العزلة والتركيبية تحليل النبات البشرة الدهن البوليستر مونمرات

Summary

Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Abstract

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.

Introduction

النباتات الوعائية تعتمد على طبقات الخلية التي تعمل كحواجز للماء بين الأنسجة النباتية والبيئة الخارجية. هذه الهياكل المرتبطة جدار الخلية محبة للدهون تقيد العدوى المسببة للأمراض وتنظم النقل السلبي من الغازات والماء والمواد الذائبة ويخرجون من الأنسجة النباتية ^1. هذه الحواجز هي بشرة النبات، هيكل synapomorphic فريدة من نوعها للنباتات ^2، ومختلف الحواجز نشر المحتوية على سوبيرين. بشرة طبقة أليف الزيت توليفها من قبل خلايا البشرة وملزمة لهم عبر طبقة pectinaceous على الجانب خارج الخلية من جدار الخلية ^3-5. ذلك يغلف أجهزة جوية الأولية من النباتات العليا، يعمل كواجهة الحيوية بين أنسجة النبات والبيئة.

كوتين، المصفوفة الهيكلية للبشرة، وسوبيرين نوعان من البوليستر glycerolipid غير قابلة للذوبان المرتبطة الشموع المذيبات القابلة للاستخراج ^2،4. هذه ل البوليمروتتكون ipids المشبعة وغير المشبعة مشتقات حمض الدهنية وكلاهما هيكليا ووظيفيا مماثل. ومع ذلك، فهي تمييزها عن الاختلافات المميزة في تكوين وترسيب مواقع كيميائية.

سوبيرين هو البوليستر الأليفاتية تقع داخل جدران الخلايا من بعض الأنسجة الخارجية والداخلية تشكيل الجدار الثانوي. وتشمل الأنسجة Suberized periderms الجذور والدرنات وأوراق الشجر، البشرة الداخلية الجذر، طبقات غلاف البذرة، والجروح تلتئم ^2. على عكس كوتين، والبوليستر سوبيرين يحتوي عادة الكحول، المشبعة وغير المشبعة الأحماض أحادية ثنائي الكربوكسيل، ونسبة كبيرة من أحادية سلسلة طويلة جدا (C≥20).

كوتين هو البوليستر الدهون الأكثر وفرة في النباتات الوعائية ^6، ويتكون من الجلسرين وC16-C18 مشتقات الأحماض الدهنية interesterified، مثل هيدروكسي وهيدروكسي الايبوكسي استبدال الأحماض الدهنية ^4. في حين أن تكوين البوليمرات كوتينيتفاوت بين الأنواع tracheophyte، وأحادية الأولية الأكثر الغالبة هي 10، 16 dihydroxy 16: 0، 18-هيدروكسي-9،10-الايبوكسي 18: 0، و9،10،18-trihydroxy 18: 0 الأحماض الدهنية. وتتألف ومن المثير للاهتمام، ورقة نبات الأرابيدوبسيس ووقف كوتين أساسا من 18: 2 حمض ثنائي الكربوكسيل ^7،8.

البشرة المصنع أيضا تقديم تفاوتا كبيرا في سماكة تتراوح من بضعة نانومتر إلى عدة ميكرومتر ^9. منذ بشرة العزلة هي خطوة شاقة وتستغرق وقتا طويلا، وخاصة بالنسبة البشرة ورقة رقيقة جدا مثل تلك التي من نبات الأرابيدوبسيس thaliana ^8، وقد تم تطوير الأساليب التي تجاوز بشرة العزلة والتحقق من صحة ^7،8. هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لدراسة تكوين مونومر من كوتين في أوراق نبات الأرابيدوبسيس thaliana التي كتبها ميثوكسيد الصوديوم (NaOMe) التحلل -catalyzed واللوني للغاز لاحق / قياس الطيف الكتلي (GC / MS) التحليل. هذا البروتوكول يوفر وسيلة قوية لمعايرة المشاركوقد تم تكييف mposition من البوليستر الدهون النباتية في أنسجة delipidated كلها، ومن البروتوكولات ذكرت سابقا ^7،10،11. عينات الأنسجة كلها هي أول المتجانس وdelipidated شامل، وإزالة الدهون المذيبات للاستخراج بما في ذلك جليدية والشموع epicuticular، والدهون غشاء، وtriacylglycerols. ثم يتم depolymerized خلية بقايا التخصيب الجدار إلى المكونة أحادية استر الميثيل من خلال الصوديوم المحفز ميثوكسيد تحلل الميثانول. يتم استخراج الدهنية استرات الميثيل الحمضية على تحمض، وderivatized للحصول على المقابلة trimethylsilyl أو الاسيتيل المشتقات. بقايا Derivatized متقلبة للغاية، ويمكن مزال من عمود اللوني للغاز عند درجة حرارة معقولة دون تغيير التشكل الهيكلي خلال تحليل GC / MS.

