Lasergelenkte neuronale Tracing in Brain Explantate

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Technik, um Neuronen und ihre Prozesse über anterograden oder retro Tracer Injektionen in Hirnkernen unter Verwendung eines in vitro-Präparat zu bezeichnen. Wir modifiziert eine vorhandene Methode der i n vitro Tracer Elektroporation durch die Nutzung von fluoreszenzmarkierte Mausmutanten und grundlegende optische Geräte, um die Kennzeichnung Genauigkeit zu erhöhen.

Zusammenfassung

Präsentieren wir eine Technik, die eine in vitro-Tracer Injektionsprotokoll, das eine Reihe elektrischer und Druckimpulse verwendet, um die Farbstoffaufnahme durch Elektroporation in Gehirn Explantate mit gezielten Laserbeleuchtung und passende Filterbrille während des Verfahrens zu erhöhen verbindet. Die beschriebene Technik der in vitro-Elektroporation von selbst ergibt eine relativ gute Sichtkontrolle für Targeting bestimmter Bereiche des Gehirns. Durch die Kombination mit Laseranregung fluoreszierender genetischen Markern und deren Auslesen durch Band-Passing-Filterbrille, die abholen können die Emissionen der genetisch markierten Zellen / Kerne und der Fluoreszenz Tracing-Farbstoff, ein Forscher kann im Wesentlichen die Genauigkeit der Einspritzungen zu erhöhen von der Suche nach den interessierenden Bereich und Controlling für das Farbstoff-Ausbreitung / Aufnahme im Injektionsbereich sehr viel effizienter. Außerdem ermöglicht das Laserbeleuchtungstechnik, um die Funktionalität eines gegebenen neurocircuit Prov studierenIding Informationen über die Art von Neuronen auf einen bestimmten Bereich in den Fällen, wo der GFP-Expression in den Typ des Senders von einer Subpopulation von Neuronen verbunden vorsteht.

Einleitung

Um eine bestimmte neuronale (Mikro-) Schaltung zu definieren, muß man durch Auffinden der verschiedenen Teilnehmer der Schaltung und ihre Verbindungsstruktur zu beginnen. Seit Wallers Publikation über neurofiber Verfolgung durch Läsion ¹ eine Vielzahl von neuroanatomischen Tracing-Techniken hergestellt wurde. Einige dieser Techniken können in festen Gewebe post mortem ^2-4 angewendet werden, andere stützen sich auf den aktiven Transport des Farbstoffes in lebenden Neuronen, wie 1971 ^5-6 entdeckt. Letztere kann weiter in zwei Gruppen Unterscheiden zwischen Methoden unter Ausnutzung der aktiven retrograden unterteilt werden (von der Injektionsstelle zu der Quelle eines gegebenen Vorsprungs, dh. Die Zellkörper von Neuronen, die vorstehen, sind an der Fläche) und aktive anterograde (von der eingespritzten Bereich in den Ziel einer gegebenen Projektion, d. axonalen Vorsprüngen und den axonalen Anschlüssen des markierten Neuronen) transport. Auch in einigen Fällen tracer Material in lebende Tiere, die dann überleben die Injektion von mehreren Tagen oder Wochen (in vivo Tracer Injektionen), während in anderen Fällen explantierten Gehirn injiziert werden und Inkubation für mehrere Stunden nach der Injektion in der künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit injiziert (in vitro Tracer Injektionen) .

