Neuronal Tracing en explantes cerebrales guiadas por láser

Resumen

Describimos una técnica para etiquetar las neuronas y sus procesos a través de anterógrada o retrógrada trazadores inyecciones en núcleos cerebrales utilizando una preparación in vitro. Hemos modificado un método existente de i n vitro electroporación trazador mediante el aprovechamiento de la etiqueta fluorescente mutantes de ratón y equipo óptico básica con el fin de aumentar la precisión de etiquetado.

Resumen

Se presenta una técnica que combina un protocolo de inyección vitro trazador en, que utiliza una serie de pulsos eléctricos y de presión para aumentar la absorción de colorante a través de la electroporación en explantes cerebrales con iluminación láser específica y que emparejan gafas de filtro durante el procedimiento. La técnica descrita de electroporación in vitro por sí mismo rendimientos relativamente buen control visual para que apuntan a ciertas áreas del cerebro. Al combinar con excitación láser de marcadores genéticos fluorescentes y su lectura a través de gafas de filtro de banda de paso, que puede recoger las emisiones de las marcadas genéticamente células / núcleos y el tinte de rastreo fluorescente, un investigador puede aumentar considerablemente la precisión de las inyecciones encontrando el área de interés y el control para el tinte de difusión / absorción en la zona de inyección de forma mucho más eficiente. Además, la técnica de iluminación láser permite estudiar la funcionalidad de un neurocircuit propuesta por provIding información sobre el tipo de neuronas que se proyectan a una cierta área en casos en que la expresión de GFP está relacionada con el tipo de transmisor expresada por una subpoblación de neuronas.

Introducción

Con el fin de definir un cierto (micro) circuito neuronal, hay que empezar por encontrar los diversos participantes de dicho circuito, y su patrón de conexión. Desde la publicación de Waller sobre neurofiber rastreo a través lesioning ¹ una gran variedad de técnicas de rastreo neuroanatómicas ha sido establecida. Algunas de estas técnicas se pueden aplicar en el tejido fijado post mortem ^2-4, otros se basan en el transporte activo del colorante en neuronas vivas, como descubierto en 1971 ^6.5. Este último puede subdividirse en dos grupos que discriminan entre los métodos que se aprovechan de retrógrado activo (a partir de la zona de inyección a la fuente de una proyección dada, es decir. La somata de las neuronas que se proyectan hacia dicha zona) y anterógrada activo (desde el inyectada área a la diana de una proyección dada, es decir. las proyecciones axonales y los terminales axonales de las neuronas marcadas) de transporte. También, en algunos casos tramaterial de cer se inyecta en animales vivos que luego sobreviven a la inyección por varios días o semanas (en inyecciones de trazadores vivo), mientras que en otros casos se inyectan cerebros explantadas e incubar durante varias horas después de la inyección en el líquido cefalorraquídeo artificial (in vitro inyecciones de trazadores) .

En este protocolo se modificó una existente en la técnica de electroporación in vitro ^7.8 para etiquetar somata y procesos neuronal en anterógrada y retrógrada rastreo experimentos utilizando dextrano choleratoxin subunidad-b y tetrametilrodamina como las sustancias de rastreo. El objetivo general de este protocolo es proporcionar neurocientíficos con una herramienta eficiente para rastrear los patrones de conectividad neuronal entre los diferentes núcleos del cerebro, mientras que el aprovechamiento de líneas de ratones transgénicos disponibles y equipos ópticos básica con el fin de aumentar la precisión de la orientación durante las inyecciones de trazadores. Aunque el método de anterógrada y rastreo retrógrado utilizandocholeratoxin y la amina dextrano y sus respectivos conjugados marcados con fluorescencia no es ^NUEVO 9-13 (como es el método de electroporación, por ejemplo. Haas et al. ^14), la combinación de las inyecciones de trazadores con la electroporación en una preparación in vitro que implica bloques de tejido cerebral es un desarrollo más reciente ^7. Su principal ventaja sobre las técnicas de rastreo neuronales utilizando el mismo tipo de colorantes trazadores de animales vivos es la mayor intensidad de etiquetado, debido a la mayor eficiencia con la que el colorante a electroporación está siendo tomada por las neuronas. Una ventaja adicional es el período acortado de incubación (requerido para el transporte de colorante) y su mayor precisión de destino durante la inyección del marcador, porque el experimentador tiene el control visual sobre el área objetivo de la inyección. Este último también significa que no se requiere equipo caro estereotáctica para encontrar el área núcleo o el cerebro de interés.

