JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وصفنا تقنية لتسمية الخلايا العصبية والعمليات الخاصة بها عن طريق تقدمي أو رجعي التتبع الحقن في نوى الدماغ باستخدام إعداد في المختبر. نحن تعديل طريقة القائمة ط ن معمليا التتبع Electroporation للمن خلال الاستفادة من fluorescently المسمى المسوخ الماوس وأجهزة بصرية الأساسية من أجل زيادة دقة وضع العلامات.

Abstract

نقدم الأسلوب الذي يجمع في المختبر التتبع بروتوكول الحقن، والذي يستخدم سلسلة من النبضات الكهربائية والضغط لزيادة امتصاص الصبغة من خلال Electroporation للفي إإكسبلنتس الدماغ مع استهداف إضاءة الليزر ومطابقة نظارات مرشح أثناء العملية. تقنية الموضحة في المختبر Electroporation للفي حد ذاته ينتج المراقبة البصرية جيدة نسبيا لاستهداف مناطق معينة من الدماغ. من خلال الجمع بين ذلك مع الإثارة ليزر علامات وراثية الفلورسنت وعلى القراءة من خلال نظارات مرشح تمرير الفرقة، والتي يمكن التقاط انبعاثات المسمى وراثيا الخلايا / نوى وصبغة الفلورسنت البحث عن المفقودين، يمكن للباحث زيادة كبيرة في دقة الحقن من خلال إيجاد مساحة من الاهتمام والسيطرة على الصبغة الانتشار / الامتصاص في منطقة الحقن بشكل أكثر كفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تقنية الإضاءة الليزر يسمح لدراسة وظيفة neurocircuit التي قدمها الأقليمiding المعلومات حول نوع من الخلايا العصبية إسقاط لمنطقة معينة في الحالات التي يتم فيها ربط التعبير GFP لنوع الارسال التي أعربت عنها جزء من السكان من الخلايا العصبية.

Introduction

من أجل تحديد بعض الخلايا العصبية (الصغرى) الدائرة، يجب على المرء أن يبدأ من خلال إيجاد المشاركين من مختلف الدوائر وقال، ونمط علاقتهم. من أي وقت مضى منذ تم تأسيس نشر الر حول neurofiber البحث عن المفقودين من خلال lesioning 1 مجموعة كبيرة ومتنوعة من تقنيات تتبع تشريحي عصبي. بعض هذه التقنيات يمكن تطبيقها في الأنسجة ثابتة بعد الوفاة 2-4، والبعض الآخر يعتمد على النقل النشط من الصبغة في الخلايا العصبية الحية، كما اكتشف في عام 1971 5-6. هذا الأخير يمكن أيضا تقسيم في مجموعتين التمييز بين أساليب الاستفادة من الوراء النشط (من منطقة حقن لمصدر إسقاط معينة، أي. وsomata من الخلايا العصبية التي يتم إسقاط لوقال المنطقة) وتقدمي النشط (من حقن المنطقة هدفا لإسقاط معينة، أي. التوقعات محور عصبي والمحطات محور عصبي من الخلايا العصبية المسماة) النقل. أيضا، في بعض الحالات هيئة تنظيم الاتصالاتيتم حقن مادة حدات خفض الانبعاثات المعتمدة في الحيوانات الحية التي ثم البقاء على قيد الحياة حقن عدة أيام أو أسابيع (في حقن الجسم الحي التتبع)، بينما في حالات أخرى يتم حقن العقول explanted واحتضان لعدة ساعات بعد الحقن في السائل النخاعي الاصطناعي (في المختبر حقن التتبع) .