In diesem Protokoll modifizierten wir ein in vitro Elektroporationstechnik ^7-8 bestehende neuronale Zellkörper und Prozesse in anterograden und retrograden Verfolgungsexperimente mit Choleratoxin-Untereinheit B und Tetramethylrhodamin Dextran als Verfolgungssubstanzen zu markieren. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Neurowissenschaftler mit einem effizienten Werkzeug, um neuronale Konnektivität Muster zwischen verschiedenen Hirnkerne verfolgen zu schaffen, und gleichzeitig die Vorteile der verfügbaren transgenen Mauslinien und Grund optische Geräte, um die Zielgenauigkeit beim Tracer Injektionen erhöhen. Obwohl das Verfahren der anterograden und retrograden Verfolgung mitCholeratoxin und Dextran Amin und ihre jeweiligen fluoreszenzmarkierten Konjugaten ist nicht neu ^9-13 (ebenso wie die Methode der Elektroporation, z. Haas et al. ^14), die Kombination von Tracer-Injektionen mit Elektroporation in einem in vitro-Präparat mit Blöcken von Hirngewebe ist eine neuere Entwicklung ^7. Sein Hauptvorteil, neuronale Verfolgungstechniken unter Verwendung der gleichen Art von Tracer Farbstoffe in lebenden Tieren ist die erhöhte Markierungsintensität, wegen der höheren Effizienz, mit der das elektroporierte Farbstoff wird durch Neuronen entnommen. Ein zusätzlicher Vorteil ist die verkürzte Inkubationszeit (für die Farbstofftransport erforderlich) und seine erhöhte Zielgenauigkeit während der Tracerinjektion, weil der Experimentator visuelle Kontrolle über den Zielbereich der Injektion. Letzteres bedeutet, dass auch keine teuren stereo Ausrüstung erforderlich, um den Kern oder Gehirnbereich von Interesse zu finden.

Um additional erhöht Zielgenauigkeit, nutzten wir eine transgene Mauslinie, die GFP in seiner glycinergen Subpopulation von Neuronen ^{15 und} optischen Grundausrüstung, bestehend aus einem Hand-Laser-Pointer von 405 nm Wellenlänge und passenden Bandpassfilterung Brille (450 drückt - 700 nm). Somit eine erhebliche weitere Steigerung erzielten wir die Zielgenauigkeit durch die Identifizierung der Injektionsbereich durch seine Fluoreszenzsignals und durch Vorsehen einer feineren Weg für den Farbstoff Streuung in der Injektionsbereich durch Beobachtung der Wechselwirkung zwischen der indigenen GFP-Signals und der Kopierregel Fluoreszenz. Unser Verfahren ermöglicht es auch, die Funktion eines Schaltkreises zusammen mit der Konnektivität durch Identifizieren GFP-positive inhibitorische Neuronen (oder in anderen exzitatorischen Mauslinien), die mit dem Tracer gefüllt waren aufzudecken.

Zusammenfassend haben wir weiter verbessert ein leistungsfähiges Werkzeug, um die neuro Connectome des Wirbeltiergehirns zu studieren und zu beurteilen ter verschiedene neuroanatomische Merkmale eines gegebenen neurocircuit. Durch Verwendung von transgenen Mäusen zusammen mit preiswerten und überall erhältlich optische Geräte konnten wir die Zielgenauigkeit der Injektionen deutlich erhöhen. Darüber hinaus konnten wir die transgenen Mäuse, die Art der zurück Verbindungen, die Aufdeckung der Funktionalität einer inhibitorischen Mikroschaltung im auditorischen Hirnstamm geholfen zu identifizieren.

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Protokoll

1. Optische Genotypisierung

1. Optische Genotypisierung von Maus Pups

1. Check für die Expression des jeweiligen Fluoreszenzmarker mit einem Laserzeiger des geeigneten Anregungswellenlänge (405 nm in den hier beschriebenen Experimenten) und entsprechenden Filterbrille Blockierung der Anregungswellenlänge aber Passieren der Emissionswellenlänge (450 - 700 nm in den hier beschriebenen Experimente) . Richten Sie den Laserpointer auf der Rückseite des Kopfes oder das Rückenmark der Maus pup (siehe Abbildung 1). Vermeiden Aufstrahlen des Lasers in den Augen und langwierige Exposition der Haut mit Laserlicht.