Para adinalmente aumentar precisión de la focalización, nos aprovechamos de una línea de ratón transgénico, que expresa GFP en su subpoblación glicinérgica de neuronas ¹⁵ y equipos ópticos básicos que consisten en un puntero láser de mano de 405 nm gafas de filtro de longitud de onda y la congruencia de banda de paso (450 - 700 nm). De este modo, logramos un mayor aumento significativo en la precisión de la focalización mediante la identificación de la zona de inyección a través de su señal fluorescente y proporcionando una manera más fina para controlar la propagación de colorante dentro del área de inyección a través de la observación de la interacción entre la señal de GFP indígena y el trazador fluorescencia. Nuestra técnica también permite descubrir la funcionalidad de un circuito junto con su conectividad mediante la identificación de las neuronas inhibitorias GFP-positivas (o excitatorio en otras líneas de ratón) que se llena con el trazador.

En resumen, hemos mejorado aún más una poderosa herramienta neurocientífica para estudiar el conectoma del cerebro de los vertebrados y evaluar tque diferentes características neuroanatómicas de un neurocircuit dado. Mediante el uso de ratones transgénicos, junto con equipos ópticos de bajo costo y ampliamente disponible pudimos aumentar significativamente la precisión de la focalización de nuestras inyecciones. Además, los ratones transgénicos nos permitió identificar el tipo de las conexiones trazadas, lo que ayudó descubrir la funcionalidad de un microcircuito inhibitorio en el tronco cerebral auditivo.

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Protocolo

1. Genotipado óptico

1. óptico Genotipado de Ratón cachorros

1. Compruebe para la expresión de la respectiva marcador fluorescente usando un puntero de láser de la longitud de onda de excitación apropiada (405 nm en los experimentos descritos aquí) y los correspondientes filtros de gafas que bloquean la longitud de onda de excitación, pero que pasa a la longitud de onda de emisión (450 - 700 nm en los experimentos descritos aquí) . Apunte el puntero láser en la parte posterior de la cabeza o la médula espinal de las crías de ratón (ver Figura 1). Evite que brilla el láser en los ojos y la exposición prolongada de la piel a la luz láser.

2. óptico Genotipado de los animales más viejos

1. Profundamente anestesiar el ratón (p14 edad de p138 en los experimentos descritos aquí) con una sobredosis de pentobarbital a través de una inyección intraperitoneal (120 mg / kg de peso corporal). Confirme la anestesia correcta comprobando los reflejos del animal (pellizcar brevemente la punta del XXe oído o una de las patas traseras para provocar el reflejo de retracción de la oreja o la pierna).
2. Nota: A pesar de la utilización de una sobredosis de pentobarbital (120 mg / kg de peso corporal) nos referimos al proceso de inyección como "anestesia profunda" en lugar de la eutanasia, porque el animal es ideal sigue vivo (es decir, su corazón sigue latiendo), cuando el la cirugía y la perfusión comienzan. Esto asegura una perfusión más eficiente de los órganos internos, incluyendo el cerebro.
3. Una vez que el animal no muestra ningún reflejos, retirar cuidadosamente la piel que recubre el cráneo (Figura 2A) al hacer una incisión en la piel que cubre la parte posterior de la cabeza y de corte a la sección media del cráneo. Exponer el cráneo al descubierto a la luz láser y observar la fluorescencia a través de las gafas de filtro como se describió anteriormente. Si se observa una señal de GFP positivo, continúe con el paso 2, si no es así, sacrificar al animal a través de la decapitación (segundos / garantizar forma de eutanasia siguiendo nuestraReglamentos IACUC).

Nota: En los ratones, incluso mayores (> 1 mes) la fluorescencia se puede observar a través de los ojos del animal.

