Neuronal Tracing dans des explants de cerveau à guidage laser

Résumé

Nous décrivons une technique d'étiqueter les neurones et leurs processus via antérograde ou rétrograde traceurs injections dans les noyaux du cerveau en utilisant une préparation in vitro. Nous avons modifié une méthode existante de i n vitro traceur électroporation en profitant de marqué par fluorescence mutants de souris et de l'équipement optique de base afin d'augmenter la précision de l'étiquetage.

Résumé

Nous présentons une technique qui combine un protocole vitro traceur dans d'injection, qui utilise une série d'impulsions électriques et de pression pour augmenter l'absorption du colorant par électroporation dans des explants de cerveau avec un éclairage laser ciblée et correspondant à des lunettes filtrantes pendant la procédure. La technique décrite de l'électroporation in vitro par lui-même des rendements relativement bon contrôle visuel pour ciblant certaines zones du cerveau. En combinant avec excitation laser de marqueurs génétiques fluorescentes et leur lecture à travers des lunettes de filtre bande-passe, qui peut ramasser les émissions des cellules / noyaux génétiquement marqués et le colorant de traçage fluorescent, un chercheur peut augmenter considérablement la précision des injections en trouvant la zone d'intérêt et contrôle de la propagation de colorant / absorption dans la zone d'injection beaucoup plus efficacement. En outre, la technique d'éclairage au laser permet d'étudier la fonctionnalité d'une neurocircuit donnée par provIding informations sur le type de neurones se projetant dans une certaine zone dans les cas où l'expression de la GFP est liée au type d'émetteur exprimé par un sous-population de neurones.

Introduction

Afin de définir un certain neuronale (micro) circuit, il faut commencer par trouver les différents acteurs de ce circuit, et leur mode de connexion. Depuis la publication de Waller propos neurofiber traçage travers lesioning ¹ une grande variété de techniques de traçage neuroanatomiques a été établi. Certaines de ces techniques peuvent être appliquées dans les tissus post-mortem ^2-4 fixe, d'autres comptent sur ​​le transport actif du colorant dans les neurones vivants, comme l'a découvert en 1971 ^5-6. Celui-ci peuvent être subdivisés en deux groupes de discrimination entre les méthodes qui prennent avantage de rétrograde active (à partir de la zone injectée à la source d'une projection donnée, ie. Le soma des neurones qui sont saillie vers ladite zone) et antérograde active (de la injecté zone à la cible d'une projection donnée, ie. les projections axonales et les terminaisons axonales des neurones marqués) transport. En outre, dans certains cas, tramatériel de CER est injecté dans les animaux vivants qui a ensuite survivent à l'injection de plusieurs jours ou semaines (en injections de traceurs in vivo), tandis que dans d'autres cas cerveaux explantées sont injectés et incuber pendant plusieurs heures après l'injection dans le liquide céphalo-rachidien artificiel (in vitro injections de traceurs) .

Dans ce protocole, nous avons modifié un existant in vitro technique d'électroporation ^7-8 à étiqueter soma et les processus neuronale dans antérograde et rétrograde traçage des expériences utilisant dextran choleratoxine la sous-unité B et tétraméthylrhodamine que les substances de traçage. L'objectif global de ce protocole est de fournir des neuroscientifiques un outil efficace de suivre les modèles de connectivité neuronale entre les différents noyaux du cerveau, tout en profitant des lignées de souris transgéniques et des équipements disponibles optique de base afin d'augmenter la précision de ciblage lors des injections de traceurs. Bien que la méthode de traçage antérograde et rétrograde en utilisanttoxine cholérique et amine dextrane et leurs conjugués marqués par fluorescence respectifs sont pas nouvelles ^9-13 (ce qui est la méthode de l'électroporation, par exemple. Haas et al. ^14), la combinaison d'injections traçantes avec une électroporation dans une préparation in vitro impliquant des blocs de tissu de cerveau est un développement plus récent ^7. Son principal avantage par rapport aux techniques de traçage de neurones en utilisant le même type de colorants traceurs dans les animaux vivants est l'intensité de marquage accru, en raison de la plus grande efficacité avec laquelle le colorant est une électroporation repris par les neurones. Un avantage supplémentaire est la période d'incubation de raccourci (obligatoire pour le transport de colorant) et de sa précision accrue cible lors de l'injection du traceur, parce que l'expérimentateur a le contrôle visuel sur la zone cible de l'injection. Ce dernier signifie aussi qu'aucun équipement stéréotaxique coûteux est nécessaire de trouver le noyau ou le cerveau zone d'intérêt.