2. Optische Genotypisierung von älteren Tieren

1. Die Maus (im Alter von p14 an p138 in den hier beschriebenen Experimenten) mit einer Überdosis Pentobarbital tief betäuben durch eine intraperitoneale Injektion (120 mg / kg Körpergewicht). Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch Überprüfung des Tieres Reflexe (kurz Prise der Spitze the Ohr oder einem der Hinterbeine auf die Rückzugsreflex des Ohres oder Bein) hervorzurufen.
2. Hinweis: Trotz der Verwendung einer Überdosis Pentobarbital (120 mg / kg Körpergewicht), verweisen wir auf das Injektionsverfahren als "tiefe Narkose" statt Euthanasie, weil das Tier ist im Idealfall noch am Leben (dh seinen Herz noch schlägt), wenn die Chirurgie und die Durchblutung beginnen. Dies gewährleistet eine effizientere Perfusion der inneren Organe, einschließlich des Gehirns.
3. Sobald das Tier keine Reflexe zeigen, aufmerksam, indem sie ein Schnitt in der Haut für den Hinterkopf und Schneiden, um den Mittelteil des Schädels entfernen Sie die Haut über den Schädel (2A). Setzen Sie das aufgedeckt Schädel mit Laserlicht und beobachten die Fluoreszenz durch die Filterbrille, wie oben beschrieben. Wenn eine positive GFP-Signal beobachtet wird, fahren Sie mit Schritt 2 zweite, wenn nicht, zu opfern das Tier durch Enthauptung (/ Gewährleistung Form von Euthanasie nach unsererIACUC Vorschriften).

Anmerkung: In noch älteren Mäusen (> 1 Monat) der Fluoreszenz kann durch die Augen der Tiere beobachtet werden.

2. transkardialer Perfusion und Neuro Vorbereitung

1. Perfundieren transkardial mit eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, KH _{2 PO 4} 1,76 mM, Na _{2 HPO 4:} 10 mm) unter Verwendung einer 30 G-Spritzennadel, um das Blut weitgehend entfernen das Tier.
   1. Zunächst öffnen Sie vorsichtig den Brustkorb mit einer scharfen Schere, und drücken Sie dann die Nadel in die linke Herzkammer. Pumpen die PBS in das Herz und die Aorta und unmittelbar nach diesem Schritt zu öffnen in den rechten Vorhof des Herzens mit der Schere, um die Blut zuzulassen, um den Körper zu verlassen. Hinweis: Perfusion dauert 5 - 10 min in Abhängigkeit von der Größe des Tieres.
2. Nach dem Ausbluten durch Perfusion, enthaupten, das Tier, sichern Sie den Kopf mit Stift needles (oder 30 G Spritzennadeln) durch Durchstechen sie durch die Augenhöhlen in einer Zubereitung Schale und entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel.
   1. Verwenden Sie zuerst eine scharfe Schere zu schneiden Sie die Haut, die über der Schädel: einen kleinen Schnitt in der Rückseite des Kopfes, dann entlang der Mittellinie auf der Rückenseite des Kopfes geschnitten, an den Seiten nur kaudal der Augen des Tieres geschnitten und schließlich Kürzung der kaudal vollständig die Klappen der Haut zu entfernen, an der Rückseite des Kopfes.
   2. Weiter, wiederholen Sie den gleichen Schnittmuster für den Schädel selbst, stellen Sie sicher, beide Kochleas in dem Prozess zu entfernen, da dies wesentlich die Entfernung der Hirnstamm am Ende zu vereinfachen. Nach diesem Vorgang ist die Schwanzgehirnhälfte sollte vollständig ausgesetzt liegen.
   3. Im nächsten Schritt, mit einem scharfen Rasierklinge oder einem Skalpell durch den gesamten Vorderhirn in einem Winkel von etwa 45 ° und etwa 2 mm rostral aus dem Cerebellum ausgeschnitten. Scoop aus der abgetrennten vorderen Hälfte des Gehirns mit abent Spachtel.
   4. Verwenden Sie den Spachtel, um den kaudalen Hirnhälfte an seinem rostralen Ende zu erheben und anschließend durch den Hirnnerven, die noch auf den Hirnstamm auf ihrer Bauchseite verbunden sind, geschnitten. Als Ergebnis sollte der kaudalen Hirnhälfte einschließlich des Hirnstamms frei aus dem Rest der präparierten Tier den Kopf fallen.
   5. Klappen Sie den entfernt kaudale Hälfte des Gehirns, seine Bauchseite freizulegen und entlang der Frontalebene nur rostral geschnitten (für die anterograde Injektionen) oder einfach Schwanz (für die retrograde Injektionen) der ventral gelegen "Birnen", die die trapezförmige Körper (siehe Schritt 2.3).
      1. Verwenden Sie immer eine scharfe Rasierklinge oder einem Skalpell für den Schneidvorgang, um den Zelltod durch übermäßige mechanische Beanspruchung des Gewebes zu minimieren. Als Endergebnis sollte ein Gehirn Explantat spannt etwa 1 cm in der Länge und mit der vollständigen oberen Olivenkomplex entlang anderen Hirnregionen erhalten worden sein.