2. transcardial perfusión y Preparación de cerebro

1. Perfundir transcardially con enfriado con hielo salina tamponada con fosfato (PBS; NaCl: 137 mM, KCl: 2,7 mM, KH ₂ PO _4: 1,76 mM, Na ₂ HPO _4: 10 mM) usando una aguja de jeringa 30 G para eliminar en gran medida la sangre de el animal.
   1. En primer lugar, abrir con cuidado la caja torácica con tijeras afiladas y luego empujar la aguja en el ventrículo izquierdo del corazón. Iniciar el bombeo de la PBS en el corazón y la aorta e inmediatamente después de este paso abrir la aurícula derecha del corazón con las tijeras para permitir que la sangre salga del cuerpo. Nota: Perfusión toma 5 - 10 min, dependiendo del tamaño del animal.
2. Después de desangramiento través de la perfusión, decapitar al animal, asegurar su cabeza con el pin needles (o 30 g agujas de jeringas) por la perforación a través de las cuencas de los ojos en un plato de preparación y retire el cerebro del cráneo.
   1. En primer lugar, utilizar tijeras afiladas para cortar la piel que recubre la calavera: hacer una pequeña incisión en la parte posterior de la cabeza, luego se corta a lo largo de la línea media en la cara dorsal de la cabeza, corte a los lados simplemente caudal de los ojos de los animales y por último corte en la dirección caudal para eliminar completamente el colgajos de piel en la parte posterior de la cabeza.
   2. A continuación, repita el mismo patrón de corte para el propio cráneo, asegúrese de retirar ambas cócleas en el proceso, porque esto va a simplificar significativamente la eliminación de la base del cerebro al final. Después de este procedimiento, la mitad caudal del cerebro mienta completamente expuesta.
   3. En el siguiente paso, utilizar una hoja de afeitar afilada o un escalpelo para cortar a través de todo el cerebro anterior con un ángulo de aproximadamente 45 ° y aproximadamente 2 mm rostral del cerebelo. Saque la mitad delantera separada del cerebro con abespátula ent.
   4. Utilice la espátula para elevar el caudal medio del cerebro en su extremo rostral y posteriormente cortar a través de los nervios craneales que todavía están conectados a la base del cerebro en su lado ventral. Como resultado final, el caudal medio del cerebro incluyendo el tronco cerebral debe caer libremente fuera el resto de la cabeza del animal preparado.
   5. Voltear la mitad caudal eliminado del cerebro para exponer su cara ventral y cortar a lo largo del plano coronal justo rostral (para las inyecciones anterógrada) o simplemente caudal (para las inyecciones retrógradas) de las ventral ubicadas "bombillas" que contienen el cuerpo trapezoide (ver paso 2.3).
      1. Siempre use una hoja de afeitar afilada o un escalpelo para el procedimiento de corte para minimizar la muerte celular causada por la tensión mecánica excesiva sobre el tejido. Como resultado final, debería haber sido obtenido un explante cerebral que abarca alrededor de 1 cm de longitud y que contiene el complejo olivar superior completa a lo largo de otras regiones del cerebro.

Nota: Este protocolo demuestra el procedimiento para una inyección de trazador en el cuerpo trapezoide situado en el tronco cerebral auditivo. Adaptar la ubicación y orientación de los planos de corte y sitios de inyección según sea necesario. Si las regiones del cerebro fluorescentes de interés se encuentran lo suficientemente cerca de la superficie del cerebro, de modo que puedan ser identificados y se inyectan sin cortar el cerebro (véase la Figura 2B), entonces la etapa de corte coronal puede ser omitido.

3. Identificar el cuerpo trapezoide como dos "bombillas" prominentes ventrales contienen el núcleo ventral del cuerpo trapezoide (VNTB).

Nota: Para mayor referencia anatómica sobre la ubicación estereotáctica aproximada de estos planos de corte, consulte Franklin & Paxinos, 2008. Panel 78 del atlas, Bregma ~ -5,7 mm muestra el núcleo medial del cuerpo trapezoide (= MNTB) etiquetados como "Tz ". Panel 69 muestra el núcleo ventral de la bo trapezoidedy (VNTB) etiquetados como "MVPO" (núcleo periolivary medioventral) ^19.

3. anterógrada / retrógrada Tracing

Nota: Realice todos los procedimientos siguientes a RT (25 ° C).

