Выделение и анализ состава растительных липидов кутикулы полиэфирные мономеры

Резюме

Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

Аннотация

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.

Введение

Сосудистые растения полагаются на внеклеточных слоев, которые функционируют как водонепроницаемых барьеров между растительных тканей и внешней среды. Эти стены-ассоциированных структур липофильный клеток ограничивают патогенной инфекции и регулировать пассивный транспорт газов, воды и растворенных веществ в и из растительных тканей ^1. Такие барьеры завод кутикулы, А synapomorphic структура уникальна для растений ^2, и различных суберина содержащие диффузионных барьеров. Кутикула олеофильный слой синтезированы эпидермальных клеток и связаны с ними через пектиновые слоя на внеклеточной части клеточной стенки ^3-5. Это заключает основные воздушные органы высших растений, используемых в качестве важного интерфейса между растительных тканей и окружающей среды.

Кутин, структурной матрицы кутикулы и суберин два нерастворимые глицеролипид полиэфиры, связанные с растворителем-экстрагируемых восков ^2,4. Эти полимерные лipids состоят из насыщенных и ненасыщенных производных жирных кислот и структурно и функционально похожи. Тем не менее, они отличались характерными различиями в химическом составе и осаждения сайтов.

Суберин является алифатический полиэфир, расположенный внутри клеточных стенок некоторых внешних и внутренних тканей, образующих вторичную стенку. Опробковевших ткани включают periderms корней, клубней и кору деревьев, корневые эндодермы, кожуры слои, и исцелил раны ^2. В отличие кутина, то суберин полиэфир обычно содержит спирты, насыщенные и моно-ненасыщенных дикарбоновых кислот и большую часть мономеров с очень длинной цепью (C≥20).

Кутин является наиболее распространенным липидов полиэфир в сосудистых растений ^6, и состоит из глицерина и С 16 -С 18 жирных производных переэтерифицированную кислот, такие как гидрокси и гидрокси-замещенных эпоксидных жирных кислот ^4. В то время как состав кутина полимеровварьируется в зависимости от вида tracheophyte, наиболее преобладающие первичные мономеры 10, 16-дигидрокси 16: 0, 18-гидрокси-9,10-эпокси 18: 0, и 9,10,18-триокси 18: 0 жирных кислот. Интересно, что Arabidopsis листьев и стеблей кутин в основном состоит из 18: 2 дикарбоновой кислоты ^7,8.

Кутикулы растений также представит значительные различия в толщине, начиная от нескольких нанометров до нескольких микрометров ^9. Так изоляции кутикулы является трудоемким и занимает много времени шаг, особенно для тонких листовых очень кутикулы, такие как те из Arabidopsis THALIANA ^8, способы в обход изоляции кутикулы были разработаны и проверены ^7,8. Здесь мы описываем подробный протокол для изучения мономерный состав кутина в Arabidopsis THALIANA листьев по метоксид натрия (NaOMe) -catalyzed деполимеризации и последующего газовой хроматографии / масс-спектрометрии (/ MS GC) анализ. Этот протокол обеспечивает надежную способ анализа СОmposition липидных завод полиэфиров в целом delipidated тканей, и была заимствована из ранее представленных протоколов ^7,10,11. Образцы цельной ткани сначала гомогенизируют и исчерпывающе delipidated, удаление растворителя экстрагируемой липидов в том числе и кутикулярные epicuticular восков, липидов мембран и триацилглицеринов. Клеточной стенки обогащенный остатки затем деполимеризованный в их учредительных мономеров метилового эфира по метанолята катализируемой метанолиза натрия. Метиловые эфиры жирных кислот экстрагируют при подкислении и дериватизации с получением их соответствующих триметилсилил или ацетил производные. Производные остатки обладают высокой летучестью, и может быть элюировали из колонки газовой хроматографии по разумной температуры без изменения их структурной конформации при анализе ГХ / МС.

протокол

Примечание: Этот протокол был адаптирован с Бонавентура и др. (2004), Молина и др. (2006), Ли и др. (2013) ^7,10,11. Шаги 1-5 приведены на рисунке 1.

1. Ткань делипидированием

Примечание: Всегда прополощите все стекла и крышки с хлороформом, давая сухой под вытяжкой, перед использованием.

ВНИМАНИЕ: Выполните ткани гомогенизации и все шаги растворителей передачи под вытяжкой; всегда носить лаборатории пальто, перчатки и защитные очки всплеск, чтобы избежать прямого контакта с химическими веществами и защитить образцы от загрязнения.