Hinweis: Dieses Protokoll zeigt die Vorgehensweise für eine Tracerinjektion in die Trapezkörper im auditorischen Hirnstamm befindet. Passen Sie die Position und Ausrichtung der Schnittebenen und Injektionsstellen nach Bedarf. Wenn die fluoreszierende Gehirnregionen von Interesse liegen nahe genug an der Hirnoberfläche, so dass sie identifiziert und ohne Schneiden des Gehirns injiziert werden kann (siehe 2B), kann der koronalen Schneideschritt weggelassen werden.

3. Identifizieren Sie die trapezförmigen Körper als zwei ventralen prominente "Birnen", die den ventralen Kern der Trapezkörper (VNTB).

Hinweis: Weitere anatomischen Referenz über die ungefähre stereotaktische Position dieser Schnittebenen finden Franklin & Paxinos, 2008 Steuerung 78 des Atlas, Bregma ~ -5,7 mm zeigt die mediale Kern der Trapezkörper (= MNTB) als "Tz markiert ". Panel 69 zeigt die ventralen Kern des Trapezes body (VNTB) als "MVPO" (medioventralen periolivary Kern) ¹⁹ bezeichnet.

3. Anterograde / Retrograde Tracing

Hinweis: Führen Sie alle folgenden Schritte bei RT (25 ° C).