في هذا البروتوكول وتعديلها موجود في المختبر تقنية Electroporation لل8/7 لتسمية somata والعمليات العصبية في تقدمي ورجعي تتبع التجارب باستخدام choleratoxin الوحيدات-B وtetramethylrhodamine ديكستران مثل المواد التعقب. الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير علماء الأعصاب مع أداة فعالة لتتبع أنماط الاتصال بين الخلايا العصبية في الدماغ نوى مختلفة، مع الاستفادة من خطوط الماوس المعدلة وراثيا المتاحة والمعدات البصرية الأساسية من أجل زيادة دقة استهداف خلال حقن التتبع. على الرغم من أن طريقة تقدمي والبحث عن المفقودين إلى الوراء باستخدامcholeratoxin وأمين ديكستران ومنها تقارن بها fluorescently المسمى ليست جديدة 13/9 (كما هو طريقة Electroporation لل، على سبيل المثال. هاس وآخرون. 14)، والجمع بين الحقن التتبع مع ​​Electroporation للفي إعداد في المختبر التي تنطوي على كتل من أنسجة المخ تطور أكثر حداثة 7. ميزته الرئيسية على تقنيات تعقب الخلايا العصبية باستخدام نفس النوع من الأصباغ التتبع في الحيوانات الحية هي زيادة كثافة وضع العلامات، وذلك بسبب زيادة الكفاءة التي يتم اتخاذها الصبغة electroporated من قبل الخلايا العصبية. ميزة إضافية هي الفترة تقصير حضانة (مطلوب لنقل صبغ) وزيادة دقة المستهدف خلال حقن التتبع، لأن المجرب لديه المراقبة البصرية على المنطقة المستهدفة من الحقن. يعني هذا الأخير أيضا ما هو مطلوب أي معدات المجسم مكلفة للعثور على نواة أو الدماغ مجال الاهتمام.

لعديزيادة دوليا هو دقة الاستهداف، ونحن استغل خط الماوس المعدلة وراثيا، والذي يعبر عن GFP في حيوانية glycinergic لها من الخلايا العصبية 15 و المعدات البصرية الأساسية التي تتكون من مؤشر ليزر باليد من 405 نانومتر نظارات الطول الموجي ومطابقة الفرقة تمرير تصفية (450 - 700 نانومتر). وهكذا، حققنا المزيد من زيادة كبيرة في دقة الاستهداف عن طريق تحديد منطقة الحقن من خلال إشارته الفلورسنت، وتوفير وسيلة أدق للسيطرة على انتشار الصبغة داخل منطقة الحقن من خلال مراقبة التفاعل بين إشارة GFP الأصلية والتتبع مضان. كما يسمح لنا تقنية لكشف ظائف الدائرة جنبا إلى جنب مع الاتصال من خلال تحديد GFP إيجابية الخلايا العصبية المثبطة (أو مثير في خطوط الماوس الأخرى) التي كانت مليئة التتبع.

باختصار، نحن تعزيزه أداة قوية العلمية العصبية لدراسة connectome من الدماغ الفقاريات وتقييم رانه ميزات تشريحي عصبي مختلفة من neurocircuit معين. باستخدام الفئران المعدلة وراثيا إلى جانب المعدات البصرية مكلفة ومتاحة على نطاق واسع تمكنا من زيادة كبيرة في دقة استهداف حقن لدينا. وعلاوة على ذلك، فإن الفئران المعدلة وراثيا سمح لنا للتعرف على نوع من الاتصالات تتبعها، مما ساعد على كشف وظيفة لالمتناهية الصغر المثبطة في الدماغ السمعية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. التنميط الجيني البصري

1. بصري انماط من الفأر الجراء

  1. تحقق من التعبير عن علامة فلوري منها باستخدام مؤشر الليزر الطول الموجي الإثارة المناسب (405 نانومتر في التجارب وصفها هنا) ونظارات واقية فلتر حجب الطول الموجي الإثارة المقابلة ولكن يمر الطول الموجي الانبعاثات (450-700 نانومتر في التجارب وصفها هنا) . يشير مؤشر ليزر في الجزء الخلفي من الرأس أو النخاع الشوكي من الجرو الماوس (انظر الشكل 1). تجنب تسليط الليزر في عيون والتعرض طويل من الجلد لضوء الليزر.

2. البصرية انماط من أقدم الحيوانات

  1. عميق تخدير الماوس (P14 الذين تتراوح أعمارهم بين لP138 في وصف التجارب هنا) مع جرعة زائدة من بنتوباربيتال من خلال حقنة داخل الصفاق (120 ملغم / كغم من وزن الجسم). تأكيد التخدير السليم عن طريق فحص ردود الفعل الحيوان (قرصة لفترة وجيزة غيض من عشرالبريد الأذن أو واحدة من رجليه الخلفيتين لاستثارة منعكس تراجع من الأذن أو الساق).
  2. ملاحظة: على الرغم من استخدام جرعة زائدة من بنتوباربيتال (120 ملغ / كغ من وزن الجسم) نشير إلى إجراء الحقن ب "التخدير العميق" بدلا من القتل الرحيم، وذلك لأن الحيوان لا يزال مثالي على قيد الحياة (أي قلبها لا يزال ينبض)، عندما الجراحة ونضح تبدأ. وهذا يضمن نضح أكثر كفاءة الأجهزة الداخلية بما في ذلك الدماغ.
  3. مرة واحدة لا تظهر الحيوان أي ردود الافعال، وإزالة بعناية الجلد المغطي الجمجمة (الشكل 2A) عن طريق شق في الجلد الذي يغطي الجزء الخلفي من الرأس وقطع إلى القسم الوسطي من الجمجمة. فضح الجمجمة كشف للضوء الليزر ومراقبة مضان من خلال نظارات واقية مرشح كما هو موضح أعلاه. إذا لوحظ إشارة GFP إيجابية، انتقل إلى الخطوة 2، إن لم يكن، تضحية الحيوان من خلال قطع الرأس (الثاني / ضمان شكل القتل الرحيم التالية لدينااللوائح IACUC).