1. Después de cortar, colocar el explante tronco cerebral en un plato preparado que contiene oxigenada (95% O _2, 5% ₂ CO) disección solución (NaCl 125 mM, KCl: 2,5 mM, _MgCl2 1 mM, CaCl _2: 0,1 mM, glucosa : 25 mM, NaH ₂ PO _4: 1,25 mM, _NaHCO3: 25 mM, ácido ascórbico: 0,4 mM, myo-inositol: 3 mM, ácido pirúvico: 2 mM), asegurándola con 30 g agujas de jeringas. Asegúrese de que el área de la inyección está hacia arriba.
2. Tire pipetas de inyección de vidrio de borosilicato y llenarlos con una de las tres soluciones siguientes: a) una solución de 1,0 mg / ml de choleratoxin subunidad b conjugado a un Alexa fluoróforo 555 en PBS ^_12-13 (usado principalmente para el transporte retrógrado), b ) un 1% -dilution en 0,9% de solución salina de tetrametilrodamina dextrano 555 (3000 MW, que se utiliza principalmente para el transporte retrógrado) o c) una -dilution 1% en 0,9% de solución salina de 10.000 MW dextrano TRITC-555 (utilizado principalmente para el transporte anterógrado).
   1. Asegúrese de que las resistencias gama pipeta de inyección de 2,5 a 3,5 MOhm y que se fabrican en 3 - 4 ciclos de tracción. Para los experimentos descritos aquí, lograr esto mediante la selección de un algoritmo preprogramado tirando del tirador de pipeta.
3. Iluminar el explante cerebro usando un puntero láser montado estáticamente de la longitud de onda apropiada (artículo Nº 2 en la Figura 3A; 405 nm de longitud de onda en los experimentos descritos aquí). Utilice el puntero láser como guía para las inyecciones, y apuntar el rayo láser hacia el núcleo o células de interés que se inyectan cerebro marcado con fluorescencia.
4. Encuentra y observar la zona diana iluminada a través de un microscopio binocular mientras se usan las gafas de filtro compatibles (450 - 70Filtro de paso de banda 0 nm en los experimentos descritos aquí). Insertar el electrodo de inyección a través de la micromanipulador en el área de interés.
5. Se inyecta la sustancia trazadora. Las inyecciones consisten en 2 - 10 pulsos de presión a 15 psi durante 50 mseg cada uno, utilizando un dispositivo de inyección a presión, dirigida perpendicular a la región de interés (ROI) dentro de la sección cerebro. Administrar cada impulso de presión a intervalos de 10 - 15 segundos para permitir que el colorante se extienda.
6. En el caso de las inyecciones de tetrametilrodamina (TRITC), además, estimular eléctricamente para mejorar la absorción de colorante a través de la electroporación con el electrodo colocado en el área del cerebro de interés (MNTB y VNTB en los experimentos descritos aquí).
   1. Utilice 8 impulsos TTL de 8 voltios durante 50 ms con 50 mseg interpulse intervalos, impulsados ​​por un estimulador y se amplifica a 55 V con una unidad de aislamiento de estimulación (artículos No. 7 y 9 en la Figura 3B). Utilice 10 - 20 repeticiones de este protocolo, administered lo largo de varios minutos ^7,8. Asegúrese de conectar a tierra el electrodo correctamente - el cable de tierra se debe conectar a la solución del baño!
7. Compruebe para el éxito de la inyección. Puesto que un trazador fluorescente con una longitud de onda de emisión más largo también está emitiendo una señal fluorescente tras la excitación láser con longitudes de onda más cortas, comprobar visualmente para la absorción de colorante / extendido en el área objetivo inyectado mientras ilumina la zona con el láser y observando a través de las gafas de filtro.

4. Incubación

1. Después de la inyección, se incuban las brainstems en el fluido cerebroespinal artificial oxigenado (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, _MgCl 2: 1 mM, CaCl _2: 2 mM, glucosa: 25 mM, NaH ₂ PO _4: 1,25 mM, NaHCO _3: 25 mM, ácido ascórbico: 0,4 mM, myo-inositol: 3 mM, ácido pirúvico: 2 mM, burbujeado con 95% O ₂ - 5% de CO ₂₎ a temperatura ambiente (RT, 25 ° C) durante 1 - 4 horas, mientras queel colorante está siendo transportado. Burbuja la solución durante todo el período de incubación.
2. Posteriormente, transferir los brainstems en 4% de paraformaldehído (PFA) disuelto en PBS (aproximadamente 100 ml;. PH 7 para la mezcla de PFA / PBS) y se incuban a 4 ° C para permitir la posterior a la fijación durante la noche (O / N).

