Anti-virulenten Störung der Pathogene Biofilme mit Engineered Quorum lösch Lactonasen

Zusammenfassung

Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.

Zusammenfassung

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm's tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.

Einleitung

Behandlungsmöglichkeiten für Infektionskrankheiten durch die rasche Zunahme der Multidrug-resistenten Bakterien, die immun gegen ein breites Spektrum von Antibiotika ¹ sind kompliziert. Mit hoher Morbidität und Mortalität von resistenten Bakterien-vermittelte Infektionen, gibt es einen Bedarf an Arzneimittelentwicklungsprozesse zu eskalieren und / oder entdecken bessere antibakterielle Alternativen Therapiemöglichkeiten zu verbessern. In letzter Zeit wird die anti-Virulenz Ansatz gewinnen an Interesse gegeben sein Potenzial bei der Verhinderung von Virulenz über nicht bakterizide Methoden, damit Minderung der Risiken der Resistenzmechanismen ^2.

Quorum-Sensing ist ein "Hauptschalter" in bakteriellen Virulenz und Störung dieses Signal Phänomen ist eine vielversprechende anti-Virulenz Verfahren gegen Pathogenese ^3. Der Beginn der Virulenz erfordert die Ansammlung von Quorum-Moleküle in der extrazellulären Umgebung, nachdem ein kritischer bakterielle Bevölkerungsdichte erreicht ist. Wie quorum Moleküle diffundieren in die intrazelluläre Matrix, die Bindung mit ihren verwandten Rezeptoren führt zur Aktivierung von Virulenzfaktoren sowie Gene mit Antibiotikaresistenz und Biofilmbildung ⁴ verbunden. Im Allgemeinen Quorum-Sensing-Störung beinhaltet Hemmung Quorum Molekül und Rezeptor-Wechselwirkung, ohne die primären Stoffwechselwege. Daher spielt es keine direkten Auswirkungen auf das Zellwachstum. Da Fitness nicht beeinträchtigt wird, es eine minimale Selektionsdruck für Bakterien zu entwickeln und zu erhalten Widerstand gegen solche Behandlungen ^5. Zusätzlich kann ein Quorum-sensing Störung mit inhärenten Bakterienschutzmechanismen interferieren, wie im Fall der Bildung von Biofilmen, die Schutz gegen antibakterielle Mittel bereitstellt und Wirt-Immunantworten.

Es wird geschätzt, dass 99% der Mikroben auf der Erde existieren in komplexen Biofilm artigen Matrizes verleih entscheidende Lebensvorteil für die lebenden Mikroorganismen innerhalb these ^Strukturen 6. Noch wichtiger ist, ist die Bildung dieser sessile Domains die Ursache der hartnäckigsten und chronischer Krankenhausinfektionen ^7. Acinetobacter baumannii ist eine der wichtigsten menschlichen Krankheitserreger, die mit der globalen Krankenhausinfektionen verbunden ist und dessen Virulenz ist weitgehend auf die Quorum-Sensing zurückzuführen vermittelte Biofilmbildung ^8. Quorum-Abschrecken Enzyme erfolgreich in stören Quorum-vermittelte Signaltransduktion durch gezielt eine Gruppe von Verbindungen, wie N-Acyl Homoserinlactone (AHLs), die von Gram-negativen Bakterien ⁹ sind bekannt dafür verwendet worden. Mehrere Studien haben auch von der Verwendung dieser Enzyme erweitert, um bakterielle Pathogenese durch die Reduktion von Virulenzfaktor Expression und Zellzahlen in Biofilmen ^10,11 blockieren. Leider gibt es nach wie vor ein Mangel an greifbaren Beweis für die effektive Nutzung von Quorum-Abschrecken Enzyme gegen die Biofilmbildung durch bakterielle Erreger. dasre es Versuche, Quorum-Inhibitoren (AHL-Analoga), anstelle von Quorum-Abschrecken Enzyme verwenden, um A. zu stören baumannii Biofilmbildung ^12. Obwohl diese Methode der Verwendung von kleinen Molekülen Inhibitoren ist ein gültiger Ansatz können erhalt seine Bioverfügbarkeit in der translationalen Verwendungen eine Herausforderung sein. Im Gegenteil könnte die Verwendung von katalytischen quorum Abschrecken Enzyme die Bioverfügbarkeit Problem zu umgehen, wie Enzyme sind empfänglicher gegen Immobilisierung an Oberflächen von biomedizinischen Vorrichtungen für therapeutische Wirkungen.

