Engineered Nisabı giderici Lactonases kullanarak Patojen Biyofilmler Anti-öldürücü bozulması

Özet

Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.

Özet

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm's tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.

Giriş

Bulaşıcı hastalıklar için tedavi seçenekleri, antibiyotik ilaçlar ¹ bir geniş bağışıklık çok ilaca dayanıklı bakterilerin hızlı artışın daha karmaşık bir. Dirençli bakteri kaynaklı enfeksiyonlardan yüksek morbidite ve mortalite oranları ile, ilaç geliştirme süreçlerini yükselmek ve / veya tedavi seçenekleri geliştirmek için daha iyi anti-bakteriyel alternatifleri keşfetmek için bir ihtiyaç vardır. Son zamanlarda, anti-virülans yaklaşımı dolayısıyla direnç mekanizmaları ² risklerini azaltmaya olmayan bakteri yöntemlerle virülansını önlemede potansiyeli verilen faiz kazanıyor.

Nisabı algılamalı bakteriyel virülans ve bu sinyal olgusunun bozulması bir 'ana şalteri' patogenezinde ³ karşı vadeden bir anti-virülans yöntemdir olduğunu. Kritik bakteriyel nüfus yoğunluğu ulaşıldıktan sonra virülansına başlangıcı dışı ortamda nisabı moleküllerin birikimini gerektirir. As quoROM molekülleri, komşu reseptörlerine bağlanma hastalık oluşturma faktörlerinin aktivasyonu gibi antibiyotik direnci ve biyofilm ⁴ ile ilişkili genlerin yol açar, hücre içi matris geri yayılır. Genel, nisap algılama bozulması Birincil metabolik etkilemeden nisabı molekülü ve reseptör etkileşimi inhibe içerir. Bu nedenle, hücre büyümesi üzerinde doğrudan bir ima yoktur. Fitness tehlikeye olmadığından, gelişmeye ve bu tür tedaviler ⁵ karşı direnç kazanmak için bakteriler için en az seçim baskı var. Buna ek olarak, çekirdek-algılama bozulması, anti-bakteriyel maddeler karşı koruma sağlar ve immün yanıtları ana biyofilm, olduğu gibi, doğal bakteri koruyucu mekanizmaların engelleyebilir.

Bu Dünya'da mikropların% 99 th içinde yaşayan mikroorganizmalar için çok önemli hayatta kalma avantajı kazandıran, karmaşık biyofilm gibi matrisler var olduğu tahmin edilmektedirese yapılar ^6. Daha da önemlisi, bu sesil etki oluşumu en kalıcı ve kronik hastane kökenli enfeksiyonların ⁷ nedenidir. Acinetobacter baumannii küresel hastane kökenli enfeksiyonlarla ilişkilidir ve virülans büyük ölçüde yeterli çoğunluk algılama atfedilir Belli başlı insan patojenleri biridir aracılı biyofilm oluşumu ^8. Çekirdek giderici enzimler, Gram-negatif bakterilerin ⁹ tarafından üretilen N -asil homoserin laktonlar (AHL'ler) olarak bilinen bir bileşikler grubu hedef, çekirdek-kaynaklı sinyal transdüksiyonunun bozulması başarıyla kullanılmıştır. Çeşitli çalışmalar da biyofilm ^10,11 virülans faktörü ekspresyonu ve hücre sayılarının azaltılması yoluyla bakteriyel hastalık oluşumunun engellemek için bu enzimlerin kullanımına bağlı genişletmiştir. Ne yazık ki, bakteriyel patojenler tarafından biyofilm oluşumuna karşı nisabı-söndürme enzimlerin etkin kullanımı palpabl gösteri eksikliği kalır.Yeniden A. bozmaya, nisap inhibitörleri (AHL analogları), yerine nisabı giderici enzimler kullanmayı girişimleri olmuştur baumannii biyofilm oluşumu ^12. Küçük moleküller inhibitörleri kullanılarak bu yöntem, geçerli bir yaklaşım olsa da, translasyon kullanımlarda, bio-mevcudiyetini sürdürülmesi zor olabilir. Enzimler terapötik etkileri için biyomedikal cihazların yüzeylerine immobilizasyon doğru daha uygundurlar Aksine, katalitik çekirdek giderici enzimlerin kullanılması biyolojik sorunu aşmak olabilir.

Burada, kristal viyole boyama ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanarak, Geobacillus kaustophilus (GKL) bakteriyel biyofilm oluşumu üzerinde ^13'ten mühendislik nisap-söndürme lactonases etkilerinin bir değerlendirmesini açıklar. Bu çalışma klinik olarak anlamlı A. biyofilm bozulması ilk başarılı gösteri nisap giderici enzimler kullanılarak baumannii S1 süzün. Yöntem tarifBu çalışmada, patojenik Gram-negatif bakterilere karşı sonraki terapötik geliştirme çabaları diğer çekirdek giderici enzimlerin etkinliğini değerlendirmek için yararlıdır.