Pour Addilement augmenter la précision du ciblage, nous avons profité d'une lignée de souris transgénique qui exprime la GFP dans son sous-population glycinergique de neurones ¹⁵ et l'équipement optique de base consistant en un pointeur de 405 nm lunettes de filtrage passe-bande de longueur d'onde et l'appariement laser à main (450 - 700 nm). Ainsi, nous avons réalisé une nouvelle augmentation significative dans le ciblage de précision en identifiant la zone d'injection au travers de son signal fluorescent et en fournissant un moyen plus fin pour contrôler la propagation du colorant dans la zone d'injection à travers l'observation de l'interaction entre le signal de la GFP indigène et le traceur fluorescence. Notre technique permet également de découvrir la fonctionnalité d'un circuit en même temps que sa connectivité en identifiant les neurones inhibiteurs GFP-positives (ou d'autres excitateurs dans des lignées de souris) qui ont été remplis avec le traceur.

En résumé, nous avons amélioré un outil puissant pour étudier neuroscientifique le connectome du cerveau des vertébrés et évaluer til différentes fonctions neuro-anatomiques d'un neurocircuit donné. En utilisant des souris transgéniques avec l'équipement optique peu coûteux et largement disponible, nous avons réussi à augmenter significativement la précision de ciblage de nos injections. En outre, les souris transgéniques nous a permis d'identifier le type de connexions tracées, ce qui a permis la découverte de la fonctionnalité d'un microcircuit inhibitrice dans le tronc cérébral.

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Protocole

1. Génotypage optique

1. optique génotypage des chiots souris

1. Arrivée à l'expression du marqueur fluorescent respectif au moyen d'un pointeur laser de la longueur d'onde d'excitation appropriée (405 nm dans les expériences décrites ici) et des lunettes de filtre de blocage de la longueur d'onde d'excitation correspondant, mais en passant la longueur d'onde d'émission (450 - 700 nm dans les expériences décrites ici) . Dirigez le pointeur laser à l'arrière de la tête ou de la moelle épinière du chiot de la souris (voir la figure 1). Évitez de diriger le laser dans les yeux et une longue exposition de la peau à la lumière laser.

2. optique génotypage des animaux âgés

1. Profondément anesthésier la souris (p14 ans à p138 dans les expériences décrites ici) avec un surdosage de pentobarbital par une injection intrapéritonéale (120 mg / kg de poids corporel). Confirmez anesthésie appropriée en cochant les réflexes de l'animal (pincer brièvement la pointe du ee oreille ou l'une des pattes arrière pour susciter le réflexe de retrait de la patte ou oreille).
2. Remarque: Malgré l'utilisation d'un surdosage de pentobarbital (120 mg / kg de poids corporel) nous nous référons à la procédure d'injection comme «anesthésie profonde" à la place de l'euthanasie, parce que l'animal est idéalement encore vivant (ie son cœur bat encore), lorsque le la chirurgie et la perfusion ne commencent. Ceci assure une perfusion plus efficace des organes internes, y compris le cerveau.
3. Une fois que l'animal ne présente pas de réflexe, retirez soigneusement la peau recouvrant le crâne (figure 2A) en faisant une incision dans la peau qui recouvre l'arrière de la tête et à l'abdomen coupe du crâne. Exposer le crâne découvert à la lumière laser et d'observer la fluorescence à travers les lunettes de filtres comme décrit ci-dessus. Si un signal de GFP positive est observée, passez à l'étape 2, sinon, sacrifier l'animal par décapitation (deuxième / assurant forme d'euthanasie suite à notreRèglements IACUC).

Note: Chez la souris, même plus âgés (> 1 mois) la fluorescence peut être observée à travers les yeux de l'animal.

