Neuronal Tracing em explantes cérebro guiadas a laser

Resumo

Nós descrevemos uma técnica para identificar neurônios e seus processos via anterógrada ou retrógrada tracer injeções em núcleos cerebrais usando uma preparação in vitro. Nós modificamos um método existente de i n vitro tracer eletroporação, aproveitando fluorescente etiquetado ratos mutantes e equipamentos ópticos de base, a fim de aumentar a precisão de rotulagem.

Resumo

Nós apresentamos uma técnica que combina um protocolo in vitro injecção traçador, que utiliza uma série de impulsos eléctricos e de pressão para aumentar a absorção do corante através de electroporação em explantes de cérebro com iluminação laser direcionados e correspondentes óculos com filtro durante o procedimento. A técnica descrita de electroporação in vitro, por si só produz relativamente bom controlo visual para o objectivo de certas áreas do cérebro. Combinando-a com excitação laser de marcadores genéticos fluorescentes e sua leitura através de óculos de proteção do filtro de passagem de banda, o que pode pegar as emissões das células geneticamente marcadas / núcleos e o corante de rastreamento fluorescente, um pesquisador pode aumentar substancialmente a precisão das injeções encontrando a área de interesse e para controlar a propagação de corante / absorção na área de injecção muito mais eficientemente. Além disso, a técnica de iluminação do laser permite estudar a funcionalidade de um determinado neurocircuit por provIding informações sobre o tipo de neurónios que se projectam para uma determinada área em casos em que a expressão da GFP está relacionada com o tipo de transmissor expressa por uma sub-população de neurónios.

Introdução

A fim de estabelecer um certo (micro) circuito neuronal, deve-se começar por encontrar os vários participantes do referido circuito, e seu padrão de conexão. Desde a publicação de Waller sobre rastreamento através de Lesão ^uma grande variedade de técnicas de rastreamento neuroanatomical neurofiber foi estabelecida. Algumas destas técnicas podem ser aplicadas no tecido fixa post mortem ^2-4, outros contam com o transporte activo do corante em neurónios vivos, como descoberto em 1971 ^5-6. Os últimos podem ainda ser subdivididos em dois grupos que discriminam entre os métodos aproveitando retrógrada activo (a partir da zona injectada para a fonte de uma determinada projeção, ou seja. O somata de neurónios que se projectam para a referida área) e anterógrada activo (a partir do injectados área para o destino de uma determinada projeção, ie. as projeções axonal e os terminais axonais dos neurônios marcados) de transporte. Além disso, em alguns casos tramaterial de CER é injectada em animais vivos que, em seguida, sobrevivem a injecção por vários dias ou semanas (em injecções vivo tracer), enquanto que em outros casos cérebros explantados são injectados e incubar durante várias horas após a injecção no líquido cerebrospinal artificial (in vitro injecções tracer) .

Neste protocolo, modificou um já existente na técnica de eletroporação vitro ^7-8 para rotular somata e processos neuronais em anterógradas e rastreamento retrógrado experimentos usando choleratoxin subunidade-b e tetramethylrhodamine dextrano como as substâncias de rastreamento. O objetivo geral deste protocolo é o de proporcionar neurocientistas com uma ferramenta eficiente para traçar padrões de conectividade neuronal entre diferentes núcleos cerebrais, enquanto aproveita as vantagens das linhas de camundongo transgênico disponíveis e equipamentos ópticos de base, a fim de aumentar a precisão do alvo durante injeções traçadores. Embora o método de anterógrada e retrógrada usando o rastreamentocholeratoxin e amina de dextrano e os seus respectivos conjugados marcados com fluorescência não é nova ^9-13 (como é o método de electroporação, por exemplo. Haas et ai. ^14), a combinação de marcador com injecções electroporação numa preparação in vitro envolvendo blocos de tecido cerebral é um desenvolvimento mais recente ^7. A sua principal vantagem sobre as técnicas de rastreio neuronais utilizando o mesmo tipo de corantes marcador nos animais vivos é o aumento da intensidade de marcação, em virtude da maior eficiência com que o corante é a electroporação podem ser tomados por neurónios. Uma vantagem adicional é o período de incubação encurtado (necessário para o transporte de corante) e da sua maior precisão o alvo durante a injecção do traçador, porque o experimentador tem o controlo visual sobre a área alvo da injecção. Este último também significa que nenhum equipamento caro estereotáxica é necessário para encontrar núcleo ou o cérebro área de interesse.

