エンジニアクォーラム焼入れラクトナーゼを使用して、病原性バイオフィルムの抗病原性破壊

要約

Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.

要約

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm's tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.

概要

感染症の治療の選択肢は、抗生物質¹の広い範囲に影響されない多剤耐性菌の急速な増加によって複雑にされています。耐性細菌媒介性感染症からの高い罹患率および死亡率と、薬物開発プロセスをエスカレートおよび/または治療選択肢を改善するための優れた抗菌選択肢を探索する必要があります。最近では、抗病原性のアプローチは、したがって耐性機構²のリスクを軽減する、非殺菌方法を介して病原性を防止する上で、その潜在的な特定の関心を集めています。

クオラムセンシングは、このシグナリング現象の細菌の病原性と混乱の「マスタースイッチが「病因³に対する有望な抗病原性の方法です。重要な細菌の人口密度に達した後毒性の発症は細胞外環境における定足数の分子の蓄積が必要です。現状として、ラム酒の分子は、その同族受容体との結合は病原性因子だけでなく、抗生物質耐性およびバイオフィルム形成を⁴に関連する遺伝子の活性化につながる、細胞内マトリックスに戻って拡散します。一般的には、クオラムセンシング破壊が主要代謝経路に影響を与えることなく、定足数分子と受容体の相互作用を阻害することを含みます。したがって、細胞の成長に直接的な意味合いを持っていません。適応度が損なわれないので、進化し、そのような治療⁵に対する耐性を得るために、細菌のための最小限の選択圧があります。また、クオラムセンシングの破壊は、抗細菌剤からの保護を提供し、免疫応答をホストしてバイオフィルム形成の場合のように、固有の細菌の防御機構を妨害することができます。

それは、地球上の微生物の99％は目の中に生きた微生物に重要な生存の利点を付与する、複雑なバイオフィルムのようなマトリックス中に存在することが推定されていますESEの構造^6。さらに重要なことは、これらの固着ドメインの形成は、最も永続的なおよび慢性院内感染⁷の原因である。 アシネトバクターバウマニは、グローバルな院内感染に関連付けられており、その毒性が大きくクオラムセンシングに起因する主要なヒト病原体の一つであります媒介バイオフィルム形成^8。クォーラム消光酵素は、グラム陰性菌⁹によって生成されたN -アシルホモセリンラクトン（AHLs）として知られている化合物群をターゲットにして、クォーラムが介在するシグナル伝達を妨害するで正常に使用されています。いくつかの研究はまた、バイオフィルム^10,11における毒性因子の発現および細胞数の削減による細菌の病原性を遮断するために、これらの酵素の使用に拡大しています。残念ながら、細菌性病原体によるバイオフィルム形成に対する定足数消光酵素の有効利用の触知可能なデモの欠如が残っています。ザ・再A.を破壊し 、定足数阻害剤（AHL類似体）、代わりの定足数消光酵素を使用する試みてきましたバウマニバイオフィルム形成^12。小分子阻害剤を使用して、この方法が有効なアプローチであるが、翻訳の用途におけるその生物学的利用能を維持することが課題であることができます。酵素は治療効果のための生物医学装置の表面上に固定化に対してより敏感に反応するように逆に、触媒定​​足数消光酵素の使用は、生物学的利用能の問題を回避することができます。

ここでは、クリスタルバイオレット染色および共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）を用いて、細菌のバイオフィルム形成に^13（GKL） ゲオバチルスのkaustophilusから操作さクオラムクエンチングラクトナーゼの効果の評価を説明します。この研究は、臨床的に関連するAのバイオフィルム破壊の最初に成功した実証であります定足数消光酵素を用いバウマニ S1株。方法が記載さこの研究において、病原性グラム陰性菌に対する後続の治療の開発努力の他のクオラムクエンチング酵素の有効性を評価するために有用です。