2. Transcardial Perfusion et préparation cerveau

1. Perfuser transcardiaque avec glacée tampon phosphate salin (PBS; NaCl: 137 mM, KCl: 2,7 mM, KH _{2 PO 4:} 1,76 mM, Na _{2 HPO 4:} 10 mm) à l'aide d'une aiguille de seringue de 30 G pour éliminer en grande partie le sang l'animal.
   1. Tout d'abord, ouvrir avec précaution la cage thoracique avec des ciseaux pointus, puis pousser l'aiguille dans le ventricule gauche du cœur. Commencez le pompage du PBS dans le cœur et l'aorte et immédiatement après cette étape ouvre l'oreillette droite du cœur avec les ciseaux pour permettre au sang de quitter le corps. Remarque: La perfusion prend de 5 à 10 min selon la taille de l'animal.
2. Après exsanguination par perfusion, décapiter l'animal, assurer sa tête avec la broche needles (ou 30 g aiguilles de seringues) en les perçant à travers les orbites dans un plat de préparation et retirer le cerveau du crâne.
   1. Tout d'abord, utiliser des ciseaux bien aiguisés pour couper la peau recouvrant le crâne: faire une petite incision dans le dos de la tête, puis couper le long de la ligne médiane sur la face dorsale de la tête, couper les côtés juste caudale des yeux de l'animal et la coupe enfin dans la direction caudale pour supprimer complètement les volets de la peau à l'arrière de la tête.
   2. Ensuite, répéter le même schéma de coupe pour le crâne lui-même, assurez-vous de retirer les deux cochlées dans le processus, parce que cela va simplifier considérablement le retrait du tronc cérébral à la fin. Après cette procédure, la moitié caudale du cerveau devrait se situer complètement exposé.
   3. Dans l'étape suivante, utiliser une lame de rasoir ou un scalpel pour couper à travers l'ensemble du cerveau antérieur à un angle d'environ 45 ° et environ 2 mm rostrale du cervelet. Scoop sur la moitié avant séparée du cerveau avec abspatule ent.
   4. Utilisez la spatule pour élever la moitié caudale du cerveau à son extrémité rostrale et couper ensuite à travers les nerfs crâniens qui sont encore connectés à la tige du cerveau sur sa face ventrale. Comme un résultat final, la moitié caudale du cerveau, y compris du tronc cérébral doit tomber librement hors du reste de la tête préparés pour animaux.
   5. Retournez la moitié caudale retiré du cerveau pour exposer son côté ventral et une coupe le long du plan coronal juste rostrale (pour les injections de antérograde) ou tout simplement caudale (pour les injections rétrogrades) des "ampoules" ventre situés contenant le corps de trapèze (voir l'étape 2.3).
      1. Toujours utiliser une lame de rasoir ou un scalpel pour la procédure de coupe pour minimiser la mort cellulaire provoquée par le stress mécanique excessive sur le tissu. En tant que résultat final, un explant de cerveau couvrant environ 1 cm de longueur et contenant le complexe olivaire supérieur le long de toutes les autres régions du cerveau aurait été obtenue.

Remarque: Ce protocole illustre la procédure pour une injection de traceur dans le corps de trapèze située dans le tronc cérébral. Adapter l'emplacement et l'orientation des plans de coupe et les sites d'injection selon les besoins. Si les régions du cerveau fluorescence d'intérêt se trouvent assez près de la surface du cerveau, de sorte qu'ils puissent être identifiés et injectés sans couper le cerveau (voir Figure 2B), puis l'étape de coupe coronale peut être omis.

3. Identifier le corps de trapèze comme deux "ampoules" éminents ventraux contenant le noyau ventral du corps de trapèze (VNTB).

Remarque: Pour plus de renseignements concernant l'emplacement anatomique stéréotaxique approximative de ces plans de coupe, voir Franklin & Paxinos, 2008. 78 du Groupe spécial de l'atlas, Bregma ~ -5,7 mm montre le noyau médial du corps de trapèze (= MNTB) étiqueté comme "Tz ». Panneau 69 montre le noyau ventral de la bo de trapèzedy (VNTB) étiqueté comme "MVPO" (de noyau periolivary medioventral) ^19.

3. antérograde / rétrograde Tracing

Remarque: Effectuer toutes les procédures suivantes à la température ambiante (25 ° C).

