שיבוש אנטי-ארסי של Biofilms פתוגניים באמצעות Lactonases תכנון הנדסי Quorum-מרווה

Summary

Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.

Abstract

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm's tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.

Introduction

אפשרויות טיפול במחלות זיהומיות כבר מסובכות על ידי הגידול המהיר בחיידקים עמיד multidrug כי הם חסינים מפני מגוון רחב של תרופות אנטיביוטיות ^1. עם תחלואה גבוהה ושיעורי תמותה מזיהומים בתיווך חיידקים עמידים, יש צורך להסלים תהליכי פיתוח תרופות ו / או לחקור חלופות אנטי בקטריאלי טובים יותר כדי לשפר את האפשרויות טיפוליות. בזמן האחרון, הגישה האנטי-האלימות היא צוברת ריבית נתון את הפוטנציאל שלה במניעת אלימות באמצעות שיטות לא-bactericidal, ומכאן מקלים הסיכונים של מנגנוני התנגדות ^2.

מניין החישה היא "מתג ראשי" בארסיות ושיבוש תופעת איתות זה חיידקים הוא שיטה אנטי-אלימות נגד מבטיחה פתוגנזה ^3. תחילתה של אלימות דורשת ההצטברות של מולקולות מניין בסביבה תאית לאחר שהגיעה לצפיפות אוכלוסיית חיידקים קריטית. כקווהמולקולות רום מפוזרות בחזרה לתוך המטריצה ​​תאית, מחייב עם קולטנים המקור שלהם מובילה להפעלה של גורמים ארסי כמו גם גנים הקשורים לעמידות לאנטיביוטיקה והיווצרות biofilm ^4. בשיבוש כללי, מניין חישה כרוך עיכוב מולקולת מניין ואינטראקציה קולט מבלי להשפיע על מסלולי מטבוליים עיקריים. מכאן, שאין לה שום השלכה ישירה על צמיחה סלולרית. מאז כושר לא נפגעים, יש לחץ בחירה מינימאלי לחיידקים להתפתח ולהשיג התנגדות נגד טיפולים כגון ^5. בנוסף, הפרעה מניין חישה יכולה להפריע למנגנוני הגנת חיידקים טבועים, כמו במקרה של היווצרות biofilm, המספקת הגנה מפני חומרים אנטי-בקטריאלי ויארח את תגובה חיסונית.

הערכה היא כי 99% מחיידקים על פני כדור הארץ קיימים במטריצות כמו biofilm-מורכבות, המקנות יתרונות הישרדות חיוניות למיקרואורגניזמים שחיים בתוך המבני ESE ^6. יותר מכך, היווצרות של תחומים נייחים אלה היא הסיבה לזיהומים נרכשים בבית חולים מתמשכים והכרוניים ביותר ^7. Acinetobacter baumannii היא אחד מגורמי המחלה האנושיים הגדולים שמזוהה עם זיהומים נרכשים בבית חולים העולמיים והארסיות שלה מיוחסת במידה רבה למניין חישה היווצרות biofilm תיווך ^8. אנזימים-מרווה מניין שימשו בהצלחה בשיבוש העברת אותות בתיווך מניין על ידי מיקוד קבוצה של תרכובות המכונית lactones -acyl N homoserine (AHLs) המיוצרים על ידי חיידקים גראם-שלילי ^9. גם מספר מחקרים הרחיבו את השימוש באנזימים אלה כדי לחסום פתוגנזה של חיידקים באמצעות הפחתת מספרי ביטוי גורם ארסיות ותא בbiofilms ^10,11. למרבה הצער, יש עדיין חוסר ההפגנה מוחשית של השימוש היעיל של אנזימי מרווה-מניין נגד היווצרות biofilm ידי חיידקים פתוגנים.מחדש נעשו ניסיונות להשתמש מעכבי מניין (אנלוגים AHL), במקום אנזימי מרווה-מניין, לשבש א היווצרות biofilm baumannii ^12. למרות ששיטה זו של שימוש במעכבי מולקולות קטנות היא גישה חוקית, שמירה על הזמינות הביולוגית שלה בשימושים translational יכולה להיות אתגר. להיפך, השימוש באנזימי מרווה-מניין קטליטי יכול לעקוף את הבעיה הזמינות הביולוגית כאנזימים הם נוחים יותר לחוסר תנועה על משטחים של מכשירים ביו-רפואיים להשפעות טיפוליות.

כאן אנו מתארים הערכה של ההשפעות של lactonases מרווה-מניין מהונדס מkaustophilus Geobacillus (GKL) ¹³ על היווצרות biofilm חיידקים, באמצעות מכתים סגול גביש ומיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר (CLSM). מחקר זה הוא ההפגנה המוצלחת הראשונה של שיבוש biofilm בא רלוונטי קליני זן baumannii S1 באמצעות אנזימי מרווה-מניין. השיטות שתוארובמחקר זה הם שימושיים להערכת יעילותם של אנזימי מרווה-מניין אחרים במאמצי פיתוח טיפוליים שלאחר מכן נגד חיידקים גראם שלילית פתוגניים.

