Инкубируйте планшет при 30 ° С в течение 3 часов, прежде чем осторожно извлечением носителя.
5. Добавить еще 100 мкл свежей среды LB к колодцу и инкубируйте в течение 21 ч при 30 ° С.
6. После второго периода инкубации, осторожно удалить все носители. Вымойте планктона бактерий ячейку с 200 мкл стерильной воды. Убедитесь, что существует только минимальное нарушение в клетках во время стирки.
7. Добавить 100 мкл 1% раствора кристаллического фиолетового в каждую лунку и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре. Извлеките кристаллическим фиолетовым раствором путем промывания скважины с 200 мкл стерильной воды. Повторите мыть для более двух раз.
8. Добавить 100 мкл 33% уксусной кислоты в каждую лунку и инкубировать в течение 15 мин с легким встряхиванием; это будет распустить краситель.
9. Определения количества биопленки, образованную путем измерения оптической плотности кристаллического фиолетового при 600 нм. Количество кристаллического фиолетового пропорциональна количеству биопленки, образованной.

2. конфокальной лазерной сканирующей микроскопии А. baumannii S1 биопленки

1. Растут культуры 5 мл А. baumannii S1 в LB при 30 ° С в инкубаторе со встряхиванием (220 оборотов в минуту) в течение 16 часов.
2. Объявлениетолько культура А. baumannii S1 до желаемого _OD 600 0,8. Использование 35 мм со стеклянным дном М блюдо, инокуляции бактерий культуры (разведение 1: 100) в свежем LB, содержащей 30 мкл очищенного фермента ГКЛ (40 мг / мл); Окончательный объем новой культуры составляет 1 мл.
3. Обложка М-Блюдо с крышкой и поместить его в герметичный 10 л пластиковый контейнер. Выдержите М-блюдо на 30 ° С в течение 3 ч перед удалением мягко СМИ. Добавить 30 мкл очищенного фермента и ГКЛ свежей средой, доводя его до общего объема 1 мл. Инкубировать в течение еще 21 ч при 30 ° С.
4. Повторите шаг 2,3 и инкубируют в М-Dish еще в течение 24 ч при 30 ° С. Затем снимите СМИ осторожно.
5. Добавить 500 мкл 5 мкг / мл Алекс Fluo-488 конъюгированного агглютинина зародышей пшеницы (WGA), растворенного в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS) с мю-Петри и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин; это будет пятно сформированную биопленку. Удалить окрашивания раствор и промойте тон мю-Блюдо с 2 мл HBSS. Повторите стадии промывки еще раз.
6. Добавить 500 мкл 3,7% формальдегида, растворенного в HBSS и инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин; это будет исправить биопленки на х-блюдо. Вымойте М блюдо один раз 2 мл HBSS и затем снимите решение полностью. Μ-блюдо фиксируется с биопленки могут быть сохранены в темноте при 4 ° С до визуализации CLSM.
7. Для CLSM изображений и анализа, использовать 63-кратное увеличение, чтобы генерировать 97 стеков за изображения с интервалом 0,21 мкм на стеке.

Результаты

В количественного эксперимента кристаллического фиолетового, две кворума закалки ферменты используются для демонстрации возможности в срыве биопленки: дикого типа ГКЛ и улучшенный GKL двойной мутант (E101G / R230C). Оба фермента были показаны, чтобы продемонстрировать lactona...

Обсуждение

В обоих наборов эксперимента А. baumannii S1 культивировали в LB среде без NaCl в высокой концентрации соли может уменьшить количество биопленки, образованную бактерий ^15. Наличие такого артефакта может недооценивать количество биопленки, образованный, а также эффекты кворумных зак?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	BD	211705
Yeast Extract	BD	212750
96-well plate	Costar	3596
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C6158
Acetic Acid	Lab-Scan	PLA00654X	Caution: Flammable
μ-Dish	Ibidi	80136
Alex Fluo 488-conjugated WGA	Invitrogen	W11261
Hank’s balanced salt solution	Invitrogen	141475095
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Caution: Corrosive
Synergy HT Microplate Reader	BioTek
1X-81 Inverted Fluorescence Microscope	Olympus