ملاحظة: في الفئران حتى كبار السن (> 1 شهر) مضان ويمكن ملاحظة من خلال عيون الحيوان.

2. Transcardial الإرواء وإعداد الدماغ

  1. يروي transcardially مع الجليد الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، كلوريد الصوديوم: 137 ملم، بوكل: 2.7 ملم، KH 2 PO 4: 1،76 ملم، نا 2 هبو 4: 10 ملم) باستخدام حقنة إبرة 30 G لإزالة حد كبير الدم من الحيوان.
    1. أولا، فتح بعناية القفص الصدري مع مقص حاد ومن ثم دفع الإبرة في البطين الأيسر من القلب. بدء ضخ PBS في القلب والشريان الأورطي ومباشرة بعد هذه الخطوة فتح الأذين الأيمن من القلب مع مقص للسماح للدم للخروج من الجسم. ملاحظة: الإرواء يأخذ 5-10 دقيقة اعتمادا على حجم الحيوان.
  2. بعد استنزاف من خلال نضح، قطع رأس الحيوان، وتأمين رئيسها مع دبوس نeedles (أو 30 G إبر المحاقن) من خلال ثقب من خلال تجويف العين في طبق التحضير وإزالة الدماغ من الجمجمة.
    1. أولا، استخدام مقص حاد لقطع الجلد تتراكب الجمجمة: إجراء شق صغير في الجزء الخلفي من الرأس، ثم قطع على طول خط الوسط على الجانب الظهري للرأس، وقطع على الجانبين فقط caudally من أعين الحيوان وقطع اخيرا في اتجاه الذيلية لإزالة اللوحات من الجلد في الجزء الخلفي من الرأس.
    2. بعد ذلك، تكرار نمط قطع نفسه عن الجمجمة نفسها، للتأكد من إزالة كل قواقع في هذه العملية، لأن هذا سوف تبسيط كبير في إزالة جذع الدماغ في نهاية المطاف. بعد هذا الإجراء النصف الذيلية من الدماغ يجب أن تكمن مكشوفة تماما.
    3. في الخطوة التالية، واستخدام شفرة حلاقة حادة أو مشرط لقطع طريق الدماغ الأمامي كله في زاوية من نحو 45 درجة وحوالي 2 مم منقاري من المخيخ. يستخرج النصف الأمامي فصل من الدماغ مع أبملعقة الأنف والحنجرة.
    4. استخدام ملعقة لرفع النصف الذيلية من الدماغ في نهايته منقاري وخفض في وقت لاحق من خلال الأعصاب القحفية التي لا تزال متصلة جذع الدماغ على جانبها بطني. كنتيجة نهائية، ينبغي أن نصف الذيلية من الدماغ بما في ذلك الدماغ تقع بحرية قبالة بقية رئيس الحيوانية المعدة.
    5. الوجه النصف الذيلية إزالة من الدماغ لفضح جانبها بطني وقطع على طول الطائرة الاكليلية فقط منقاري (لحقن تقدمي) أو الذيلية فقط (لحقن رجعية) من "لمبات" يقع من الناحية البطنية التي تحتوي على الجسم شبه منحرف (راجع الخطوة 2.3).
      1. دائما استخدام شفرة حلاقة حادة أو مشرط لعملية القطع لتقليل موت الخلايا الناجم عن إجهاد الزائد على الأنسجة. كنتيجة نهائية، كان ينبغي الحصول على يزدرع الدماغ التي تمتد حوالي 1 سم في الطول، ويحتوي على مجمع الزيتونية متفوقة كاملة على طول مناطق أخرى من الدماغ.