Protocol

ملاحظة: تم تكييف هذا البروتوكول من بونافنتور وآخرون. (2004)، مولينا وآخرون. (2006)، لي وآخرون. (2013) ^7،10،11. وتتلخص الخطوات 1-5 في الشكل 1.

1. مناديل إزالة الشحميات

ملاحظة: شطف دائما عن الأواني الزجاجية وقبعات مع الكلوروفورم، والسماح الجافة تحت غطاء الدخان، وقبل استخدام.

تنبيه: إجراء تجانس الأنسجة وجميع الخطوات نقل المذيبات تحت غطاء الدخان. دائما ارتداء معطف المختبر، والقفازات ونظارات السلامة البداية لتجنب الاتصال المباشر مع المواد الكيميائية وحماية العينات من التلوث.

1. حمام ماء سخن وكتلة الحرارة إلى 85 درجة مئوية.
2. تزن حوالي 0.5 غرام من كل عينة ورقة إلى 20 ملم × 125 ملم اختبار أنابيب زجاجية وزنه قبل مع تترافلوروإيثيلين (PTFE) قبعات المسمار -faced. تشمل أربع مكررات لكل عينة.
3. ضع 2-بروبانول في دورق مخروطي (حوالي 125 مل، 25 مل غرام من عصيدة فيلو). إضافة 2،6 دى ثالثي بوتيل-4-methylphenol (المعروف أيضا باسم hydroxytoluene الأنيسول، BHT) إلى تركيز النهائي من 0.01٪ (ث / ت).
   ملاحظة: إضافة BHT من 5٪ (ث / ت) حل الأسهم في الميثانول (BHT يساعد على التقليل من أكسدة الأحماض الدهنية غير المشبعة).
4. سخن حل 2-بروبانول إلى 85 درجة مئوية في حمام مائي.
5. إضافة 12 مل الساخن 2-بروبانول المذيبات لكل أنبوب عينة والحرارة لمدة 15 دقيقة في 85 درجة مئوية في كتلة الحرارة. هذه الخطوة يثبط نشاط الليباز التي قد أفرج عنه من الخلايا تعطلت.
6. السماح أنابيب يبرد إلى درجة حرارة الغرفة وطحن الأنسجة تماما مع الخالط حتى يتم الحصول على تعليق متجانسة.
7. وضع العينات في شاكر المداري ويهز لمدة 1-2 ساعات في 100 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الغرفة.
8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 x ج وتجاهل طاف.
9. إضافة حجم مساو من 2 بروبانول ويهز لمدة 12 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
10. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 x ج وتجاهل طاف.
11. إضافة 12 مل CHCL _3: CH ₃ OH (2: 1، V / V) لبقايا (25 مل غرام من العينة في المائة) ويهز بين عشية وضحاها في 100 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الغرفة.
12. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 x ج وتجاهل طاف.
13. إضافة 12 مل CHCl _3: CH ₃ OH (1: 2، ت / ت) لبقايا ويهز بين عشية وضحاها في 100 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الغرفة.
14. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 x ج وإزالة المذيب.
15. السماح العينات الجافة تحت غطاء الدخان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
16. الهواء الجاف بقايا ثم ضع في مجفف فراغ على اللامائية CaCl ₂ أو كبريتات _{4 حتى} يتم التوصل إلى وزن ثابت (3-5 أيام).

2. التحلل: تحلل الميثانول مع ميثوكسيد الصوديوم (الشكل 2)

تنبيه: تنفيذ الخطوات 2،3-2،4، 2،7-2،8، 2،10-2،11، 2،13-2،15 و2،17-2،18 تحت غطاء الدخان. دائما ارتداء معطف المختبر، والقفازات ونظارات السلامة البداية.