Hier beschreiben wir eine Bewertung der Auswirkungen von gentechnisch Quorum lösch Lactonasen von Geobacillus kaustophilus (GKL) ¹³ auf bakterielle Biofilmbildung, mit Kristallviolett-Färbung und konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM). Diese Studie ist die erste erfolgreiche Demonstration von Biofilm Störung in einem klinisch relevanten A. baumannii S1-Stamm unter Verwendung Quorum lösch Enzyme. Beschriebenen Verfahrenin dieser Studie sind nützlich für die Beurteilung der Wirksamkeit anderer quorum Abschrecken Enzyme in nachfolgenden therapeutischen Entwicklungsbemühungen gegen pathogene gramnegative Bakterien.

Protokoll

1. Kristallviolett Quantifizierung von Biofilm-Bildung in A. baumannii S1

1. Wachsen Sie eine 5-ml-Kultur von A. baumannii S1 in LB-Medium (LB) (Trypton 10 g / L, Hefeextrakt 5 g / L) bei 30 ° C in einem Schüttelinkubator (220 UpM) für 16 Stunden.
2. Stellen Sie die Kultur von A. baumannii S1 auf eine gewünschte _OD 600 von 0,8 auf. Verwendung eines 96-Well-Platte, zu inokulieren Bakterienkultur (1: 100 Verdünnung) in frisches LB, das 10 & mgr; l gereinigtes GKL-Enzym (40 mg / ml); Endvolumen der neuen Kultur ist 100 ul.
3. Bereiten Sie eine Kontrollkultur als auch, Dies hat jedoch keinerlei Enzym enthalten. Wiederholen ähnlichen Bedingungen, um die gewünschte Anzahl an Wiederholungen ergeben.
4. Die Platte mit einem Deckel und legen Sie sie in einem verschlossenen 10 l Kunststoffbehälter. Die Platte bei 30 ° C für 3 Stunden, bevor sanft Entfernen der Medien.
5. Fügen Sie eine weitere 100 ul frischem LB-Medium zu der Vertiefung und inkubieren Sie die Platte für 21 Stunden bei 30 ° C.
6. Nach der zweiten Inkubationszeit, entfernen Sie vorsichtig alle Medien. Waschen Sie die planktonischen Bakterien-Zelle mit 200 ul sterilem Wasser. Sicherzustellen, dass es nur eine minimale Störung der Zellen während des Waschvorgangs.
7. Fügen Sie 100 ul von 1% Kristallviolett-Lösung in jede Vertiefung und Inkubation für 15 min bei RT. Entfernen Sie die Kristallviolett-Lösung durch Waschen der gut mit 200 ul sterilem Wasser. Wiederholen Sie den Waschgang für zwei weitere Male.
8. 100 l 33% Essigsäure in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 15 min unter leichtem Schütteln; Dies wird den Farbstoff aufzulösen.
9. Quantifizieren der Menge des Biofilms durch Messung der Absorption des Kristallviolett bei 600 nm ausgebildet. Die Menge an Kristallviolett, ist proportional zu der Menge an Biofilm gebildet.