5. Tejido rebanar y montaje

1. El día siguiente, lavar el tronco cerebral tres veces en PBS (5 min para cada etapa de lavado), se cubre en 4% de agar y luego se corta en 50 - 80 micras rodajas gruesas en un vibratome. Rebanadas de montaje utilizando un medio de montaje en un portaobjetos de vidrio, y cubreobjetos.
2. Opcionalmente, etiquetar las secciones con Nissl fluorescente para 25 min (por ejemplo azul Nissl en una dilución 1: 100 en AB medios de comunicación).
   1. Para preparar AB medios de comunicación, mezclar 250 ml de tampón fosfato 0,2 M (PB; 51 mM KH _{2 PO 4,} 150 mM Na ₂ HPO _4), 15 ml M NaCl 5, 15 ml 10% de Triton-X, 220 ml ddH ₂ O y 5 g de albúmina de suero bovino.
   2. Precede y tener éxito la etapa de marcaje Nissl por 3 etapas de lavado en PBS (10 minutos cada uno).

Nota: En los casos en que las secciones más gruesas necesitan ser montados y analizados (en los experimentos descritos aquí esas rebanadas eran 100 - 500 micras de espesor para preservar conexiones axonales en distancias más grandes), la técnica se puede combinar con la compensación de los tejidos. Encontramos el ClearT2 ¹² tenga éxito ^20. Cuando se incluye un paso de compensación de tejidos, realizarlo antes de montar las secciones.

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Resultados

Las figuras 1 y 2 muestran como el puntero láser y gafas láser se puede utilizar para determinar el genotipo de forma rápida y económica animales positivos GFP de una camada. En los casos de los cachorros de ratón, la técnica se puede utilizar para identificar de forma no invasiva etiqueta GFP en los cerebros de los animales a través del cráneo y la piel suprayacente (Figura 1A - D). Fluorescencia emitida se puede ver a través de la piel y el cráneo de crías ...

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Discusión

Una fuerza general de la electroporación in vitro trazador, a diferencia de los estudios in vivo de rastreo, es que se da a los investigadores un mejor acceso a la zona del cerebro de interés y por lo tanto, no implica estereotáctica caro (y, a menudo electrofisiológico) equipo. Además, el período de supervivencia necesario para los explantes cerebrales se extiende sólo unas pocas horas (1 - 4) en lugar de días o incluso semanas en el caso de in vivo inyecciones de trazador (ver una re...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.
Potassium chloride		P9333
Potassium phosphate monobasic		P5655
Sodium phosphate di-basic		S907
Magnesium chloride		M2670
Calcium chloride		C5080
Glucose		G7528
Sodium bicarbonate		S6297
Ascorbic acid		A4544
Myo-inositol		I5125
Sodium pyruvate		P2256
Bovine serum albumine		A2153	optional, for additional (immuno)histochemistry
Triton-X-100		X100	optional, for additional (immuno)histochemistry
Poly(ethylene glycol), 8000 MW		P2139	optional, for brain clearing
Formamide	Fisher Scientific	F84	optional, for brain clearing
Choleratoxin subunit-b	Molecular Probes	C-34776 (Alexa 555)
Dextrane tetramethyl-rhodamine	Molecular Probes	D-7162 (Alexa 555)
Fluorescent Nissl	Invitrogen	N-21479 (blue)	optional
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	SF93
Agarose	Invitrogen	16520
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Pentobarbi-tal	Vortech Pharmaceuticals	Fatal-Plus
Borosilicate glass filaments	Harvard Apparatus	G150F-10
Pipette puller	Zeitz Instruments, Germany	DMZ Universal Puller
Perfusion setup	Custom-made
Laser pointer	laserpointerpro.com, Hong Kong	HK-88007294 (405 nm)
Filter/safety goggles	Dragon Lasers, China	LSG09 (band-pass 450-700 nm)
Bionocular microscope	Wild Heerbrugg, Switzerland	Wild M3	Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)
Picospritzer	Parker Instruments	Picospritzer III
PC with installed MC Stimulus software	Multi Channel Sys-tems, Germany (software)
2-channel stimulator	Multi Channel Sys-tems, Germany	STG-1002
Stimulation isolation unit	A.M.P.I., Israel	Iso-Flex
Micromanipulator	Narishige, Japan	YOU-1
Vibratome	Leica, Germany	VT1000S