1. Nach dem Schneiden, legen den Hirnstamm Explantat in einer Zubereitung Schale mit oxygeniertem (95% O _{2, 5% CO} 2) Präparieren Lösung (NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl ₂ 1 mM, CaCl ₂ 0,1 mM, Glucose : 25 mM NaH _{2 PO 4} 1,25 mM, NaHCO _3: 25 mM Ascorbinsäure: 0,4 mM, myo-Inosit 3 mM, Brenztraubensäure: 2 mm) und schützt sie mit 30 g Spritzennadeln. Sicherzustellen, dass der Bereich der Injektion nach oben zeigt.
2. Pull-Spritzen Pipetten aus Borosilikatglas und füllen sie mit einer der folgenden drei Lösungen: a) einer 1,0 mg / ml Lösung von Choleratoxin-Untereinheit-b konjugierten auf ein Fluorophor Alexa 555 in PBS ^_12-13 (vor allem für die retrograden Transport verwendet), b ) eine 1% -dilution in 0,9% Salzlösung von Dextran Tetramethylrhodamin 555 (3000 MW, die hauptsächlich für den retrograden Transport verwendet wird) oder c) ein 1% Herkunft des Verdünnungs in 0,9% Salzlösung von 10.000 MW Dextran-TRITC 555 (hauptsächlich für anterograden Transport verwendet wird).
   1. Stellen Sie sicher, dass die Injektionspipette Widerstände Bereich von 2,5 bis 3,5 MOhm und dass sie in 3 hergestellt - 4 Ziehen Zyklen. Für die hier beschriebenen Experimente erreichen dies durch Auswahl einer vorprogrammierten Algorithmus Ziehen an der Pipettenzieher.
3. Beleuchten das Gehirn Explantat mit einem statisch montiert Laserzeiger der geeigneten Wellenlänge (Element No. 2 in 3A; 405 nm Wellenlänge in die hier beschriebenen Experimente). Verwenden Sie den Laserpointer als Leitfaden für die Injektionen, und das Ziel des Laserstrahls an der fluoreszierend markierten Hirnkern oder Zellen von Interesse, die eingespritzt wird.
4. Suchen und durch ein Binokular beachten Sie die beleuchtete Zielbereich beim Tragen die kompatiblen Filterbrille (450-700 nm Bandpassfilter in den hier beschriebenen Experimenten). Legen Sie die Injektionselektrode über den Mikromanipulator in das Gebiet von Interesse.
5. Spritzen Sie die Tracersubstanz. Die Einspritzungen bestehen aus 2 bis 10 Druckimpulse bei 15 psi für 50 msec, unter Verwendung einer Einspritzvorrichtung, die senkrecht in die Region von Interesse (ROI) gerichtet im Gehirn an. Verwalten jeder Druckimpuls in Intervallen von 10 bis 15 sec, damit der Farbstoff verteilt.
6. Im Fall der Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC) Injektionen stimulieren zusätzlich elektrisch mit der Farbstoffaufnahme durch Elektroporation mit der Elektrode in dem Bereich des Gehirns von Interesse (MNTB und VNTB in den hier beschriebenen Experimenten) platziert zu verbessern.
   1. 8 verwenden TTL-Impulse von 8 Volt für 50 msec 50 msec Impulsintervallen durch einen Stimulator mit einer Stimulationsisolationseinheit (Artikel No. 7 und 9 in 3B) angetrieben wird und mit 55 V verstärkt. Verwenden von 10 bis 20 Wiederholungen dieses Protokolls VerwalNamen über mehrere Minuten ^7,8. Stellen Sie sicher, um die Elektrode richtig geschliffen - das Erdungskabel sollte auf die Badlösung angeschlossen werden!
7. Überprüfen Sie für den Erfolg der Injektion. Da ein fluoreszierender Tracer mit einer längeren Emissionswellenlänge wird auch Emittieren eines Fluoreszenzsignals auf die Laseranregung mit kürzeren Wellenlängen, visuell zu überprüfen, für die Farbstoffaufnahme / der eingespritzten Zielfläche verteilt, während Beleuchten der Fläche mit dem Laser und die Beobachtung durch die Filterbrille.

4. Inkubation

1. Nach der Injektion inkubieren brainstems in oxygeniertem künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl ₂ 1 mM, CaCl ₂ 2 mM, Glucose: 25 mM NaH _{2 PO 4} 1,25 mM, NaHCO _3: 25 mM Ascorbinsäure: 0,4 mM, myo-Inosit 3 mM, Brenztraubensäure: 2 mm, mit _95% O 2 eingeblasen - _5% CO 2) bei Raumtemperatur (RT, 25 ° C) für 1 - 4 Stunden, währendder Farbstoff transportiert wird. Blasen die Lösung während der gesamten Inkubationszeit.
2. Anschließend übertragen die brainstems in 4% Paraformaldehyd (PFA), gelöst in PBS (ca. 100 ml;. PH 7 für den PFA / PBS mix) und inkubieren bei 4 ° C, um nach der Fixierung über Nacht ermöglicht (O / N).

5. Tissue Slicing und Montage

1. Am nächsten Tag, waschen Sie den Hirnstamm dreimal in PBS (5 min pro Waschschritt), bedecken Sie es in 4% Agar und dann in 50 geschnitten - 80 & mgr; m dicke Scheiben auf einem Vibratom. Berg Scheiben mit Hilfe eines Montagemedium auf einen Objektträger und Deckglas.
2. Wahlweise kennzeichnen die Abschnitte mit fluoreszierenden Nissl für 25 Minuten (zum Beispiel blau Nissl bei einer 1: 100 Verdünnung in AB-Medien).
   1. Um AB Medien vorzubereiten, mischen Sie 250 ml von 0,2 M Phosphatpuffer (PB; 51 mM _KH 2 PO 4, 150 mM _Na 2 HPO 4), 15 ml 5 M NaCl, 15 ml 10% Triton-X, 220 ml _ddH 2 O und 5 g Rinderserumalbumin.
   2. Precede und erfolgreich die Nissl Kennzeichnung Schritt 3 Waschschritten in PBS (jeweils 10 Minuten).