Para addicionalmente aumentar a precisão da focalização, que se aproveitou de uma linha de camundongo transgênico, que expressa GFP na sua subpopulação glicinérgica de neurônios ¹⁵ e equipamentos ópticos de base constituídos por um ponteiro laser de mão de 405 nm óculos de filtragem comprimento de onda e correspondência passa-banda (450 - 700 nm). Assim, conseguimos uma aumento significativo no direccionamento precisão, identificando a área de injecção através do seu sinal de fluorescência e ao proporcionar uma forma mais fina para controlar a difusão do corante dentro da área de injecção através da observação da interacção entre o sinal de GFP nativa e o traçador fluorescência. A nossa técnica também permite descobrir a funcionalidade de um circuito, juntamente com a sua conectividade por identificar neurónios inibitórios GFP positivas (ou excitatório em outras linhas de rato) que foram preenchidos com o traçador.

Em resumo, ainda mais reforçada uma poderosa ferramenta para estudar o neuroscientific conectoma do cérebro de vertebrados e avaliar tEle características diferentes neuroanatomical de um determinado neurocircuit. Ao usar camundongos transgênicos, juntamente com equipamentos ópticos barata e amplamente disponível, fomos capazes de aumentar significativamente a precisão da focalização dos nossos injeções. Além disso, os ratinhos transgénicos nos permitiu identificar o tipo das ligações rastreadas, que ajudaram a descobrir a funcionalidade de um microcircuito inibitório no tronco encefálico.

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Protocolo

1. A genotipagem Optical

1. Optical Genotipagem do mouse filhotes de cachorro

1. Entrada para a expressão do respectivo marcador fluorescente usando um ponteiro laser do comprimento de onda de excitação apropriado (405 nm, nas experiências descritas aqui) e correspondente óculos de filtro de bloqueio do comprimento de onda de excitação, mas passando o comprimento de onda de emissão (450 - 700 nm, nas experiências descritas aqui) . Apontar o ponteiro laser na parte posterior da cabeça ou espinal medula de rato a pup (ver Figura 1). Evitar que brilha o laser para os olhos e longa exposição da pele à luz laser.

2. Optical genotipagem de animais mais velhos

1. Profundamente anestesiar o rato (p14 envelhecido ao p138 nas experiências descritas aqui) com uma overdose de pentobarbital através de uma injecção intraperitoneal (120 mg / kg de peso corporal). Confirme anestesia adequada, verificando os reflexos do animal (apertar brevemente a ponta do the orelha ou uma das patas traseiras para o reflexo de retração da orelha ou na perna).
2. Nota: Apesar do uso de uma overdose de pentobarbital (120 mg / kg de peso corporal) nos referimos ao procedimento de injeção como "anestesia profunda" em vez de eutanásia, porque o animal é idealmente ainda vivo (ou seja, seu coração ainda está batendo), quando o cirurgia e começar a perfusão. Isto assegura uma perfusão mais eficiente dos órgãos internos incluindo o cérebro.
3. Uma vez que o animal não mostram quaisquer reflexos, remover cuidadosamente a pele que cobre o crânio (Figura 2A), fazendo uma incisão na pele que cobre a parte traseira da cabeça de corte e para o meio do crânio. Expor o crânio expostos a luz laser e observar a fluorescência através dos óculos de filtro, conforme descrito acima. Se um sinal de GFP positiva é observada, vá para a etapa 2, se não, sacrificar o animal através de decapitação (segunda / garantindo forma de eutanásia seguindo a nossaRegulamentos IACUC).

Nota: Nos ratos mais velhos mesmo (> 1 mês) a fluorescência podem ser observados através dos olhos do animal.