ملاحظة: يوضح هذا البروتوكول الإجراء لحقن التتبع في الجسم شبه منحرف الموجود في الدماغ السمعية. التكيف مع المكان وتوجيه الطائرات قطع ومواقع الحقن حسب الحاجة. إذا كانت مناطق الدماغ الاستشعاع الاهتمام كذبة قريبة بما فيه الكفاية لسطح الدماغ، بحيث يمكن التعرف على وحقن بدون تقطيع الدماغ (انظر الشكل 2B)، ثم يمكن أن يتم حذف الخطوة قطع الاكليلية.

  1. تعرف على الجثة شبه منحرف عن اثنين من "المصابيح" بارزة بطني تحتوي على نواة بطني من الجسم شبه منحرف (VNTB).

ملاحظة: لمزيد من إشارة التشريحية عن موقع المجسم التقريبي لهذه الطائرات قطع، انظر فرانكلين وPaxinos 2008. لوحة 78 من الأطلس، Bregma ~ -5.7 مم يدل على نواة وسطي من الجسم شبه منحرف (= MNTB) وصفت بأنها "TZ ". لوحة 69 يظهر النواة البطنية من بو شبه منحرفدى (VNTB) وصفت بأنها "MVPO" (نواة periolivary medioventral) 19.

3. تقدمي / الوراء للبحث عن المفقودين

ملاحظة: تنفيذ كافة الإجراءات التالية في RT (25 ° C).

  1. بعد القطع، ووضع يزدرع الدماغ في طبق التحضير تحتوي على الاوكسيجين (95٪ O 2، 5٪ CO 2) تشريح الحل (كلوريد الصوديوم: 125 ملم، بوكل: 2.5 ملم، MgCl 2: 1 ملم، CaCl 2: 0.1 ملم والجلوكوز : 25 مم، ناه 2 PO 4: 1،25 ملم، NaHCO 3: 25 مم، حمض الاسكوربيك: 0.4 ملم، ميو-إينوزيتول: 3 مم، حمض البيروفيك: 2 مم)، وتأمين مع 30 G إبر المحاقن. تأكد من أن منطقة الحقن تواجه صعودا.
  2. سحب ماصات حقن من الزجاج البورسليكات وشغل لهم مع أحد الحلول الثلاثة التالية: أ) 1.0 ملغ / مل حل من choleratoxin-الوحيدات بالأبيض مترافق إلى fluorophore اليكسا 555 في برنامج تلفزيوني 12-13 (تستخدم أساسا لنقل الوراء)، ب أ) -d 1٪ilution في المياه المالحة 0.9٪ من tetramethylrhodamine ديكستران 555 (3000 ميغاواط، وتستخدم أساسا لنقل الوراء) أو ج) -dilution 1٪ في المياه المالحة 0.9٪ من 10000 ميجاوات ديكستران-TRITC 555 (تستخدم أساسا لنقل تقدمي).
    1. تأكد من أن مجموعة مقاومات حقن ماصة 2،5-3،5 MOHM والتي يتم تصنيعها في 3-4 دورات سحب. لوصف التجارب هنا، تحقيق ذلك من خلال اختيار خوارزمية مبرمجة مسبقا سحب على مجتذب ماصة.
  3. إلقاء الضوء على يزدرع الدماغ باستخدام مؤشر الليزر شنت ثابت من الطول الموجي المناسب (البند رقم 2 في الشكل 3A، 405 نانومتر الطول الموجي في وصف التجارب هنا). استخدام مؤشر ليزر كدليل للحقن، وتهدف شعاع الليزر على نواة الدماغ fluorescently المسمى أو خلايا الفائدة التي سيتم حقنها.
  4. البحث ومراقبة المنطقة المستهدفة مضيئة من خلال المجهر مجهر حين يرتدي نظارات مرشح متوافقة (450-700 نانومتر مرشح الفرقة تمرير في وصف التجارب هنا). إدراج القطب الحقن عن طريق micromanipulator في مجال الفائدة.
  5. حقن مادة التتبع. تتكون حقن 2-10 البقول ضغط 15 رطل لمدة 50 ميللي ثانية لكل منهما، باستخدام جهاز حقن الضغط، موجهة بشكل عمودي في المنطقة ذات الاهتمام (ROI) داخل قسم المخ. إدارة كل نبضة ضغط على فترات من 10 - 15 ثانية للسماح للصبغة في الانتشار.
  6. في حالة tetramethylrhodamine (TRITC) الحقن، بالإضافة إلى تحفيز كهربائيا لتعزيز امتصاص الصبغة من خلال Electroporation للمع القطب وضعها في منطقة الدماغ من الفائدة (MNTB وVNTB في وصف التجارب هنا).
    1. استخدام 8 البقول TTL من 8 فولت لمدة 50 ميللي ثانية مع 50 مللي ثانية interpulse فترات مدفوعة مشجعا وتضخيمها إلى 55 V مع وحدة التحفيز العزلة (البنود رقم 7 و 9 في الشكل 3B). استخدام 10-20 تكرار هذا البروتوكول، اداريةالإحلال على مدى عدة دقائق 7،8. تأكد من توصيل القطب صحيح - يجب أن تكون متصلا سلك التأريض إلى حل حمام!
  7. تحقق من نجاح الحقن. منذ التتبع الفلورسنت مع الطول الموجي الانبعاثات أطول وينبعث منها أيضا إشارة الفلورسنت على الإثارة الليزر بأطوال موجية أقصر، والتحقق بصريا لامتصاص الصبغة / انتشرت في المنطقة المستهدفة حقن حين إلقاء الضوء على منطقة مع الليزر ومراقبة من خلال نظارات التصفية.