Anmerkung: Für den Fall, dickeren Abschnitten montiert werden müssen und analysiert (hier solche Scheiben beschriebenen Experimente wurden 100 bis 500 Mikrometer dick, um Axon-Verbindungen über größere Distanzen zu erhalten), kann die Technik mit Gewebe Clearing kombiniert werden. Wir fanden das ClearT2 ¹² erfolgreiche ²⁰ zu sein. Wenn ein Gewebe Verrechnungsschritt enthalten ist, führen sie vor der Montage der Teile.

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Ergebnisse

Die 1 und 2 zeigen, wie der Laserpointer und Laserschutzbrillen verwendet werden, um GFP-positiven Tieren schnell und kostengünstig Genotyp aus einem Wurf werden. In Fällen von jungen Maus Jungtieren kann die Technik verwendet werden, um nicht-invasiv zu identifizieren GFP Label in das Tier Gehirn durch den Schädel und die darüber liegende Haut (1A - D) werden. Emittierte Fluoreszenz durch die Haut und dem Schädel des Maus Welpen mindestens bis zur postnatalen Tag 3 (1C)

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Diskussion

Eine allgemeine Stärke in vitro Tracer Elektroporation, im Gegensatz zu in vivo Darstellung Studien ist, dass es Forschern besseren Zugang zum Gehirn Bereich von Interesse und folglich nicht teuer stereo (und oft elektro) Ausrüstung umfassen. Darüber hinaus ist die für das Gehirn Explantate erforderliche Überlebenszeit erstreckt sich über nur ein paar Stunden (1 - 4) anstelle von Tagen oder sogar Wochen im Fall von in vivo-Tracer Injektionen (siehe eine detaillierte Überprüfung auf der...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.
Potassium chloride		P9333
Potassium phosphate monobasic		P5655
Sodium phosphate di-basic		S907
Magnesium chloride		M2670
Calcium chloride		C5080
Glucose		G7528
Sodium bicarbonate		S6297
Ascorbic acid		A4544
Myo-inositol		I5125
Sodium pyruvate		P2256
Bovine serum albumine		A2153	optional, for additional (immuno)histochemistry
Triton-X-100		X100	optional, for additional (immuno)histochemistry
Poly(ethylene glycol), 8000 MW		P2139	optional, for brain clearing
Formamide	Fisher Scientific	F84	optional, for brain clearing
Choleratoxin subunit-b	Molecular Probes	C-34776 (Alexa 555)
Dextrane tetramethyl-rhodamine	Molecular Probes	D-7162 (Alexa 555)
Fluorescent Nissl	Invitrogen	N-21479 (blue)	optional
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	SF93
Agarose	Invitrogen	16520
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Pentobarbi-tal	Vortech Pharmaceuticals	Fatal-Plus
Borosilicate glass filaments	Harvard Apparatus	G150F-10
Pipette puller	Zeitz Instruments, Germany	DMZ Universal Puller
Perfusion setup	Custom-made
Laser pointer	laserpointerpro.com, Hong Kong	HK-88007294 (405 nm)
Filter/safety goggles	Dragon Lasers, China	LSG09 (band-pass 450-700 nm)
Bionocular microscope	Wild Heerbrugg, Switzerland	Wild M3	Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)
Picospritzer	Parker Instruments	Picospritzer III
PC with installed MC Stimulus software	Multi Channel Sys-tems, Germany (software)
2-channel stimulator	Multi Channel Sys-tems, Germany	STG-1002
Stimulation isolation unit	A.M.P.I., Israel	Iso-Flex
Micromanipulator	Narishige, Japan	YOU-1
Vibratome	Leica, Germany	VT1000S