2. konfokale Laser Scanning Mikroskopie von A. baumannii S1 Biofilm

1. Wachsen Sie eine 5-ml-Kultur von A. baumannii S1 in LB bei 30 ° C in einem Schüttelinkubator (220 UpM) für 16 Stunden.
2. Anzeigenur die Kultur von A. baumannii S1 auf eine gewünschte _OD 600 von 0,8 auf. Mit Hilfe eines 35-mm-Glasboden μ-Dish, zu impfen die Bakterienkultur (1: 100 Verdünnung) in frischem LB, das 30 & mgr; l des gereinigten GKL Enzym (40 mg / ml); Endvolumen der neuen Kultur ist 1 ml.
3. Decken Sie die μ-Dish mit Deckel und legen Sie sie in einem verschlossenen 10 l Kunststoffbehälter. Inkubieren Sie die μ-Dish bei 30 ° C für 3 Stunden, bevor sanft Entfernen der Medien. Werden 30 & mgr; l gereinigtes GKL Enzym und frisches Medium, das bis zu einem Gesamtvolumen von 1 ml zu bringen. Inkubation für weitere 21 h bei 30 ° C.
4. Wiederholen Sie Schritt 2.3 und inkubieren Sie die μ-Dish für einen weiteren 24 Stunden bei 30 ° C. Dann entfernen Sie die Medien vorsichtig.
5. Gib 500 ul 5 ug / ml Alex Fluo 488 konjugiertem Weizenkeim-Agglutinin (WGA) in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) mit dem μ-Geschirr gelöst und bei 37 ° C für 30 min; Dies wird das gebildete Biofilm färben. Entfernen Sie die Farblösung und waschen ter u-Teller mit 2 ml HBSS. Wiederholen Sie den Waschvorgang noch einmal.
6. Gib 500 & mgr; l von 3,7% igem Formaldehyd in HBSS gelöst und bei 37 ° C für 30 min; Dies wird den Biofilm auf den μ-Dish beheben. Einmal Waschen Sie die μ-Dish mit 2 ml HBSS und entfernen Sie die Lösung vollständig. Die μ-Schale mit Biofilm fixiert kann in der Dunkelheit bei 4 ° C vor dem CLSM Abbildungs ​​gespeichert werden.
7. Für CLSM Bildgebung und Analyse sind 63-facher Vergrößerung und 97 Stapel pro Bild mit einem Abstand von 0,21 um pro Stapel zu erzeugen.

Ergebnisse

In der Kristallviolett Quantifizierung Experiment wurden zwei Quorum lösch Enzyme verwendet, um Machbarkeit stören Biofilmbildung zu demonstrieren: Wildtyp-GKL und eine verbesserte GKL Doppelmutante (E101G / R230C). Beide Enzyme wurde gezeigt, Lactonase-Aktivität gegen demonstrieren 3-Hydroxy-decanoyl-L-homoserinlacton (3-OH-C ₁₀ -HSL), der Haupt Quorum Molekül von A. verwendet baumannii S1 ^14. Für gültige Beurteilung der Biofilm Unterbrechun...

Diskussion

In beiden Sätzen von Experiment A. baumannii S1 wurde in LB-Medium ohne NaCl weise einer hohen Salzkonzentration kann die Menge des Biofilms von den Bakterien ^{15 ausgebildet} reduzieren kultiviert. Das Vorhandensein solcher Artefakt könnte die Menge der Biofilm gebildet, sowie die Auswirkungen der Quorum-Abschrecken Enzyme in verschiedenen Behandlungsbedingungen unterschätzen. Die Verwendung einer katalytisch inaktiven Enzym ist wichtig, da eine negative Kontrolle, die möglichen Effekte der Enzymb...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	BD	211705
Yeast Extract	BD	212750
96-well plate	Costar	3596
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C6158
Acetic Acid	Lab-Scan	PLA00654X	Caution: Flammable
μ-Dish	Ibidi	80136
Alex Fluo 488-conjugated WGA	Invitrogen	W11261
Hank’s balanced salt solution	Invitrogen	141475095
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Caution: Corrosive
Synergy HT Microplate Reader	BioTek
1X-81 Inverted Fluorescence Microscope	Olympus