4. الحضانة

  1. بعد الحقن، واحتضان brainstems في الاوكسيجين السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF، كلوريد الصوديوم: 125 ملم، بوكل: 2.5 ملم، MgCl 2: 1 ملم، CaCl 2: 2 مم، الجلوكوز: 25 مم، ناه 2 PO 4: 1،25 ملم، NaHCO 3: 25 مم، حمض الاسكوربيك: 0.4 ملم، ميو-إينوزيتول: 3 مم، حمض البيروفيك: 2 مم، فقاعات مع 95٪ O 2-5٪ CO 2) في درجة حرارة الغرفة (RT، 25 ° C) لمدة 1 - 4 ساعات، في حينيتم نقل الصبغة. فقاعة الحل خلال فترة الحضانة بأكملها.
  2. وفي وقت لاحق، ونقل brainstems في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) الذائب في برنامج تلفزيوني (حوالي 100 مل؛ درجة الحموضة 7 لمزيج PFA / PBS) واحتضان لهم في 4 درجات مئوية للسماح بعد التثبيت، بين عشية وضحاها (O / N).

5. الأنسجة التقطيع والتركيب

  1. في اليوم التالي، وغسل الدماغ ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني (5 دقائق لكل خطوة الغسيل)، وتغطي في 4٪ أجار ثم تقطع إلى 50-80 ميكرون شرائح سميكة على vibratome. جبل شرائح باستخدام المتوسطة المتزايدة على شريحة زجاجية، وساترة.
  2. اختياريا، تسمية المقاطع مع نيسل الفلورسنت لمدة 25 دقيقة (على سبيل المثال الأزرق نيسل في التخفيف 1: 100 في AB وسائل الإعلام).
    1. لإعداد AB وسائل الإعلام، وخلط 250 مل من 0.2 M الفوسفات عازلة (PB، 51 مم KH 2 PO 4، 150 ملي نا 2 هبو 4)، 15 مل 5 M كلوريد الصوديوم، و 15 مل 10٪ تريتون-X، 220 مل ده 2 O و 5 ز albumine المصل البقري.
    2. Preceدي والنجاح في خطوة وصفها نيسل بنسبة 3 خطوات الغسيل في برنامج تلفزيوني (10 دقيقة لكل منهما).

ملاحظة: في الحالات التي تحتاج أقسام سمكا لتركيبها وتحليلها (في التجارب وصفها هنا هذه الشرائح كانت 100-500 ميكرون سميكة للحفاظ على اتصالات محور عصبي لمسافات أكبر)، وتقنية يمكن دمجها مع المقاصة الأنسجة. وجدنا ClearT2 12 لتكون ناجحة 20. عندما يتم تضمين خطوة المقاصة الأنسجة، وتنفيذ ذلك قبل تركيب الأبواب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

أرقام 1 و 2 إظهار كيف يمكن استخدام مؤشر ليزر ونظارات ليزر بسرعة وبتكلفة زهيدة إلى التركيب الوراثي الحيوانات إيجابية GFP من القمامة. في حالات الجراء الماوس الشباب، ويمكن استخدام هذه التقنية لتحديد noninvasively التسمية GFP في أدمغة الحيوانات من خلال الجمجمة والجلد ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

