病原生物膜利用工程定额淬Lactonases防有毒中断

摘要

Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.

摘要

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm's tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.

引言

对于感染性疾病的治疗方案已被复杂化在多药耐药性细菌是免疫广泛的抗生素药物¹的快速增加。从耐药细菌介导的感染的高发病率和死亡率，有必要升级药物开发过程和/或探索更好抗菌替代改善的治疗选择。近来，抗毒性的方法是获得给出其在经由非杀菌方法防止致病潜力的兴趣，因此减轻耐药机制²的风险。

群体感应是细菌毒力和这种信号中断现象的一个"总开关"是对发病³一个有前途的抗毒性的方法。毒力的发作需要仲裁分子在细胞外环境中的积累达到临界细菌种群密度之后。由于现状朗姆酒分子扩散回进入胞内基质中，与它们的同源受体结合导致的毒力因子的活化，以及与抗生素抗性和生物膜形成⁴相关的基因。在一般情况下，群体感应中断涉及抑制仲裁分子和受体相互作用，而不会影响主代谢途径。因此，它不具有对细胞生长的任何直接含意。由于健康不受损害，是最小的选择压力细菌进化并获得对这种治疗⁵阻力。此外，群体感应中断可以与固有的细菌保护机制干扰，如在生物膜形成，它提供了保护从抗菌剂和宿主免疫反应的情况下。

据估计，在复杂的生物膜状矩阵存在99％地球上的微生物，赋予关键存活优势居住在第微生物ESE结构^6。更重要的是，形成这些无柄域是最持久和慢性医院获得性感染⁷的原因。 鲍曼不动杆菌是一个与全球医院获得性感染相关联，其毒力在很大程度上归因于群体感应的主要的人类病原体之一介导的生物膜形成^8。仲裁淬酶已被成功地用于通过靶向一组化合物已知为 N -酰基高丝氨酸内酯（信号分子）是由革兰氏阴性细菌产生的⁹扰乱仲裁介导的信号转导。一些研究也扩大于使用这些酶通过毒力因子的表达和细胞数在生物膜^10,11减少到方框细菌发病机理。不幸的是，仍缺乏有效利用仲裁 - 淬火酶对生物膜形成由细菌病原体扪示范的。该重新已经尝试使用定额抑制剂（AHL类似物）代替法定淬火酶，以破坏A.鲍曼不动杆菌生物膜形成^12。虽然使用小分子抑制剂的这种方法是一种有效的方法，维持在平利用其生物利用度可能是一个挑战。与此相反，使用催化仲裁 - 淬火酶可以规避生物利用度问题，因为酶是朝固定上用于治疗效果的生物医学装置的表面更适合。

在这里，我们描述了从地芽孢^{kaustophilus（GKL）13}对细菌生物膜的形成工程定额淬火lactonases的影响进行评估，采用结晶紫染色和激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）。这项研究是生物膜分裂的在一个临床相关的A中的第一次成功的示范鲍曼不动杆菌菌株S1采用定额淬火酶。的方法中所述在这项研究中的用于评估对致病性革兰氏阴性细菌后续治疗的努力发展其他仲裁淬火酶的效力是有用的。