Protocol

1. קריסטל ויולט Quantitation של ההיווצרות biofilm בא baumannii S1

1. לגדול תרבות 5 מיליליטר של א ' baumannii S1 במרק Lysogeny (LB) (tryptone 10 גרם / L, 5 גר '/ L תמצית שמרים) על 30 מעלות צלזיוס בחממה רועדת (220 סל"ד) במשך 16 שעות.
2. התאם את התרבות של א ' baumannii S1 לOD רצוי ₆₀₀ של 0.8. שימוש בצלחת 96-היטב, לחסן תרבות חיידקים (1: 100 דילול) לLB טרי המכילה 10 μl של אנזים GKL מטוהר (40 מ"ג / מיליליטר); הנפח הסופי של התרבות החדשה הוא 100 μl.
3. הכן תרבות שליטה, כמו גם; זה לא יכיל כל אנזים. חזור על תנאים דומים ללהניב את המספר הרצוי של משכפל.
4. מכסה את הצלחת עם מכסה ומניח אותו לתוך מיכל פלסטיק 10 ליטר אטום. דגירה את הצלחת על 30 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות לפני בעדינות הסרת התקשורת.
5. להוסיף בינוני LB הטרי עוד 100 μl להיטב דגירה הצלחת במשך 21 שעות על 30 מעלות צלזיוס.
6. לאחר התקופה השנייה של דגירה, בעדינות להסיר את כל אמצעי התקשורת. שטוף את תא חיידקי פלנקטון עם מים סטריליים 200 μl. ודא שיש הפרעה מינימאלית בלבד לתאים במהלך כביסה.
7. להוסיף 1% פתרון סגול גביש 100 μl לכל היטב דגירה במשך 15 דקות ב RT. הסר את הפתרון סגול גביש על ידי שטיפה היטב עם מים סטריליים 200 μl. חזור על לשטוף לעוד פעמיים.
8. להוסיף 33% חומצה אצטית 100 μl לכל היטב דגירה למשך 15 דקות עם רעד עדין; זה יהיה לפזר את הצבע.
9. לכמת את כמות biofilm נוצרה על ידי מדידת הספיגה של סגול קריסטל ב 600 ננומטר. כמות סגולה גביש היא פרופורציונלית לסכום של biofilm נוצר.

2. Confocal סריקת לייזר מיקרוסקופית של א ' baumannii S1 Biofilm

1. לגדול תרבות 5 מיליליטר של א ' baumannii S1 בLB על 30 מעלות צלזיוס בחממה רועדת (220 סל"ד) במשך 16 שעות.
2. מוֹדָעָהרק התרבות של א ' baumannii S1 לOD רצוי ₆₀₀ של 0.8. באמצעות μ-צלחת עם תחתית זכוכית 35 מ"מ, לחסן תרבות חיידקים (1: 100 דילול) לLB טרי המכילה 30 μl של אנזים GKL מטוהר (40 מ"ג / מיליליטר); הנפח הסופי של התרבות החדשה הוא 1 מיליליטר.
3. מכסה את μ-הצלחת עם מכסה ומניח אותו במכל פלסטיק אטום 10 ליטר. דגירה μ-הצלחת על 30 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות לפני בעדינות הסרת התקשורת. הוסף 30 μl של אנזים GKL מטוהר ובינוני טריים, הבאתו להיקף כולל של 1 מיליליטר. דגירה עבור שעות 21 נוספות על 30 מעלות צלזיוס.
4. חזור על שלב 2.3 ודגירת μ-התבשיל לשעה עוד 24 על 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להסיר את המדיה בעדינות.
5. הוסף 500 μl של 5 מיקרוגרם / מיליליטר 488 מצומדות- agglutinin אלכס Fluo נבט חיטה (WGA) מומס בתמיסת מלח המאוזן של האנק (HBSS) לμ-הצלחת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; זה יהיה כתם biofilm נוצר. הסר את הפתרון מכתים ולשטוף tהוא μ-צלחת עם 2 מיליליטר של HBSS. חזור על השלב לשטוף עוד פעם אחת.
6. הוסף 500 μl של פורמלדהיד 3.7% מומסים בHBSS ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; זה יהיה לתקן את biofilm על μ-הצלחת. לשטוף את μ-צלחת פעם אחת עם 2 מיליליטר של HBSS ולאחר מכן להסיר את הפתרון לחלוטין. קבוע עם biofilm μ-הצלחת ניתן לאחסן בחושך על 4 מעלות צלזיוס לפני ההדמיה CLSM.
7. הדמיה CLSM וניתוח, להשתמש 63 הגדלת פעמים כדי ליצור 97 ערימות לכל תמונה עם מרווח של 0.21 מיקרומטר לערימה.

תוצאות

בניסוי quantitation הסגול גביש, שני אנזימי מרווה-מניין שמשו כדי להדגים היתכנות בשיבוש היווצרות biofilm: פרא-הסוג GKL ומוטציה משופר GKL כפולה (E101G / R230C). שני האנזימים הוכחו להפגין פעילות lactonase נגד 3-הידרוקסי-decanoyl-L-homoserine לקטון (3-OH-C ₁₀ -HSL), מולקולת המניין המרכזית ...

Discussion

בשני הסטים של ניסוי, א baumannii S1 היה בתרבית בתקשורת LB ללא NaCl כריכוז מלח גבוה יכול להפחית את כמות biofilm נוצרה על ידי החיידקים ^15. נוכחותו של חפץ כזה יכול לזלזל בסכום של biofilm נוצר, כמו גם את ההשפעות של אנזימי מרווה-מניין פני תנאי טיפול שונים. השימוש באנזים catalytically פעי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	BD	211705
Yeast Extract	BD	212750
96-well plate	Costar	3596
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C6158
Acetic Acid	Lab-Scan	PLA00654X	Caution: Flammable
μ-Dish	Ibidi	80136
Alex Fluo 488-conjugated WGA	Invitrogen	W11261
Hank’s balanced salt solution	Invitrogen	141475095
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Caution: Corrosive
Synergy HT Microplate Reader	BioTek
1X-81 Inverted Fluorescence Microscope	Olympus