1. سخن كتلة الحرارة إلى 60 درجة مئوية.
2. تزن أنابيب الاختبار تحتوي على بقايا الجافة (مهمة لمزيد من العمليات الحسابية).
3. إضافة المعايير الداخلية لكل أنبوب: 25 ωL heptadecanoate الميثيل (1 ملغ / مل الأسهم) و 25 ميكرولتر ω-pentadecalactone (1 ملغ / مل الأوراق المالية).
4. إضافة 0.9 مل خلات الميثيل، 1.5 مل ميثوكسيد الصوديوم، و 3.6 مل الميثانول إلى كل أنبوب ولحد منها. بدلا من ذلك، وإعداد مزيج التفاعل مع هذه الكواشف ثلاثة وإضافة قسامات 6 مل لكل عينة.
5. عينات الحرارة لمدة 2 ساعة على 60 درجة مئوية، ودوامة دوريا في 15 دقيقة فترات.
6. السماح عينات يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
7. إضافة 10 مل من ثنائي كلوريد الميثيلين (CH ₂ الكلورين ₂₎ و 1.5 مل من حمض الخليك الجليدي لاستخراج الأحماض الدهنية استرات الميثيل.
8. إضافة محلول ملحي (0.5 M كلوريد الصوديوم) لملء كل أنبوب وغطاء.
9. عينات دوامة لمدة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 ز س.
10. نقل المرحلة العضوية (أقل) لتنظيف أنابيب متوسطة الحجم (16 × 125 ملم أنابيب اختبار الزجاج مع بوليtetrafluoroethylene (PTFE) -faced سقف المسمار).
11. إضافة محلول ملحي (0.5 M كلوريد الصوديوم) لملء كل أنبوب وغطاء.
12. عينات دوامة لمدة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 800 ز س.
13. إزالة مائي (العلوي) مرحلة وكرر الخطوات 2،11-2،12.
14. إزالة جميع مائي (العلوي) المرحلة.
15. إضافة كبريتات الصوديوم اللامائية _(نا 2 _SO 4) إلى مذيب، وكأب الأنابيب، ودوامة لمدة 1 دقيقة. يمكن الآن يقم عينات حتى اليوم التالي. عند هذه النقطة عينات يمكن ترك بين عشية وضحاها تحت غطاء الدخان.
16. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 800 x ج لضغط _نا 2 _SO 4 الملح في القاع.
17. نقل المرحلة العضوية إلى أنبوب المتاح كوب صغير (13 × 100 ملم اختبار أنابيب زجاجية مع تترافلوروإيثيلين (PTFE) -faced سقف المسمار).
18. تتبخر المذيب للجفاف تحت النيتروجين، والشروع في الخطوة اشتقاق. إذا لم تتم معالجتها على الفور، تبخرت تخزين العينات في -20 ° C (يمكن أن يكون عينات لتخزين يسوتو قبل الخطوة التبخر).

3. إعداد المشتقات للاللوني للغاز

تنبيه: تنفيذ الخطوات 3.1.2 و3.1.5 - 3.1.8 تحت غطاء الدخان. دائما ارتداء معطف المختبر، والقفازات ونظارات السلامة البداية.

1. المشتقات Trimethylsilyl
   1. سخن كتلة الحرارة إلى 100 درجة مئوية.
   2. إضافة 100 ميكرولتر من البيريدين و 100 ميكرولتر من BSTFA (N، O البس trimethylsilyl-trifluoroacetamide) إلى كل أنبوب ولحد منها.
   3. عينات الحرارة عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
   4. السماح عينات يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
   5. تتبخر العينات تحت النيتروجين في درجة حرارة الغرفة. تجنب تطبيق الحرارة لعينات، أحادية متقلبة جدا في هذه المرحلة.
   6. إضافة 500 ميكرولتر من 1: 1 (ت / ت) هيبتان: التولوين.
   7. عينات دوامة لمدة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 800 ز س.
   8. إضافة إلى عينات قارورة GC، والشروع في تحليل GC / MS.
2. الاسيتيلالمشتقات
   ملاحظة: للحصول على أستلة، تعديل الخطوات 3.1.1-3.1.3 أعلاه على النحو التالي (لا يظهر في الفيديو)؛ خطوات 3.1.4-3.1.8 هي نفسها:
   1. سخن كتلة الحرارة إلى 60 درجة مئوية.
   2. إضافة 100 ميكرولتر من البيريدين و 100 ميكرولتر من أنهيدريد الخل (AC ₂ O) للأنابيب.
   3. عينات الحرارة 1 ساعة عند 60 ° C.

4. GC / MS تحليل

1. استخدام عمود شعري HP-5 (30 م × 0.25 مم × 0.25 ميكرومتر سماكة الفيلم) أو ما يعادلها (أي.، 5٪ ثنائي الفينيل، 95٪ ثنائي ميثيل polysiloxane). برنامج GC مع تدفق الغاز الناقل الهيليوم وضعت في 1.5 مل / دقيقة ودرجة حرارة الفرن مبرمجة 150-300 درجة مئوية في 3 ° C / دقيقة.
2. استخدام حقن الانقسام (تقسيم نسبة 01:10) وتعيين مطياف الكتلة لفحص وضع أكثر من 40-600 اتحاد المغرب العربي (الإلكترون تأثير التأين).
3. إنشاء جدول تسلسل بما في ذلك المذيبات (فارغة)، WT ومكررات متحولة، كل باستخدام أسلوب التحليل كوتين المشار إليها.
4. تحميل مذيبوقارورة العينة على كاروسيل، إضافة الهكسان إلى قارورة-الشطف حقنة في الاوتوماتيكى إذا لزم الأمر، ويبدأ التسلسل. بعد اكتمال التسلسل، متاحة للجميع العينات مجموع آثار ايون اللوني.

5. تحليل البيانات

1. تحديد أحادية البوليستر الدهون بمقارنة الطيف الكتلي كل الذروة لنشر أطياف الشامل أو من خلال البحث في المكتبة التجارية إن وجدت.
2. لكل الذروة المحددة في مجموع ايون اللوني الحالي، استخدم مرات الاحتفاظ كل منهما للعثور على المناطق على جدول النتائج التكامل من GC / MS البرنامج التكميلي (الشكل 1).
3. لكل مونومر (الأعمدة AB)، إضافة القيم المنطقة وجدت في الجدول التكامل (التكميلي الشكل 1، العمود D) إلى العمود المقابل لكل تكرار نموذج في جدول Excel من أحادية (ملف إضافي 2، والأعمدة CF)، وهو جدول لقياس نبات الأرابيدوبسيسالمشتقات كوتين TMSI. استخدام ملف إضافي 3 إذا كنت على استعداد المشتقات الأسيتيل بدلا من ذلك.
4. إضافة مجالات المعايير الداخلية (IS) إلى الأعمدة IS (HK). بالنسبة لأولئك مونومرات التي لم يتم derivatized، استرات الميثيل وهي الأحماض الدهنية (جوع)، وثنائي الكربوكسيل استرات ميثيل حمض (DCA DMEs)، استخدم 17: 0 FAME (IS1) كما هو لالكمي (خلايا الأرجواني المظللة في الجدول مونومر؛ التكميلي ملفات 2/3). لمونومرات الهيدروكسيلية، بما في ذلك الكحولات الأولية، وحمض الفيرليك والأحماض ω-هيدروكسي، استخدم 15: 0 FAME 15-هيدروكسي (IS2) كما هو الاختيار لتقدير مجمع (خلايا خضراء shadded في الجدول مونومر، وملفات التكميلي 2/3) .
5. إضافة الوزن الجاف ورقة لكل تكرار لأعمدة AX-BA (ملف إضافي 2) أو AQ-AT (ملف إضافي 3)؛ بدلا من ذلك، فحص الأوراق لحساب المساحات السطحية وإضافة قيم منطقة إلى طاولة مونومر للتعبير عن الأحمال مونومر لكل وحدةمساحة السطح.

النتائج

يتم تعيين بروتوكول صفها في هذه المخطوطة إلى تحديد الدهون أحادية البوليستر، والتقليل من المساهمات من الدهون غير كوتين ¹⁰ الشكل 1 يقدم لمحة عامة عن الفحص، والتي تأخذ تماما بين 8 (أي، كوتين أو سوبيرين.) - 10 أيام (من حصاد الأنسجة الأولي إلى الحصول على بيانات GC)، اعتمادا على كيفية عينات طويلة ويترك ليجف.

والمحفزة قاعدة تحلل الميثانول مختارة (الشكل 2) طريقة ليزيل البلمرة البوليستر والتحقق من صحتها من قبل لبذور نبات الأرابيدوبسيس، والتي تحتوي على كل كوتين وسوبيرين. ويتجانس الخليط أولا الأنسجة وdelipidated شامل لإزالة الدهون المذيبات القابلة للاستخراج. العائد بقايا بعد الاستخراج، كنسبة مئوية من الوزن الطازج الأولي، وعادة ما يكون 6٪ لA. thaliana العقيد-0 الأوراق. يتم تجفيفها خلية بقايا التخصيب الجدار في مجفف فراغ ثم depolymerized إلى المكونة أحادية استر الميثيل من قبلالمحفز قاعدة نقل الميثيل. وقد تم اختيار اثنين ساعة الحضانة كما الوقت الحرج اللازم لالتحلل الصحيح واستعادة مكونات البوليستر الدهون. أسفرت مرات حضانة أطول في زيادة في الأحماض 2-هيدروكسي. هذه يحتمل أن تكون مستمدة من الإسفنجية غشاء ^10.

A اللوني نموذجي إذا ثبت نبات الأرابيدوبسيس النوع البري ورقة كوتين في الشكل 3، لO -TMSi المشتقات الأثير (الشكل 3A) ومشتقاتها O -acetyl (الشكل 3B). وقد تم تحديد كل الذروة من خلال المقارنة مع أطياف الشامل من الأدب ^7،8 وقاعدة بيانات عامة يظهر ^12. لدينا بروتوكول الفيديو كيفية تحضير مشتقات TMSI، ولكن يمكن بدلا من ذلك أن عينات الأسيتيل إلى derivatize مجموعات الهيدروكسيل. المشتقات Silylated جيدة لأغراض تحديد الهوية لأنها تعطي التشخيص أطياف الكتلة. ومع ذلك، المشتقات الأسيتيل هي أكثر استقرارا وبديل جيد لsilylationوقد تم تحديد أحادية كانت يوما ^10. للمساعدة في تنفيذ هذا البروتوكول في المختبرات التي لا تملك إلا GC بالإضافة إلى كاشف اللهب التأين (ااا)، GC / ااا آثار الموافق المشتقات الأسيتيل من WT أحادية رقة كوتين وإلى سلسلة homolog المعايير استر الأحماض الدهنية الميثيل ترد أيضا (الشكل التكميلي 4).

هذا الأسلوب هو نوعي وبالكشف عن الاختلافات الكمية بين العينات، وبالتالي قيمته لتحليل متحولة. يتم تحديد مبالغ أحادية فردية باستخدام الطريقة المعيارية الداخلي الكمي، مما يتيح مقارنات فرة مونومر بين العينات. ينبغي توضيح ذلك، مع ذلك، أن حجم الذروة (مجموع التهم أيون) قد لا تعكس النسب المولية للأحادية في البوليستر. نحن بما في ذلك الجداول قابلة للتحرير أحادية لحساب كميات مونومر في أوراق نبات الأرابيدوبسيس كوتين كما الأحماض الدهنية استرات الميثيل ومشتقاتها TMSI (ملف إضافي 1)، أو الآس المشتقات TYL (ملف إضافي 2) من الكحول. قد تحتاج إلى أن تتكيف إذا يتم استخراج عينات من أجهزة مختلفة أو أنواع النباتات هذه الجداول.

وكمثال على ذلك، قمنا بتحليل نبات الأرابيدوبسيس تاليا غ كولومبيا (كو-0) أوراق النوع البري واثنين من الأليلات-اغية متحولة السمات التي تميزت سابقا من الجين CYP86A2 / ATT1، att1-1 (م-1) وatt1-2 (م-2 ) ^13،14. monooxygenases السيتوكروم P450 من فصيلة CYP86A ترميز المفترضة oxydases ω وتشارك في سوبيرين وكوتين مونومر الحيوي. نتائجنا (الشكل 4) تبين تخفيضات كبيرة في كميات من ثلاثة أحادية الدهون كبيرة في الأوراق متحولة مقارنة الأوراق WT. واتساقا مع توقع وظيفة الإنزيم، 16: 0، 18: 2 و 18: 1 dicarboxylates تأثرت تحديدا في المسوخ att1.

"SRC =" / ملفات / ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg "/>
الشكل 1. نظرة عامة على تحليل الدهون البوليستر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. آلية للتفاعل نقل الميثيل NaOMe المحفزة. مهاجمة الأنيونات ميثوكسيد أليفة النواة الكربون cabonyl من البوليستر الدهون لتشكيل مستقر رباعي السطوح المتوسطة (A)، التي تنأى بسهولة إلى الأحماض الدهنية استرات الميثيل والأنيونات آلكوكسيد (B). هذه هي قواعد alkoxides المتقارن، وتتفاعل مع الميثانول، وتجديد الأنيونات ميثوكسيد ناشطة تحفيزيا، وبالتالي الحفاظ على ردود فعل التحلل إضافية (C). إذا كان الماء موجودا فيالنظام، وسوف تتفاعل مع ميثوكسيد الصوديوم لتكوين هيدروكسيد الصوديوم، قاعدة قوية تتحلمأ لا رجعة فيه استرات لإنتاج الأحماض الدهنية الحرة غير مرغوب فيها. يضاف خلات الميثيل بوصفه مشاركا المذيبات ¹⁵ لإزالة كميات صغيرة من هيدروكسيد الصوديوم داخل منظومة (D). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3). الممثل مجموع اللوني ايون البرية من نوع أوراق نبات الأرابيدوبسيس thaliana أحادية كوتين. (A) O -trimethylsilyl (TMSI) الأثير و (B) مشتقات الهيدروكسيل خلات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4. كوتين تكوين مونومر من نبات الأرابيدوبسيس thaliana WT واثنين من الأليلات متحولة فارغة من الجين CYP86A2. (متحولة-1 = att1-1؛ متحولة-2 = att1-2) تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للمتوسط ​​(ن = 4) . مقتبس من ^13، بإذن من © دار نشر بلاكويل (2007). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويتم تحديد الشكل التكميلي 1. الذروة نتائج التكامل الجدول من GC / MS البرمجيات. قمم المقابلة لمونومرات المحددة والمعايير الداخلية التي كتبها retenti بهم في الوقت المحدد (العمود C) ويتم جدولتها القيم منطقة في العمود D. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلي ملف 2. الجدول من نبات الأرابيدوبسيس أحادية كوتين (المشتقات الأثير trimethylsilyl من هيدروكسي استرات الميثيل الأحماض الدهنية). الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلي ملف 3. الجدول من نبات الأرابيدوبسيس أحادية كوتين (المشتقات O -acetyl من هيدروكسي استرات الميثيل الأحماض الدهنية).كوم / ملفات / ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلي الشكل 4. GC / آثار ااا من (AB) استر الأحماض الدهنية الميثيل (FAME) معايير مؤشر الاستبقاء (وصفت قمم مع كل المشبعة FAME طول السلسلة)؛ و (C) الأسيتيل A. thaliana WT رقة أحادية كوتين. الأرقام على ذروة تتوافق مع: 16: 0 FAME (1)، ferulate (2)، 18: 3 FAME (3)، 18: 18/01: 2 جوع (4)، 18: 0 FAME (5)، sinapate (6 ) 16: 0 DCA (7)، 16-OH 16: 0 FAME (8)، 18: 2 DCA (9)، 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11)، 18-OH 18: 2 FAME (12)، 18-OH 18: 1 FAME (13)، 20: 0 FAME (14)، 10،16-diOH 16: 0 FAME (15)، 24: 0 FAME (16). DCA: حمض ثنائي الكربوكسيل ميثيل استر. FAME: الدهنية استر الميثيل حامض. IS1: معيار الداخلية 1، 17: 0 FAME؛ IS2: الحادي الداخليandard 2، 15-OH 15: 0 FAME. الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

على عكس البوليمرات الحيوية الأخرى مثل الحمض النووي والبروتينات، ليست مصنوعة البوليستر الدهون النباتية من قالب. بدلا من ذلك، مؤلفاتهم تعتمد على خصوصية الإنزيمات الموجودة في الأنسجة التي تجعل من هذه البوليمرات خارج الخلية. كما يحلل هذا القبيل، كيميائي للناخب عناصر حاسمة لفهم تكوين البوليستر الدهون.

الطرق الكيميائية ليلتصق السندات استر تشمل التصبين، hydrogenolysis، نقل الميثيل الحمضية المحفز، والمحفز قاعدة نقل الميثيل ^2. كل منهم لديه مزايا وعيوب. التصبين تنتج حرة الأحماض الدهنية هيدروكسي التي يمكن أن تفاعلات الثانوية. Hydrogenolysis مع هيدريد الليثيوم الألمنيوم (LiAlH ₄₎ ¹⁶ استخدمت لتحليل كوتين ^7. Hydrogenolysis يقلل الكربون functionalized إلى الكحول وتحتاج الهياكل الأصلية ليتم الاستدلال على ذلك من خلال deuteriolysis مع ديوترايد الليثيوم الألومنيوم (LiAlD _4). العيب هذا النهج هو شرط عالية الدقة GC / MS لمقارنة درجة deuteriation من البوليولات الدهنية التي تم الحصول عليها لجعل المهام هياكلها. وقد أسترة حمض المحفزة مع المثيلي فلوريد البورون (BF ₃₎ كثيرا ما تستخدم في كوتين وسوبيرين depolymerizations ^8،17،18، ولكن رد الفعل لديه صلاحية محدودة ويمكن أن يعرض القطع الأثرية المقرر إلى جانب ردود الفعل ^15. حامض الكبريتيك المثيلي ينتج أيضا استرات الميثيل للأحادية ولكن مع نسب أكبر من الأحماض الدهنية 2-هيدروكسي، التي يفترض أن لا مكونات البوليستر الدهون الحقيقية، بالمقارنة مع الطرق الأخرى ^10.

طريقة أسترة NaOMe المحفزة الموصوفة في هذا البروتوكول تنتج الأحماض الدهنية استرات الميثيل التي derivatized بواسطة silylation من مجموعات الهيدروكسيل، وتوفير مميزة أطياف الكتلة لتحديد الهوية، أو عن طريق أستلة لتوفير المشتقات أكثر استقرارا من مجموعات الهيدروكسيل FOص الكمي. عيب واحد من هذه التقنية هو أن التحلل يتنافس مع أسترة عندما تكون المياه موجودة في رد الفعل. يتفاعل الماء مع NaOMe (المحفز) وتنتج هيدروكسيد الصوديوم، والذي بدوره تتحلمأ الدهنية استرات الميثيل لانتاج حامض الأحماض الحرة (الشكل 2D). هذا هو رد فعل الجانب غير مرغوب فيه لقمتين سوف يكون حاضرا لكل الأحماض الدهنية: استر الميثيل واستر مشتق TMSI، مما يعقد التحليل. باستخدام الكواشف اللامائية وإضافة خلات الميثيل بوصفه مشاركا من المذيبات للتنافس مع التصبين خطوات بالتالي حاسمة لمنع التحلل (الشكل 2D).

كوتين وسوبيرين تحتوي على ما بين 1 و 26٪ الجلسرين ^4. ومع ذلك، لن يتم الكشف عن هذه مونومر بسبب الظروف التجريبية الموصوفة في هذا البروتوكول. الجلسرين هو ماء للغاية، وعلى عكس الأحماض الدهنية أحادية استر الميثيل، سيتم القضاء خلال الخطوات المذيبات غسل المائية. هذا القيد أيضايمكن تحديد pplies إلى طرق التحلل كوتين أخرى، ولكن الجلسرين في الطبقة المائية التي تم الحصول عليها بعد أسترة باستخدام أسلوب الأنزيمية. بدلا من ذلك، يمكن قياسها كميا باستخدام أوضاع أكثر اعتدالا (على سبيل المثال، 0.05 M NaOMe) دون مزيد من استخراج المياه للكشف عن أحادية، بما في ذلك الجلسرين ^19،20 .على الرغم من المفيد لغرض الجلسرين الكمي، ظروف معتدلة عادة ما تعطي التحلل غير الكامل للكوتين و سوبيرين.

إذا كان GC بالإضافة إلى كاشف اللهب التأين (ااا) هو متاح، جميع مكررات يمكن تحليلها في هذا الصك لأغراض الكمية، بعد أن تم التعرف على قمم عينة تمثيلية من قبل GC / MS. بدلا من ذلك، يمكن تحديد أحادية في GC / آثار ااا إذا عرفت مؤشرات الاحتفاظ بها. كاشف تأين اللهب لديه حساسية عالية خاصة ومجموعة واسعة من التناسب، وهو أمر حاسم لتقدير مكونات العينة الرئيسية والثانويةفي أشواط واحد. وبالإضافة إلى ذلك، فمن قوي وسهل لصيانة وتشغيل ^15.

بروتوكول صفها يسمح للموثوقة وقابلة للتكرار العزلة، وتحديد، وتقدير حجم الدهون النباتية أحادية البوليستر، والسماح للتوصيف الكيميائي للطفرات التي تختلف في تكوين واحد أو أكثر من الدهون أحادية البوليستر. هذا الإجراء هو تحجيم، ويمكن أن تتكيف بسهولة لمعالجة كميات سواء الصغيرة والسائبة من مختلف المواد النباتية، بما في ذلك الجذور والبذور والأوراق والسيقان والأزهار. وقد تم نشر البيانات الطيفية الجماعية للدهون أحادية البوليستر من العديد من الأنواع ^{مثل، 21-26} وتشكل الموارد القيمة لتحديد أحادية غير معروفة عند التكيف مع هذا البروتوكول إلى الأنسجة و / أو الأنواع الأخرى. هذه الطريقة تنطبق على تحقيقات الحيوي، والتنظيم، وتوزيع البوليستر الدهون في النباتات العليا.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
2-propanol	Fisher Scientific	BPA451-4	Solvent for delipidation
Anhydrous sodium sulfate	Fisher Scientific	S421500
Acetic anhydride	Sigma Aldrich	320102	Derivatization agent
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide)	Sigma-Aldrich	15222	Derivatization agent
Butylated hydroxytoluene (BHT)	Sigma-Aldrich	101162	Antioxidant
Calcium chloride, anhydrous	Fisher Scientific	C614-3	Desiccation agent
Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator)	Acros Organics	219090020	Desiccation agent
Chloroform (Trichloromethane)	Fisher Scientific	C6074	Organic solvent
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	BP2401212	Acidification agent
Helium carrier gas, compressed	Air Liquide	ALPHAGAZ1-UN1046	Carrier gas, GC/MS
Heptane	Fisher Scientific	H3501	Organic solvent
Hexanes	Fisher Scientific	H3024	Organic solvent
Methanol	Fisher Scientific	A4124	Organic solvent, transmethylation reactive
Methyl acetate	Sigma-Aldrich	296996	Organic solvent
Methyl heptadecanoate	Sigma-Aldrich	H4515	Internal standard (1mg/mL stock)
Methylene dichloride (Dichloromethane)	Fisher Scientific	D374	Organic solvent
Nitrogen, compressed	Air Liquide	ALPHAGAZ1-UN1044	Carrier gas, GC-FID
Pentadecanolactone	Fluka	76530	Internal standard (1 mg/mL stock)
Pyridine	Sigma-Aldrich	270970	Co-solvent for derivatization
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358212	Saline solution
Sodium methoxide (25wt.%)	Sigma-Aldrich	156256	Nucleophile
Toluene	FIsher Scientific	T2904	Organic solvent
Plant Growth Supplies
Pro-Mix PGX	Premier Tech Horticulture Ltd		Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue Methods for Arabidopsis Growth.
PermaNest Humidity Dome	Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN	GD2211-24
Perma-Nest Plant Trays (22x11in)	Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN	N/A
Square greenhouse pots, 3.5 inch	Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN	P86
General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20	Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON	N/A
Glassware
13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap	Kimble Chase Life Science and Research Products LLC	45066A-13100
16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap	Kimble Chase Life Science and Research Products LLC	45066A-16125
20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap	Kimble Chase Life Science and Research Products LLC	45066A-20125
GC vial caps	National Scientific	C400051A
GC vial microinserts	National Scientific	C4011631
GC vials	National Scientific	C40001
Disposable pasteur pipets	Fisher Scientific	1367820B
Flasks	Fisher Scientific
Equipment
Allegra X15R centrifuge	Beckman Coulter
Analytic balance	Fisher Scientific
Belly dancer			A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available
DB-5 Capillary GC column	J&W Scientific, CA, USA;		30 m x 0.25 mm x 0.25 μm film thickness
Desiccator
Isotemp 202 water bath	Fisher Scientific
ISQ LT single quadupole mass spectrometer	Thermo Scientific
Heat block	Fisher Scientific
Nitrogen evaporator
Polytron homogenizer	Birkmann
Trace 1300 gas chromatograph	Thermo Scientific
Two-stage regulator	Air Liquide	Q1-318B-580
Vacuum desiccator	Fisher Scientific
Vortex mixer	Fisher Scientific