プロトコル

Aのバイオフィルム形成の1クリスタルバイオレット定量バウマニ S1

1. A. 5mlの文化を育て振盪インキュベーター（220 rpm）し、30℃でのLB培地（LB）（トリプトンを10g / L、酵母エキス5グラム/ L）でバウマニ S1 16時間。
2. A.の文化を調整バウマニ S1 0.8の所望のOD ₆₀₀まで。 96ウェルプレートを使用して、細菌培養物接種：精製GKL酵素（40 mg / mlで）の10μLを含有する新鮮なLBに（1 100希釈）。新しい文化の最終容量は100μlです。
3. 同様に対照培養物を準備し;これは、任意の酵素が含まれません。複製の所望の数を得るために同様の条件を繰り返します。
4. 蓋付きプレートを覆い、密封された10リットルのプラスチック容器に入れてください。優しくメディアを削除する前に、3時間、30℃でプレートをインキュベートします。
5. 新鮮なLB培地の別の100μlをウェルに加え、30℃で21時間静置します。
6. インキュベーションの第二の期間の後、静かにすべてのメディアを削除します。 200μlの滅菌水でプランクトン細菌細胞を洗浄します。洗浄中の細胞にのみ最小限の乱れがあることを確認します。
7. 各ウェルに1％クリスタルバイオレット溶液100μlを加え、室温で15分間インキュベートします。 200μlの滅菌水でよく洗浄することにより、クリスタルバイオレット溶液を除去します。さらに2回の洗浄を繰り返します。
8. 各ウェルに33％酢酸を100μl加え、穏やかに振盪しながら15分間インキュベートします。これは、色素を溶解します。
9. 600nmにおけるクリスタルバイオレットの吸光度を測定することによって形成されたバイオフィルムの量を定量します。クリスタルバイオレットの量は、形成されたバイオフィルムの量に比例します。

A. 2.共焦点レーザー走査顕微鏡バウマニ S1バイオフィルム

1. A. 5mlの文化を育て16時間振とう培養（220 rpm）し、30℃でのLBでバウマニ S1。
2. 広告A.だけの文化バウマニ S1 0.8の所望のOD ₆₀₀まで。 35mmのガラス底のμ-皿を使用して、細菌培養の接種：精製されたGKL酵素（40 mg / mlの）の30μLを含む新鮮なLBに（1 100希釈）;新しい文化の最終容量を1 mlです。
3. 蓋付きのμ-皿を覆い、密封された10リットルのプラスチック容器に入れてください。優しくメディアを削除する前に、3時間30℃でμ-皿をインキュベートします。 1ミリリットルの全容量にそれをもたらし、精製GKL酵素と新鮮な培地30μlのを追加します。 30℃でさらに21時間インキュベートします。
4. 繰り返しステップ2.3および30℃でさらに24時間μ-皿をインキュベートします。そして、そっとメディアを削除します。
5. μ-皿にハンクス平衡塩溶液（HBSS）中に溶解し5μg/ mlのアレックスのFluo 488結合小麦胚芽凝集素（WGA）の500μLを加え、37℃で30分間インキュベートし;これは、形成されたバイオフィルムを染色します。 T染色溶液を除去し、洗浄彼はHBSS 2mlで皿をμ。洗浄ステップをもう一度繰り返します。
6. HBSSに溶解した3.7％ホルムアルデヒド500μlのを追加し、37℃で30分間インキュベートし;これは、μ-皿にバイオフィルムを修正します。 HBSS 2mlで一度μ-皿を洗い、その後、完全に溶液を除去。 μ皿バイオフィルムで固定前CLSM画像に4℃で暗所に保存することができます。
7. CLSMイメージングおよび分析のために、スタックあたり0.21ミクロンの間隔で画像あたり97スタックを生成するために、63倍の倍率を使用しています。

結果

クリスタルバイオレット定量実験では、2つの定足数消光酵素がバイオフィルム形成を破壊で実行可能性を実証するために使用した：野生型GKLおよび改善GKL二重変​​異（E101G / R230C）。両酵素は、3-ヒドロキシデカノイル- L -ホモセリンラクトン（3-OH-C ₁₀ -HSL）、A.で使用される主要な定足数分子に対するラクトナーゼ活性を示すことが示されています...

ディスカッション

実験の両方のセットは、A.バウマンニ S1は、高い塩濃度とのNaClなしLB培地で培養したバクテリア¹⁵によって形成されたバイオフィルムの量を減少させることができます。このようなアーティファクトの存在は、バイオフィルム形成量、ならびに異なる処理条件全体の定足数消光酵素の影響を過小評価する可能性があります。触媒的に不活性な酵素の使用は、酵素隔離の影響の可?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	BD	211705
Yeast Extract	BD	212750
96-well plate	Costar	3596
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C6158
Acetic Acid	Lab-Scan	PLA00654X	Caution: Flammable
μ-Dish	Ibidi	80136
Alex Fluo 488-conjugated WGA	Invitrogen	W11261
Hank’s balanced salt solution	Invitrogen	141475095
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Caution: Corrosive
Synergy HT Microplate Reader	BioTek
1X-81 Inverted Fluorescence Microscope	Olympus