2. transcardial perfusão e Preparação Cérebro

1. Perfundir transcardialmente com gelada salina tamponada com fosfato (PBS; NaCl: 137 mM, KCl: 2,7 mM, KH _{2 PO 4} 1,76 mM, _Na 2 HPO _{4, 10} mM) utilizando uma agulha de seringa de 30 L para remover em grande parte do sangue a partir de o animal.
   1. Primeiro, abra cuidadosamente a caixa torácica com uma tesoura afiada e, em seguida, empurre a agulha para o ventrículo esquerdo do coração. Começar a bombear a PBS para o coração e a aorta e imediatamente após este passo abrir o átrio direito do coração com a tesoura para permitir que o sangue saia do corpo. Nota: Perfusão leva de 5 - 10 minutos, dependendo do tamanho do animal.
2. Após sangria por meio de perfusão, decapitar o animal, garantir a sua cabeça com o pino needles (ou 30 g) por agulhas de seringa perfurar-los através dos soquetes de olho em um prato preparação e remover o cérebro do crânio.
   1. Em primeiro lugar, utilizar uma tesoura afiada para cortar a pele que cobre o crânio: fazer uma pequena incisão na parte de trás da cabeça, em seguida, cortada ao longo da linha média do lado dorsal da cabeça, cortada aos lados apenas caudal de os olhos do animal e por último corte na direcção caudal, para remover completamente os retalhos de pele na parte de trás da cabeça.
   2. Em seguida, repetir o mesmo padrão de corte para o próprio crânio, certifique-se de remover ambas as cócleas no processo, porque isso irá simplificar significativamente a remoção do tronco cerebral no final. Após este procedimento, a metade caudal do cérebro deve situar-se completamente exposta.
   3. No passo seguinte, utilizar uma lâmina de barbear afiada ou um bisturi para cortar através de todo o cérebro anterior com um ângulo de cerca de 45 ° e cerca de 2 mm rostral do cerebelo. Retire a metade da frente separados do cérebro com abespátula ent.
   4. Usar uma espátula para elevar a metade caudal do cérebro na sua extremidade rostral e subsequentemente cortar os nervos cranianos que ainda estão ligados ao tronco cerebral no seu lado ventral. Como resultado final, a metade caudal do cérebro, incluindo o tronco cerebral devem cair livremente fora do resto da cabeça preparados para animais.
   5. Vire a metade caudal removido do cérebro para expor seu lado ventral e corte ao longo do plano coronal apenas rostral (para as injeções anterógradas) ou apenas caudal (para as injeções retrógradas) das "lâmpadas" ventrally localizados contendo o corpo trapézio (veja o passo 2.3).
      1. Utilize sempre uma lâmina afiada ou um bisturi para o procedimento de corte para minimizar a morte celular causada por estresse mecânico excessivo sobre o tecido. Como resultado final, um explante cérebro que mede cerca de 1 cm de comprimento e contendo o complexo olivar superior completa ao longo de outras regiões do cérebro deve ter sido obtida.

Nota: Este protocolo demonstra o processo de injecção de um traçador no corpo trapezoidal localizado no tronco cerebral auditivo. Adaptar a localização e a orientação dos planos de corte e dos locais de injecção, conforme necessário. Se as regiões do cérebro fluorescentes de interesse estão muito próximas o suficiente para a superfície do cérebro, de modo que eles podem ser identificados e injectados sem cortar o cérebro (ver Figura 2B), então o passo de corte coronal pode ser omitido.

3. Identificar o corpo trapézio como dois ventrais proeminentes "lâmpadas" contendo o núcleo ventral do corpo trapézio (VNTB).

Nota: Para mais referência anatômica em relação à localização estereotáxica aproximada desses planos de corte, consulte Franklin & Paxinos de 2008. Panel 78 dos atlas, Bregma ~ -5,7 mm mostra o núcleo medial do corpo trapezóide (= MNTB) rotulados como "Tz ". Painel 69 mostra o núcleo ventral do bo trapezoidaldy (VNTB) rotulados como "MVPO" (núcleo periolivary medioventral) ^19.

3. anterógrada / retrógrada Tracing

Nota: Execute todos os procedimentos a seguir em RT (25 ° C).