A القوة العامة في المختبر التتبع Electroporation لل، خلافا لفي الدراسات المجراة البحث عن المفقودين، هو أنه يعطي الباحثين أفضل للوصول إلى منطقة الدماغ من الفائدة، وبالتالي، لا تنطوي على المجسم مكلفة (وغالبا الكهربية) المعدات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن فترة بقاء اللاز?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgements

بدعم من المعاهد الوطنية للصحة / أجريت NIDCD R01 DC التجارب 011582. التصوير في جامعة كولورادو أنشوتز الطبي الجامعي المتقدم المجهر الضوئي الأساسية بدعم جزئي من المعاهد الوطنية للصحة / NCRR كولورادو CTSI غرانت عدد UL1 RR025780 واضطرابات روكي ماونتن Neurlogical مركز الأساسية غرانت NIH P30NS048154. الدكتور ساشا دو لاك من معهد سالك قدم لنا مع الفئران GlyT2-GFP.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium chlorideSigma-AldrichS7653All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.
Potassium chloride P9333
Potassium phosphate monobasicP5655
Sodium phosphate di-basicS907
Magnesium chlorideM2670
Calcium chlorideC5080
GlucoseG7528
Sodium bicarbonateS6297
Ascorbic acidA4544
Myo-inositolI5125
Sodium pyruvateP2256
Bovine serum albumineA2153optional, for additional (immuno)histochemistry
Triton-X-100X100optional, for additional (immuno)histochemistry
Poly(ethylene glycol), 8000 MWP2139optional, for brain clearing
FormamideFisher ScientificF84optional, for brain clearing
Choleratoxin subunit-bMolecular ProbesC-34776 (Alexa 555) 
Dextrane tetramethyl-rhodamineMolecular ProbesD-7162 (Alexa 555)
Fluorescent NisslInvitrogenN-21479 (blue)optional
ParaformaldehydeFisher ScientificSF93
AgaroseInvitrogen16520
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Pentobarbi-talVortech PharmaceuticalsFatal-Plus 
Borosilicate glass filamentsHarvard ApparatusG150F-10
Pipette pullerZeitz Instruments, GermanyDMZ Universal Puller
Perfusion setupCustom-made
Laser pointer laserpointerpro.com, Hong KongHK-88007294 (405 nm)
Filter/safety gogglesDragon Lasers, ChinaLSG09 (band-pass 450-700 nm)
Bionocular microscope Wild Heerbrugg, SwitzerlandWild M3Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) 
PicospritzerParker InstrumentsPicospritzer III
PC with installed MC Stimulus softwareMulti Channel Sys-tems, Germany (software)
2-channel stimulatorMulti Channel Sys-tems, GermanySTG-1002
Stimulation isolation unitA.M.P.I., IsraelIso-Flex
MicromanipulatorNarishige, JapanYOU-1
VibratomeLeica, GermanyVT1000S

References

  1. Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
  2. Fink, R. P., Heimer, L. Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system. Brain Res. 4, 369-374 (1967).
  3. Nauta, W. J. Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system. Stain Technol. 27, 175-179 (1952).
  4. Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Maloine, Paris. (1911).
  5. Kristensson, K., Olsson, Y. Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon. Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).
  6. Kristensson, K., Olsson, Y. Retrograde axonal transport of protein. Brain Res. 29, 363-365 (1971).
  7. Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways. J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).
  8. Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance. J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).
  9. Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
  10. Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers. Brain Res. 223, 381-385 (1981).
  11. Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP. Brain Res. 231, 33-50 (1982).
  12. Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect. Brain Res. 1240, 87-95 (2008).
  13. Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats. Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).
  14. Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
  15. Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).
  16. Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons. Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).
  17. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
  18. Heintz, N. Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research. Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).
  19. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd ed, Elsevier/Academic Press. New York. (2008).
  20. Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
  21. Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy. J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).
  22. Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
  23. Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).
  24. Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse. Front. Neural Circuits. 8, 83(2014).
  25. Benson, D. A., Teas, D. C. Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla. Brain Res. 103, 313-338 (1976).
  26. Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera). Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).
  27. Ryan, A. Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).
  28. Zwicker, E., Fastl, H. Psychoacoustics Facts and Models. , Springer. (1990).
  29. Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).
  30. Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).
  31. Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains. J. Vis. Exp. (6), e235(2007).
  32. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  33. Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

105 Electroporation tetramethylrhodamine choleratoxin Electroporation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved