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要約

我々は、in vitroでの調製物を用いて脳核に順行性または逆行性トレーサー注射を介して、神経細胞とそのプロセスを標識する技術が記載されています。我々 は 、nラベリング精度を高めるために、蛍光標識されたマウスの変異体および基本光学機器を利用して、トレーサーエレクトロ体 ​​外 I既存の方法を変更しました。

要約

私たちは、処置中に対象となるレーザ照射と一致するフィルターゴーグルと脳の外植片にエレクトロポレーションを介して色素の取り込みを増加させるために、電気的および圧力一連のパルスを使用してin vitroでのトレーサー注入プロトコルを組み合わせた手法を提示します。それ自体でのin vitroエレクトロポレーションの記載された技術は、脳の特定の領域をターゲットするための比較的良好な視覚的なコントロールが得られます。レーザー蛍光遺伝子マーカーの励起とその読み出しバンド通過フィルタゴーグルを通して、遺伝的に標識された細胞/核と蛍光トレース色素の排出量を拾うことができ、研究者は、実質的に注射の精度を向上させることができるとそれを組み合わせることで関心領域を見つけ、はるかに効率的に注入領域における染料拡散/取り込みを制御することによって。また、レーザー照射技術はPROVによって与えneurocircuitの機能を研究することを可能にしますGFP発現は、神経細胞の亜集団によって発現される送信機の種類にリンクされている場合に、特定の領域に突出した神経細胞のタイプに関する情報をiding。

概要

特定の神経細胞（マイクロ）回路を定義するためには、言った回路、及びその接続パターンの多様な参加者を見つけることによって開始する必要があります。以来lesioning 1を介して神経解剖学的トレーシング技術の多種多様なトレースneurofiberについてウォーラーの出版物は、確立されています。これらの技術のいくつかは、1971 5-6の発見として、他は、生きたニューロン中の染料の能動輸送に依存して、固定された組織の死後2-4に適用することができます。後者はさらに、（与えられた投影の源 、 すなわちへの注入領域から。地域請求する突出しているニューロンの細胞体）アクティブな逆行性の利点を活かした方法とを区別する2つのグループに細分化することができ、アクティブな順行性（注入からの指定された投影の対象の領域、 すなわち軸索投射および標識された神経細胞の軸索端末）輸送。また、場合によっては、TRACER材料は、他の例では、外植脳が注入されている間、（ 生体内のトレーサー注射で ）数日または数週間の注射を生き残るためには、人工脳脊髄液中に注入した後、数時間インキュベート生きた動物に注入された（in vitroでのトレーサー注射を） 。

このプロトコルでは、我々 は 、in vitroエレクトロポレーション技術7-8に 、既存のトレース物質としてコレラトキシンサブユニット-Bおよびテトラメチルデキストランを使用して、順行と逆行追跡実験で、神経細胞体とプロセスにラベルを付けるように変更。このプロトコルの全体的な目標は、トレーサー注射の間に精度を標的に増加させるために使用可能なトランスジェニックマウス系統と基本光学機器を利用しながら、異なる脳核の間の神経接続のパターンを追跡するための効率的なツールを使用して神経科学を​​提供することです。順行と逆行トレースを使用する方法が、コレラ毒素およびデキストランアミンおよびそれらのそれぞれの蛍光標識複合体は、（ 例えば 、エレクトロポレーションの方法であるとして。ハースら 14）新しい9-13ではないが、脳組織のブロックを含むin vitroでの準備でエレクトロポレーションとトレーサー注射の組み合わせより最近の開発7です。生きた動物でのトレーサー染料の同じタイプを使用して、神経トレーシング技術上の主な利点があるため、染料がエレクトロニューロンによって取り込まされていると、より高い効率の増加標識強度です。実験者は、注入の対象領域上の視覚的制御を持っているので、追加の利点は、トレーサ注入中（染料の輸送に必要）を短く潜伏期間であり、その増加目標精度。後者はまた、高価な定位装置は、関心の核または脳の領域を見つけるために必要とされないことを意味します。

ADDIへtionally精度をターゲットに増加、我々は、ニューロン15と405 nmの波長と一致するバンドパスフィルタゴーグルのハンドヘルドレーザポインタ（450からなる基本的な光学機器のそのグリシン部分集団でGFPを発現するトランスジェニックマウス系統、利用しました- 700 nm）で。したがって、我々は、蛍光シグナルを介して注入領域を識別することによって精度を標的にし、土着のGFPシグナルとトレーサーとの間の相互作用の観察を通して注入領域内の色素の広がりを制御するための微細な方法を提供することによって、かなりの更なる増加を達成し蛍光。私たちの技術は、トレーサーを充填したもの（他のマウス系統または興奮）GFP陽性抑制性ニューロンを識別することにより、その接続性とともに、回路の機能性を明らかにすることができます。

要約すると、我々はさらに脊椎動物の脳のコネクトームを研究し、Tを評価するための強力な神経科学のツールを強化しました彼与えられたneurocircuitの異なる神経解剖学的特徴。安価で広く入手可能な光学機器と一緒にトランスジェニックマウスを使用することにより、我々は大幅に私たちの注射のターゲットと精度を高めることができました。さらに、トランスジェニックマウスは、聴覚脳幹における阻害マイクロ回路の機能を明らかに役立っている、私たちは、トレース接続の種類を識別することができました。

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プロトコル

1.オプティカルジェノタイピング

マウス子犬の1光学ジェノタイピング

  1. 適切な励起波長のレーザポインタを使用してそれぞれの蛍光マーカーの発現を確認する（ここで説明した実験で405 nm）で励起波長を遮断するフィルタ眼鏡を対応するが、発光波長を通過させる（450 - ここで説明した実験で700 nm）の。ヘッドやマウスの仔の脊髄の背面にレーザーポインターを点（ 図1を参照）。目とレーザー光に対する皮膚の長い露出にレーザーを照射しないでください。

古い動物の2光ジェノタイピング

  1. 深く腹腔内注射（120ミリグラム/ kg体重）を介して、ペントバルビタールの過剰摂取と（ここで説明した実験ではP138歳P14）は、マウスを麻酔。動物の反射神経をチェックして、適切な麻酔を確認してください（簡単番目の先端をつまみます電子耳や耳や足の後退反射を誘発するための後ろ足の1つ）。
  2. 注意：動物はまだ理想的に生きているので、ペントバルビタールの過剰摂取の使用にもかかわらず（120ミリグラム/ kg体重）我々は、代わりに安楽死の「深麻酔」と注射手順を参照してください（ すなわち 、その心臓はまだ鼓動している）、時手術と灌流が開始されます。これは、脳を含む内臓のより効率的な灌流を保証します。
  3. 動物は任意の反射を示していないならば、慎重に頭の後ろをカバーする皮膚の切開を作り、頭蓋骨の中央部に切断することにより頭蓋骨（ 図2A）を覆う皮膚を削除します。レーザー光に覆われていない頭蓋骨を露出させ、上記のようにフィルターゴーグルを通して蛍光を観察します。 GFP陽性シグナルが観察された場合、（第2 /私たちの次の安楽死の形を確保断頭を通じて動物を犠牲にし、いない場合は、ステップ2に進んでくださいIACUC規制）。

注：さらに古いマウスでは（> 1ヶ月）の蛍光は、動物の目を通して観察することができます。

2. Transcardial灌流と脳の準備

  1. 大部分から血液を除去するために、30gの注射針を使用して、氷冷リン酸緩衝食塩水（10mMの137 mMの、塩化カリウム：2.7ミリモル、KH 2 PO 4：1.76ミリモル、のNa 2 HPO 4のNaCl PBS）で経潅流動物。
    1. まず、慎重に鋭いハサミで胸郭を開き、心臓の左心室に針を押し込みます。心臓や大動脈にPBSをポンプ起動し、すぐにこのステップが身体を終了し、血液を可能にするために、はさみで心臓の右心房を開き、次の。注：灌流5かかり - 動物のサイズに応じて10分。
  2. 灌流を介して放血した後、動物を刎ねる、ピンnにその頭を固定eedles（または30のG注射針）準備皿に目のソケットを介してそれらを貫通し、頭蓋骨から脳を削除することもできます。
    1. ちょうど尾側動物の眼の側面にカットし、頭部の背側の正中線に沿って切断し、頭の後ろに小さな切開を行います。まず、頭蓋骨を重ねる肌を遮断するために、鋭いハサミを使用最後に、完全に頭の後ろの皮膚のフラップを除去するために、尾方向に切断。
    2. 次に、頭蓋骨自体の同じカッティングパターンを繰り返し、これはかなり最終的に脳幹の除去を簡素化しますので、その過程で両方の蝸牛を取り外してください。この手順の後、脳の尾半分が完全に露出あるべきです。
    3. 次のステップでは、小脳から約45°〜約2mmの吻側の角度で全前脳を切断するために鋭利なカミソリの刃またはメスを使用しています。 ABと脳の分離前半をかき出しますENTへら。
    4. その吻側端に脳の尾半分を高め、その後、まだ腹側脳幹に接続されている脳神経を切断するために、スパチュラを使用します。最終結果として、脳幹を含む脳の尾の半分は、準備された動物の頭の残りの部分から自由落下する必要があります。
    5. （ステップを参照してくださいその腹側を露出するために、脳の除去された尾の半分を反転し、台形体を含む腹側に位置する「電球」の（逆行注射用）ちょうど吻側（順行注射用）またはちょうど尾側前頭面に沿って切断2.3）。
      1. 常に組織に過度の機械的ストレスによる細胞死を最小限にするために切断手順のために鋭利なカミソリの刃またはメスを使用しています。最終結果として、長さが約1cmにまたがるし、他の脳領域に沿って完全な上オリーブ複合体を含む脳の外植が得られているはずです。

注：このプロトコルは、聴性脳幹に位置台形本体内にトレーサーを注入するための手順を示しています。必要に応じて、切断面と注射部位の位置と向きを調整します。それらが同定され、脳を切断せずに注入することができるように、脳表面に十分に近い関心嘘の蛍光脳領域（ 図2Bを参照）場合、冠状切断工程を省略することができます。

  1. 台形体（VNTB）の腹側核を含む二腹目立つ「球根」と台形体を識別します。

注：これらの切断面のおおよその定位位置に関する更なる解剖学的参考のため、フランクリン＆Paxinos、2008年アトラスのパネル78、ブレグマ〜-5.7 mmは台形体（= MNTB）の内側核を示しているを参照してくださいTzを」と表示"。パネル69は、台形BOの腹側核を示しています「MVPO」（medioventral periolivary核）19としてラベルDY（VNTB）。

3.順行/逆行トレース

注：RT（25℃）で、次のすべての手順を実行します。

  1. 125 mMの、のKCl：2.5mMの、のMgCl 2を1mM、のCaCl 2：0.1mMのグルコース切断した後、酸素（95％O 2、5％CO 2）解剖溶液（NaClを含む製剤皿に脳幹の外植片を配置：25mMの、のNaH 2 PO 4：1.25ミリモル、のNaHCO 3、25mMのアスコルビン酸：0.4 mMの、ミオイノシトール：3mMの、ピルビン酸：2mm）を、30gの注射針とそれを固定します。注射の面積が上を向いていることを確認します。
  2. ホウケイ酸ガラスから注入ピペットを引き、次の三つの解決策の一つでそれらを埋める：コレラトキシンサブユニットB PBS 12-13でアレクサフルオロフォア555に共役（主に逆行性輸送に使用される）、BのA）1.0 mg / mlのソリューション）1％-d万MWのデキストランTRITC 555の0.9％生理食塩水でのデキストラン（主に逆行性輸送に使用される3000メガワット）テトラメチルローダミン555またはc）1％-dilutionの0.9％生理食塩水でilution（主に）順行輸送に使用されます。
    1. 4引っ張っサイクル - その注入ピペットの抵抗が2.5から3.5オームの範囲であり、それらが3で製造されていることを確認してください。ここに記載される実験のために、予めプログラムされたピペットプラー上でアルゴリズムを引っ張るを選択することによって、これを達成します。
  3. 適切な波長（;ここで説明した実験では、波長405nm、図3Aの項目番号2）の静的に取り付けられたレーザーポインタを使用して、脳の外植片を照らします。注射のためのガイドとしてのレーザーポインタを使用し、注入される蛍光標識された脳核または目的の細胞にレーザー光を目指しています。
  4. 70 - 互換性のあるフィルターゴーグル（450を装着したまま検索し、双眼顕微鏡を通して照射ターゲット領域を観察ここに記載した実験において0nmのバンドパスフィルタ）。関心領域にマイクロマニピュレーターを経由して注入電極を挿入します。
  5. トレーサー物質を注入します。脳切片内の関心領域（ROI）内に垂直に向け圧力噴射装置を用いて、50ミリ秒ごとに、15 psiで10圧力パルス - 注射は2から成ります。拡散する染料を可能にするために15秒 - 10の間隔で各圧力パルスを管理します。
  6. テトラメチルローダミン（TRITC）注射剤の場合には、付加的に（ここで記載した実験でMNTBとVNTB）関心のある脳領域に配置された電極をエレクトロポレーションを介して色素の取り込みを増強するために、電気的に刺激します。
    1. 50ミリ秒パルス間の間隔で50ミリ秒、刺激によって駆動され、刺激分離ユニット（項目7号及び図3Bの 9）で55 Vに増幅するために8ボルトの8 TTLパルスを使用してください。このプロトコルの20回繰り返し、adminis - 10を使用してください数分7,8を介して結。適切に電極を接地していることを確認します - アース線は、浴溶液に接続する必要があります！
  7. 注射の成功のために確認してください。以来長い発光波長を有する蛍光トレーサーはまた、レーザーで領域を照射し、フィルターゴーグルを通して見ながら視覚的に注入された目標領域に色素取り込み/スプレッドをチェックし、より短い波長のレーザー励起により蛍光シグナルを発しています。

4.インキュベーション

  1. 125 mMの、塩化カリウム：2.5 mMの、のMgCl 2：1 mMの、のCaCl 2：2 mMのグルコース：25mMの、のNaH 2 PO 4：1.25 mMの、塩化ナトリウム;注入後、酸素化人工脳脊髄液（ACSFでbrainstemsをインキュベートNaHCO 3、25mMのアスコルビン酸：0.4 mMの、ミオイノシトール：3mMの、ピルビン酸：2mMの、95％のO 2を通気-室温で5％のCO 2）1（RT、25℃） - 4時間、しばらく色素が輸送されています。バブル全体の潜伏期間中にソリューションを提供します。
  2. 一晩（O / N）の後固定を可能にするために4℃でそれをし、インキュベートする;（PFA / PBS混合物のためにpH7の約100ml）で、続いて、PBSに溶解した4％パラホルムアルデヒド（PFA）でbrainstemsを転送します。

5.組織スライスと取り付け

  1. 次の日、PBSで3回（各洗浄工程のために5分に）脳幹を洗って、4％の寒天でそれをカバーして、50にカット - ビブラトーム上の80μmの厚さにスライス。ガラススライド、及びカバーガラスの取り付けメディアを使用してマウントスライス。
  2. 必要に応じて、（：AB培地で100倍希釈で例えば青ニッスル）25分間蛍光ニッスルを持つセクションにラベルを付けます。
    1. 、AB培地を調製0.2 Mリン酸緩衝液250mlを混合する（PB; 51 mMのKH 2 PO 4、150mMののNa 2 HPO 4）、15 mlの5 M NaClを、15 mlの10％のTriton-X、220ミリリットルのddH 2 Oそして5gのウシ血清アルブミン。
    2. PrecePBS中で3回の洗浄工程（10分毎）によるニッスル標識工程をデ、成功。