研究方案

生物膜的形成A. 1.结晶紫定量鲍曼不动杆菌 S1

1. 成长5 ml培养A的杆菌中的S1 LB培养基（LB）（胰蛋白胨10克/升，酵母提取物5克/升），在30℃下在振荡培养箱（220转）16小时。
2. 调整A.文化杆菌 S1至所希望的OD ₆₀₀为0.8。使用96孔板，接种细菌培养物（1:100稀释）到新鲜LB含有10微升纯化GKL酶（40毫克/毫升）的;新的文化的最终体积为100微升。
3. 准备控制文化为好;这将不包含任何酶。重复类似的状况以产生重复的期望数量。
4. 覆盖板用盖，并放入一个密封的10升塑料容器中。前轻轻取出介质孵育板在30℃下3小时。
5. 添加另外100微升新鲜LB培养基到井和孵育板21小时，在30℃。
6. 孵化的第二阶段后，轻轻取出所有的媒体。洗净的浮游细菌细胞用200微升无菌水。确保有清洗期间只有最小干扰细胞中。
7. 加入100微升的1％结晶紫溶液至每个孔，并孵育15分钟，在RT。通过洗涤井用200μl无菌水去除结晶紫溶液。重复洗两次。
8. 加入100微升33％乙酸至每个孔，并孵育15分钟，轻轻摇动;这会溶解染料。
9. 定量生物膜的通过测量结晶紫的吸光度在600nm处形成的量。结晶紫的量是成比例的生物膜的形成的量。

A. 2.激光共聚焦显微镜鲍曼不动杆菌 S1生物膜

1. 成长5 ml培养A的杆菌中的S1的LB在30℃在振荡培养箱（220rpm下）16小时。
2. 广告A的只是培养杆菌 S1至所希望的OD ₆₀₀为0.8。使用35毫米的玻璃底μ-盘子，接种细菌培养物（1:100稀释）到新鲜LB含有30微升纯化GKL酶（40毫克/毫升）的;新的文化的最终体积为1毫升
3. 覆盖μ-盘用盖子，并将其放置在一个密封的10升塑料容器中。前轻轻取出介质孵育μ-盘在30℃下3小时。添加30微升纯化GKL酶和新鲜培养基，将它带到1毫升的总体积。孵育另外21小时，在30℃。
4. 重复步骤2.3孵育μ-菜另外24小时在30℃。然后，轻轻地取出介质。
5. 加入500微升5微克/毫升阿莱克斯的Fluo 488缀合的麦胚凝集素（WGA）溶于Hank平衡盐溶液（HBSS）到μ-盘和孵育在37℃，30分钟;这会污染形成的生物膜。除去染色液和洗涤吨他μ-菜用2毫升的HBSS。重复该洗涤步骤一次。
6. 加入500微升3.7％的甲醛溶解在HBSS中，37℃，30分钟;这将解决生物膜到μ-菜。用2毫升的HBSS洗μ-菜一次，然后彻底删除解决方案。 μ-盘固定生物膜可以在4℃之前CLSM成像储存在黑暗中。
7. 对于激光共聚焦显微镜成像和分析，用63倍的放大倍率，产生97堆栈每幅图像，每堆0.21微米的间隔。

结果

在结晶紫定量实验中，两名仲裁淬火酶用于演示的可行性破坏生物膜的形成:野生型GKL和改进的GKL双突变体（E101G / R230C）。两种酶已显示表明内酯酶活性对3-羟基癸酰基-L-高丝氨酸内酯（3-OH-C ₁₀ -HSL），使用由 A.主要仲裁分子鲍曼不动杆菌 S1 ^14。为生物膜分裂的有效评估，它们各自的无催化活性的酶（先前表明不螯合AHL配体）也包括在内作为立...

讨论

在这两组实验中，A杆菌 S1中培养在LB培养基无氯化钠作为高盐浓度可减少生物膜由细菌¹⁵形成的量。这种伪影的存在可能会低估生物膜的形成的量，以及仲裁 - 淬火酶在不同的处理条件的影响。使用催化失活酶是重要的，作为阴性对照，以消除酶封存的可能影响。 图1表明，即使不活动酶螯合仲裁分子，生物膜的形成不被中断。

鲍曼不动杆菌

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	BD	211705
Yeast Extract	BD	212750
96-well plate	Costar	3596
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C6158
Acetic Acid	Lab-Scan	PLA00654X	Caution: Flammable
μ-Dish	Ibidi	80136
Alex Fluo 488-conjugated WGA	Invitrogen	W11261
Hank’s balanced salt solution	Invitrogen	141475095
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Caution: Corrosive
Synergy HT Microplate Reader	BioTek
1X-81 Inverted Fluorescence Microscope	Olympus