1. Após o corte, colocar o explante do tronco cerebral em um prato de preparação contendo oxigenada (95% _O 2, ₂ 5% de CO) dissecando solução (NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl _2: 1 mM, _CaCl2: 0,1 mM, glicose : 25 mM, NaH _{2 PO 4:} 1.25 mM, _NaHCO3 25 mM, ácido ascórbico: 0,4 mM, mio-inositol: 3 mM, ácido pirúvico: 2 mM), prendendo-o com 30 g de agulhas de seringa. Assegure-se que a área de injecção está virada para cima.
2. Puxar pipetas de injecção de vidro de borosilicato e enchê-los com uma das três soluções seguintes: a) um / ml, solução 1,0 mg de subunidade choleratoxin-b conjugado com um fluoróforo Alexa 555 em PBS ^_12-13 (usado principalmente para transporte retrógrado), b ) um -d 1%ilution em 0,9% de solução salina de tetramethylrhodamine dextrano 555 (3.000 MW, usado principalmente para transporte retrógrado) ou c) um -dilution 1% em solução salina 0,9% de 10.000 MW dextrano-TRITC 555 (usado principalmente para o transporte anterógrado).
   1. Assegure-se que as resistências das pipetas de injecção gama 2,5-3,5 MOhm e que eles são fabricados em 3 - 4 ciclos de tracção. Para as experiências aqui descritas, conseguir isto seleccionando um algoritmo pré-programado puxando o puxador na pipeta.
3. Iluminar o explante cérebro usando um ponteiro laser montado estaticamente do comprimento de onda apropriado (produto n ° 2 na Figura 3A; comprimento de onda de 405 nm, nas experiências descritas aqui). Use o ponteiro laser como um guia para as preparações injectáveis, e tem como objectivo o feixe de laser no núcleo cérebro marcado fluorescentemente ou células de interesse que será injectada.
4. Encontrar e observar a área alvo iluminado através de um microscópio binocular enquanto usava os óculos de filtragem compatíveis (450 - 700 nm, filtro passa-banda, nas experiências descritas aqui). Inserir o eléctrodo de injecção através do micromanipulador para a área de interesse.
5. Injectar a substância marcadora. As injecções de composto de 2 - 10 impulsos de pressão a 15 psi durante 50 ms cada, utilizando um dispositivo de injecção à pressão, dirigido perpendicularmente para a região de interesse (ROI) no interior da secção de cérebro. Administrar cada impulso de pressão em intervalos de 10 - 15 segundos para permitir que o corante se espalhar.
6. No caso das injecções de tetrametilrodamina (TRITC), adicionalmente estimular electricamente para melhorar a absorção do corante através de electroporação com o eléctrodo colocado na área do cérebro de interesse (MNTB e VNTB nas experiências descritas aqui).
   1. Use 8 pulsos TTL de 8 Volts por 50 ms com 50 ms de intervalo entre intervalos, impulsionado por um estimulador e amplificados a 55 V com uma unidade de isolamento, a estimulação (itens No. 7 e 9 na Figura 3B). Use 10 - 20 repetições deste protocolo, administered durante vários minutos ^7,8. Certifique-se para aterrar o eletrodo corretamente - o fio terra deve ser conectado à solução do banho!
7. Entrada para o sucesso da injecção. Uma vez que um marcador fluorescente com um comprimento de onda de emissão também já está a emitir um sinal de fluorescência após excitação laser com comprimentos de onda mais curtos, para verificar visualmente a absorção do corante / espalhar na área alvo injectado enquanto iluminando a área com o laser e observando através dos filtros de óculos.

4. Incubação

1. Após a injecção, incubar o tronco cerebral em oxigenado fluido cerebrospinal artificial (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl _2: 1 mM, CaCl _2: 2 mM, glucose 25 mM, NaH _{2 PO 4:} 1,25 mM, _NaHCO3: 25 mM, ácido ascórbico: 0,4 mM, mio-inositol: 3 mM, ácido pirúvico: 2 mM, fez-se borbulhar _95% de O2 - _5% de CO2) à temperatura ambiente (TA, 25 ° C) durante 1 - 4 horas, enquantoo corante está a ser transportado. Bolha da solução durante todo o período de incubação.
2. Subsequentemente, transferir os tronco cerebral em 4% de paraformaldeído (PFA) dissolvido em PBS (aproximadamente 100 mL;. PH 7 para a mistura de PFA / PBS) e incuba-se-lhes a 4 ° C para permitir a pós-fixação durante a noite (O / N).