注意：厚いセクションをマウントして分析する必要がある場合には（そのようなスライスここで説明した実験で100だった - より大きな距離での軸索の接続を維持するために、厚さ500ミクロン）、技術が組織のクリアと組み合わせることができます。我々はClearT2 12が成功した20であることが判明します。組織のクリアステップが含まれている場合には、セクションをマウントする前にそれを行います。

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結果

レーザーポインターとレーザーゴーグルは、迅速かつ安価にリターからのGFP陽性動物の遺伝子型を決定するために使用することができるか1および図2は図 。若いマウスの仔の例では、技術は、非侵襲的に頭蓋骨とその上の皮膚（ - D図1A）を介して動物の脳におけるGFPのラベルを識別するために使用することができます。放射された蛍光は、少なくともア?...

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ディスカッション

、in vivoでのトレースの研究とは対照的に、in vitroでのトレーサーエレクトロポレーションの一般的な強さは、高価な定位（多くの場合、電気生理学）装置を必要としない、それは研究者に、したがって関心との脳領域へのより良いアクセスを与えることです。デキストランアミンとの他のトレーサーの使用に関する詳細なレビューを参照してください（in vivoでのトレー?...

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開示事項

我々は、開示することは何もありません。

謝辞

NIH / NIDCD R01 DCでサポートされている011582.イメージング実験は大学で行ったのコロラドアンシュッツメディカルキャンパス高度な光学顕微鏡コアはNIH / NCRRコロラドCTSIグラント番号UL1 RR025780とロッキーマウンテンNeurlogical障害コアセンター助成NIH P30NS048154によって部分的にサポートされています。ソーク研究所から博士サシャ・デュ・ラックはGLYT2-GFPマウスを提供してくれました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium chlorideSigma-AldrichS7653All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.
Potassium chloride P9333
Potassium phosphate monobasicP5655
Sodium phosphate di-basicS907
Magnesium chlorideM2670
Calcium chlorideC5080
GlucoseG7528
Sodium bicarbonateS6297
Ascorbic acidA4544
Myo-inositolI5125
Sodium pyruvateP2256
Bovine serum albumineA2153optional, for additional (immuno)histochemistry
Triton-X-100X100optional, for additional (immuno)histochemistry
Poly(ethylene glycol), 8000 MWP2139optional, for brain clearing
FormamideFisher ScientificF84optional, for brain clearing
Choleratoxin subunit-bMolecular ProbesC-34776 (Alexa 555) 
Dextrane tetramethyl-rhodamineMolecular ProbesD-7162 (Alexa 555)
Fluorescent NisslInvitrogenN-21479 (blue)optional
ParaformaldehydeFisher ScientificSF93
AgaroseInvitrogen16520
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Pentobarbi-talVortech PharmaceuticalsFatal-Plus 
Borosilicate glass filamentsHarvard ApparatusG150F-10
Pipette pullerZeitz Instruments, GermanyDMZ Universal Puller
Perfusion setupCustom-made
Laser pointer laserpointerpro.com, Hong KongHK-88007294 (405 nm)
Filter/safety gogglesDragon Lasers, ChinaLSG09 (band-pass 450-700 nm)
Bionocular microscope Wild Heerbrugg, SwitzerlandWild M3Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) 
PicospritzerParker InstrumentsPicospritzer III
PC with installed MC Stimulus softwareMulti Channel Sys-tems, Germany (software)
2-channel stimulatorMulti Channel Sys-tems, GermanySTG-1002
Stimulation isolation unitA.M.P.I., IsraelIso-Flex
MicromanipulatorNarishige, JapanYOU-1
VibratomeLeica, GermanyVT1000S

参考文献

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