Protokol

A. Biyofilm Oluşumunun 1. Kristal Violet Kantifikasyonu baumannii S1

1. A. 5 ml'lik bir kültür büyütün lizojeni suyu içinde baumannii S1 (LB) 16 saat süre ile bir çalkalama inkübatöründe (220 rpm) 30 ° C'de (tripton 10 g / L, bira mayası özütü 5 g / L).
2. A. kültürünü ayarlayın istenen OD 0.8 ₆₀₀ baumannii S1. Bir 96-yuvalı plaka kullanarak, bakteri kültürünün aşılanması: saflaştırılmıştır GKL enzim (40 mg / ml) 10 ul ihtiva eden taze LB (1 100 seyreltme); Yeni kültürün nihai hacim 100 ul olduğunu.
3. Hem de bir kontrol kültürü hazırlayın; Bu herhangi bir enzim içermez. Çoğaltır istenen sayıda elde etmek için benzer koşullar tekrarlayın.
4. Bir kapak ile plaka örtün ve sızdırmaz şekilde kapalı bir 10 litrelik plastik bir kap içine koyun. Ortamı yavaşça çıkarmadan önce 3 saat süre ile 30 ° C 'de plaka inkübe edin.
5. Oyuk taze LB ortamı bir 100 ul ilave edin ve 30 ° C'de 21 saat boyunca inkübe plaka.
6. Inkübasyon ikinci döneminden sonra, yavaşça tüm ortamı çıkarın. 200 ul steril su ile planktonik bakteri hücresini yıkayın. Yıkama sırasında hücrelere sadece minimal rahatsızlık olduğundan emin olun.
7. Her çukuruna% 1 kristal viyole çözeltisi 100 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. 200 ul steril su ile kuyusunu yıkayarak kristal viyole çözüm çıkarın. Iki kez yıkama tekrarlayın.
8. Her çukuruna% 33 asetik asit, 100 ul eklenir ve yavaşça çalkalanarak 15 dakika boyunca inkübe edilir; Bu boya eriyecektir.
9. 600 nm 'de kristal viyole absorbansı ölçülerek oluşan biyofilm miktarının belirlenmesi. Kristal viyole miktarı oluşturulmuş, biyofilm miktarı ile orantılıdır.

A. 2. konfokal lazer tarama mikroskobu baumannii S1 Biyofilm

1. A. 5 ml'lik bir kültür büyütün 16 saat süre ile bir çalkalama inkübatöründe (220 rpm) 30 ° C'de LB baumannii S1.
2. ReklamA. sadece kültür istenen OD 0.8 ₆₀₀ baumannii S1. 35 mm bir cam tabanlı μ-çanağı kullanılarak, bakteri kültürünün aşılanması: saflaştırılmıştır GKL enzim (40 mg / ml) 30 ul ihtiva eden taze LB (1 100 seyreltme); Yeni kültürün nihai hacmi 1 ml olmuştur.
3. Kapaklı μ-Dish Kapak ve mühürlü 10 litrelik plastik kaba koyun. Ortamı yavaşça çıkarmadan önce 3 saat süre ile 30 ° C 'de μ-Bulaşık inkübe edin. 1 ml 'lik bir toplam hacme getiren saflaştırılmıştır GKL enzim ve taze ortam 30 ul ekle. 30 ° C'de bir 21 saat daha inkübe edilir.
4. Adımı yineleyin 2.3 ve 30 ° C sıcaklıkta bir 24 saat μ-Dish kuluçkaya yatmaktadır. Sonra, yavaşça ortamı çıkarın.
5. Μ-çanağı Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde eritildi 5 ug / ml Alex Fluo 488-konjuge Buğday tohumu aglutinini (WGA) 500 ul ilave edin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin; Bu oluşan biyofilm leke olacaktır. T boyama çözüm çıkarın ve yıkayınO u-Dish HBSS 2 ml. Yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın.
6. % 3.7 formaldehit HBSS içinde çözüldü ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe 500 ul ilave et; Bu μ-Dish üzerine biyofilm çözecektir. HBSS 2 ml ile bir kez μ-bulaşık yıkama ve daha sonra tamamen uzaklaştırın. Μ-Bulaşık biyofilm sabit önceden CLSM görüntüleme 4 ° C de karanlıkta tutulmuşlardır edilebilir.
7. CLSM görüntüleme ve analiz için yığının başına 0.21 mikron arayla görüntü başına 97 yığınlarının oluşturmak için 63 kat büyütme kullanın.

Sonuçlar

Doğal tipte GKL ve geliştirilmiş GKL çift mutant (E101G / R230C) kristal viyole niceleme deneyde, iki çekirdek giderici enzimler biyofilm oluşumunu kesintiye uygulanabilirliğini göstermek için kullanılmıştır. Her iki enzim karşı lactonase etkinliğini göstermek için gösterilmiştir 3-hidroksi-dekanoyil-L-homoserin lakton (3-OH-Cı ₁₀ -HSL), A. kullandığı başlıca çekirdek molekülün baumannii S1 ^14. Biyofilm bozulma geçerli...

Tartışmalar

Deney iki seti olarak, A. baumannii S1 bakteriler ¹⁵ tarafından oluşturulan biyofilm miktarını azaltabilir yüksek tuz konsantrasyonu olarak NaCl'siz LB ortamında kültive edilmiştir. Bu tür eserin varlığı oluşturduğu biyofilm miktarını, hem de farklı tedavi koşulları arasında nisabı-söndürme enzimlerin etkisini hafife olabilir. Katalitik inaktif enzim kullanımı enzim sekestrasyonun olası etkilerini ortadan kaldırmak için bir negatif kontrol olarak önemlidir. I...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	BD	211705
Yeast Extract	BD	212750
96-well plate	Costar	3596
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C6158
Acetic Acid	Lab-Scan	PLA00654X	Caution: Flammable
μ-Dish	Ibidi	80136
Alex Fluo 488-conjugated WGA	Invitrogen	W11261
Hank’s balanced salt solution	Invitrogen	141475095
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Caution: Corrosive
Synergy HT Microplate Reader	BioTek
1X-81 Inverted Fluorescence Microscope	Olympus