1. Après la coupe, placer l'expiant du tronc cérébral dans un plat de préparation contenant oxygéné (95% O _2, CO ₂ 5%) dissection solution (NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl _2: 1 mM, CaCl _2: 0,1 mM, glucose : 25 mM, NaH ₂ PO _4: 1,25 mM, NaHCO _3: 25 mM, de l'acide ascorbique: 0,4 mM, myo-inositol: 3 mM, acide pyruvique: 2 mM), en le fixant avec 30 g aiguilles de seringue. Assurez-vous que la zone d'injection est orientée vers le haut.
2. Tirer pipettes d'injection à partir de verre de borosilicate et de les remplir avec l'une des trois solutions suivantes: a) une solution à 1,0 mg / ml de toxine cholérique sous-unité b conjugué à un fluorophore Alexa 555 dans du PBS ^{_{12 à 13}} (principalement utilisé pour le transport rétrograde), b ) une -d 1%ilution salée à 0,9% de dextran tétraméthylrhodamine 555 (3.000 MW, principalement utilisé pour le transport rétrograde) ou c) une dilution à 1% dans une solution saline à 0,9% de 10.000 MW dextran-TRITC 555 (principalement utilisé pour le transport antérograde).
   1. Veiller à ce que des résistances gamme de pipettes d'injection entre 2,5 et 3,5 MOhm et qu'ils sont fabriqués dans 3 - 4 cycles de traction. Pour les expériences décrites ici, faire cela par un algorithme tirant pré-programmé sur l'extracteur de la pipette.
3. Eclairer l'explantation de cerveau à l'aide d'un pointeur laser monté statiquement de la longueur d'onde appropriée (point n ° 2 sur la figure 3A; 405 nm de longueur d'onde dans les expériences décrites ici). Utiliser le pointeur laser en tant que guide pour les injections, et diriger le faisceau laser au niveau du noyau du cerveau marqué par fluorescence ou des cellules d'intérêt qui sera injecté.
4. Trouvez et observer la zone de cible éclairée par le biais d'un microscope binoculaire, tout en portant les lunettes de filtres compatibles (450 - 700 nm filtre passe-bande dans les expériences décrites ici). Insérez l'électrode d'injection par l'intermédiaire du micromanipulateur dans la zone d'intérêt.
5. Injecter la substance de traceur. Les injections se composent de 2 - 10 impulsions de pression à 15 psi pendant 50 ms chacune, au moyen d'un dispositif d'injection sous pression, dirigé perpendiculairement à la région d'intérêt (ROI) dans la même section du cerveau. Administrer chaque impulsion de pression à des intervalles de 10 à 15 secondes pour permettre au colorant de se propager.
6. Dans le cas des injections de tétraméthylrhodamine (TRITC), stimuler électriquement en outre à améliorer l'absorption du colorant par électroporation avec l'électrode placée dans la zone d'intérêt de cerveau (MNTB VNTB et dans les expériences décrites ici).
   1. Utilisation 8 impulsions TTL de 8 Volts pendant 50 ms à 50 ms, des intervalles interimpulsions entraînés par un stimulateur et amplifiés à 55 V avec une unité d'isolation de stimulation (éléments de n ° 7 et 9 sur la figure 3B). Utilisez 10 - 20 répétitions de ce protocole, adminisnominatives sur plusieurs minutes ^7,8. Assurez-vous à la masse l'électrode correctement - le fil de mise à la terre doit être connecté à la solution de bain!
7. Vérifiez pour le succès de l'injection. Depuis un traceur fluorescent à une longueur d'onde d'émission plus longue est également émettre un signal fluorescent lors de l'excitation de laser avec des longueurs d'onde plus courtes, vérifier visuellement pour l'absorption de colorant / propager dans la zone cible injecté tout en éclairant la surface avec le laser et l'observation à travers des lunettes filtrantes.

4. Incubation

1. Après l'injection, incuber les tronc cérébral dans le liquide céphalo-rachidien artificiel oxygénée (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl _2: 1 mM, CaCl _2: 2 mM, glucose: 25 mM, NaH ₂ PO _4: 1,25 mM, NaHCO _3: 25 mM, de l'acide ascorbique: 0,4 mM, myo-inositol: 3 mM, acide pyruvique: 2 mM, barbotage avec 95% de O ₂ - 5% CO ₂₎ à température ambiante (TA, 25 ° C) pendant 1 - 4 h, tandis quele colorant est transporté. Bubble la solution au cours de la période d'incubation entier.
2. Par la suite, les transférer tronc cérébral dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) dissous dans du PBS (environ 100 ml;. PH 7 pour le mélange PFA / PBS) et incuber à 4 ° C pour permettre post-fixation pendant une nuit (O / N).