5. Tissue corte e montagem

1. No dia seguinte, o tronco cerebral lavar três vezes em PBS (5 min para cada passo de lavagem), cobri-lo em 4% de agar e, em seguida, cortada em 50 - 80 pm de espessura fatias em um vibratome. Fatias de montagem utilizando um meio de montagem sobre uma lâmina de vidro, e lamela.
2. Opcionalmente, rotular as secções com Nissl fluorescente durante 25 min (por exemplo, azul de Nissl em uma diluição de 1: 100 em meio AB).
   1. Para preparar meios AB, misturar 250 ml de tampão fosfato 0,2 M (PB; KH 51 mM _{2 PO 4,} 150 mM de Na ₂ HPO _4), 15 ml de NaCl 5 M, 15 ml de 10% de Triton-X, de 220 ​​ml _ddH2O e 5 g de albumina de soro bovino.
   2. Precede e sucede à rotulagem passo Nissl por 3 etapas de lavagem em PBS (10 min cada).

Nota: Nos casos em secções mais espessas necessitam de ser montadas e analisadas (em experiências aqui descritas tais fatias foram 100 - 500 mícrons de espessura para preservar ligações axonais ao longo de distâncias maiores), a técnica pode ser combinada com a limpeza dos tecidos. Nós encontramos o ClearT2 ¹² para ser bem sucedido ^20. Quando um passo de compensação tecido está incluído, realizá-la antes da montagem das seções.

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Resultados

As Figuras 1 e 2 mostram como o ponteiro laser e óculos de laser podem ser usados ​​de forma rápida e barata genótipo animais positivos para GFP de uma ninhada. Em casos de jovens filhotes de rato, a técnica pode ser utilizada para identificar de forma não invasiva etiqueta GFP em cérebros do animal através do crânio e a pele sobrejacente (Figura 1A - D). A fluorescência emitida pode ser visto através da pele e o crânio de filhotes de rato, pelo menos até ao dia pós-nat...

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Discussão

A força geral de in vitro tracer eletroporação, ao contrário de estudos in vivo de rastreamento, é que ele dá aos pesquisadores um melhor acesso à área do cérebro de juros e, portanto, não envolve estereotáxica caro (e muitas vezes eletrofisiológico) equipamentos. Além disso, o período de sobrevivência requerido para os explantes cerebrais abrange apenas algumas horas (1 - 4) em vez de dias ou mesmo semanas, no caso de in vivo injecções marcador (ver uma revisão detalhada sob...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.
Potassium chloride		P9333
Potassium phosphate monobasic		P5655
Sodium phosphate di-basic		S907
Magnesium chloride		M2670
Calcium chloride		C5080
Glucose		G7528
Sodium bicarbonate		S6297
Ascorbic acid		A4544
Myo-inositol		I5125
Sodium pyruvate		P2256
Bovine serum albumine		A2153	optional, for additional (immuno)histochemistry
Triton-X-100		X100	optional, for additional (immuno)histochemistry
Poly(ethylene glycol), 8000 MW		P2139	optional, for brain clearing
Formamide	Fisher Scientific	F84	optional, for brain clearing
Choleratoxin subunit-b	Molecular Probes	C-34776 (Alexa 555)
Dextrane tetramethyl-rhodamine	Molecular Probes	D-7162 (Alexa 555)
Fluorescent Nissl	Invitrogen	N-21479 (blue)	optional
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	SF93
Agarose	Invitrogen	16520
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Pentobarbi-tal	Vortech Pharmaceuticals	Fatal-Plus
Borosilicate glass filaments	Harvard Apparatus	G150F-10
Pipette puller	Zeitz Instruments, Germany	DMZ Universal Puller
Perfusion setup	Custom-made
Laser pointer	laserpointerpro.com, Hong Kong	HK-88007294 (405 nm)
Filter/safety goggles	Dragon Lasers, China	LSG09 (band-pass 450-700 nm)
Bionocular microscope	Wild Heerbrugg, Switzerland	Wild M3	Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)
Picospritzer	Parker Instruments	Picospritzer III
PC with installed MC Stimulus software	Multi Channel Sys-tems, Germany (software)
2-channel stimulator	Multi Channel Sys-tems, Germany	STG-1002
Stimulation isolation unit	A.M.P.I., Israel	Iso-Flex
Micromanipulator	Narishige, Japan	YOU-1
Vibratome	Leica, Germany	VT1000S