5. tissus tranchage et de montage

1. Le lendemain, laver le tronc cérébral trois fois dans du PBS (5 min pour chaque étape de lavage), le couvrir de 4% de gélose, puis les couper en 50 - 80 um d'épaisses tranches sur une vibratome. Tranches de montage en utilisant un milieu de montage sur une lame de verre, et lamelle.
2. Eventuellement, étiqueter les sections avec Nissl fluorescente pendant 25 min (par exemple bleu Nissl à une dilution de 1: 100 dans AB médias).
   1. Pour préparer AB médias, mélanger 250 ml de 0,2 M de tampon phosphate (PB; 51 mM de KH ₂ PO _4, 150 mM de Na ₂ HPO _4), 15 ml de NaCl 5 M, 15 ml 10% de Triton-X, 220 ml ddH ₂ O et 5 g d'albumine de sérum bovin.
   2. Preceet de réussir l'étape de marquage par Nissl 3 étapes de lavage dans du PBS (10 minutes chacun).

Remarque: Dans les cas où des sections plus épaisses doivent être montés et analysé (dans les expériences décrites ici ces tranches étaient 100 - 500 microns d'épaisseur pour préserver connexions axonales plus grandes distances), la technique peut être combiné avec compensation de tissu. Nous avons trouvé le ClearT2 ^{12 à 20} soit un succès. Quand une étape de compensation de tissu est inclus, l'exécuter avant de monter les sections.

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Résultats

Figures 1 et 2 montrent comment le pointeur laser et lunettes laser peuvent être utilisés pour le génotypage rapide et peu coûteuse GFP animaux positifs d'une portée. Dans les cas de jeunes souriceaux, la technique peut être utilisée pour identifier de manière non invasive l'étiquette de la GFP dans le cerveau de l'animal à travers le crâne et la peau sus-jacente (figure 1A - D). Fluorescence émise peut être vu à travers la peau et le crâne des souriceaux au m...

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Discussion

A force générale in vitro traceur électroporation, par opposition aux études in vivo de traçage, est qu'il donne aux chercheurs un meilleur accès à la zone du cerveau d'intérêt et, par conséquent, ne comporte pas stéréotaxique coûteuse (et souvent électrophysiologique) équipement. En outre, la période de survie requis pour les explants de cerveau couvre seulement quelques heures (1 - 4) au lieu des jours, voire des semaines dans le cas d'in vivo injections de traceu...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.
Potassium chloride		P9333
Potassium phosphate monobasic		P5655
Sodium phosphate di-basic		S907
Magnesium chloride		M2670
Calcium chloride		C5080
Glucose		G7528
Sodium bicarbonate		S6297
Ascorbic acid		A4544
Myo-inositol		I5125
Sodium pyruvate		P2256
Bovine serum albumine		A2153	optional, for additional (immuno)histochemistry
Triton-X-100		X100	optional, for additional (immuno)histochemistry
Poly(ethylene glycol), 8000 MW		P2139	optional, for brain clearing
Formamide	Fisher Scientific	F84	optional, for brain clearing
Choleratoxin subunit-b	Molecular Probes	C-34776 (Alexa 555)
Dextrane tetramethyl-rhodamine	Molecular Probes	D-7162 (Alexa 555)
Fluorescent Nissl	Invitrogen	N-21479 (blue)	optional
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	SF93
Agarose	Invitrogen	16520
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Pentobarbi-tal	Vortech Pharmaceuticals	Fatal-Plus
Borosilicate glass filaments	Harvard Apparatus	G150F-10
Pipette puller	Zeitz Instruments, Germany	DMZ Universal Puller
Perfusion setup	Custom-made
Laser pointer	laserpointerpro.com, Hong Kong	HK-88007294 (405 nm)
Filter/safety goggles	Dragon Lasers, China	LSG09 (band-pass 450-700 nm)
Bionocular microscope	Wild Heerbrugg, Switzerland	Wild M3	Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)
Picospritzer	Parker Instruments	Picospritzer III
PC with installed MC Stimulus software	Multi Channel Sys-tems, Germany (software)
2-channel stimulator	Multi Channel Sys-tems, Germany	STG-1002
Stimulation isolation unit	A.M.P.I., Israel	Iso-Flex
Micromanipulator	Narishige, Japan	YOU-1
Vibratome	Leica, Germany	VT1000S