1. Разогреть на водяной бане и тепло блок 85 ° C.
2. Взвешивают приблизительно 0,5 г образца листьев каждого в предварительно взвешенный 20 мм х 125 мм стеклянные пробирки с политетрафторэтилен (ПТФЭ) -faced винтовыми пробками. Включают в себя четыре дубликатов на образце.
3. Поместите 2-пропанол в колбе Эрленмейера (примерно 125 мл; 25 мл на г SAMPле). Добавить 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол (также известный как бутилированный гидрокситолуол, ВНТ) до конечной концентрации 0,01% (вес / объем).
   Примечание: Добавить ВНТ из 5% (вес / об) маточного раствора в метаноле (ВНТ помогает свести к минимуму окисление ненасыщенных жирных кислот).
4. Предварительный нагрев 2-пропанол до 85 ° С на водяной бане.
5. Добавить 12 мл горячей 2-пропанол растворитель в каждую пробирку и тепла в течение 15 мин при 85 ° С в нагревательный блок. Этот шаг инактивирует липазы, что может быть освобожден от разрушенных клеток.
6. Пусть трубки остыть до комнатной температуры и измельчить ткань тщательно гомогенизаторе до получения однородной суспензии.
7. Поместите образцы в орбитальном шейкере и встряхивают в течение 1-2 часов при 100 оборотов в минуту и ​​при комнатной температуре.
8. Центрифуга в течение 10 мин при 800 мкг и отбросить супернатант.
9. Добавить равный объем 2-пропанола и встряхивают в течение 12 часов при комнатной температуре.
10. Центрифуга в течение 10 мин при 800 мкг и отбросить супернатант.
11. Добавить 12 мл CHCl _{3: CH} 3 OH (2: 1, объем / объем) до остатка (25 мл на грамм образца) и встряхивали в течение ночи при 100 оборотах в минуту и при комнатной температуре.
12. Центрифуга в течение 10 мин при 800 мкг и отбросить супернатант.
13. Добавить 12 мл _CHCl 3: _CH 3 OH (1: 2, об / об) до остатка и встряхивают в течение ночи при 100 оборотах в минуту и при комнатной температуре.
14. Центрифуга в течение 10 мин при 800 мкг и удаления растворителя.
15. Пусть образцы сушат при вытяжном шкафу в течение ночи при комнатной температуре.
16. Высушите остаток, а затем поместить в вакуум-эксикаторе над безводным CaCl _{2 или 4} до тех пор, CaSO постоянной массы достигается (3-5 дней).

2. Деполимеризация: метанолизе с метоксид натри (рисунок 2)

ВНИМАНИЕ: Выполните шаги 2.3 - 2.4, 2.7 - 2.8, 2.10 - 2.11, 2.13 - 2.15 и 2.17 - 2.18 под вытяжкой; всегда носить лаборатории пальто, перчатки и защитные очки всплеск.

1. Разогреть тепло блок 60 ° C.
2. Взвесьте пробирки, содержащие сухой остаток (важный для дальнейших расчетов).
3. Добавить внутренние стандарты в каждую пробирку: 25 ωL метил heptadecanoate (1 мг / мл) и акции 25 мкл со-pentadecalactone (1 мг / мл акции).
4. Добавить 0,9 мл метилацетата, 1,5 мл метоксида натрия и 3,6 мл метанола в каждую пробирку и колпачок их. Кроме того, подготовить реакционной смеси этих трех реагентов и добавить 6 мл аликвоты с каждого образца.
5. Образцы тепла течение 2 часов при 60 ° С и вихря периодически 15-минутными интервалами.
6. Давайте образцы остыть до комнатной температуры.
7. Добавьте 10 мл хлористого метилена (СН _{2 Cl} 2) и 1,5 мл ледяной уксусной кислоты, чтобы извлечь метиловых эфиров жирных кислот.
8. Добавить физиологический раствор (0,5 М NaCl), чтобы заполнить каждую пробирку и шапку.
9. Образцы Вихревые в течение 1 мин и центрифугируют в течение 10 мин при 800 х г в.
10. Трансфер органическую фазу (нижний) для очистки труб среднего размера (16 х 125 мм стеклянные пробирки с политетрафторэтилена (ПТФЭ) -faced винтовой крышкой).
11. Добавить физиологический раствор (0,5 М NaCl), чтобы заполнить каждую пробирку и шапку.
12. Образцы Вихревые в течение 1 мин и центрифугируют в течение 10 мин при 800 х г в.
13. Удалить водный (верхний) фазы и повторите шаги 2.11-2.12.
14. Удалить все водный (верхний) фазы.
15. Добавить безводный сульфат натрия _(Na 2 _SO 4) в растворителе, крышка трубы, и вихрь в течение 1 мин; Образцы могут быть оставлены в настоящее время до следующего дня. На этом этапе образцы могут быть оставлена ​​на ночь при вытяжном шкафу.
16. Центрифуга в течение 2 мин при 800 мкг для уплотнения _Na 2 SO 4 соль на дне.
17. Перевести органическую фазу в маленький стакан одноразовой трубки (13 х 100 мм стеклянные пробирки с политетрафторэтилена (ПТФЭ) -faced винтовой крышкой).
18. Растворитель выпаривают досуха в атмосфере азота и переходите к шагу дериватизации. Если не обрабатываются немедленно, хранить образцы выпаривали при -20 ° С (образцы могут бытьLSO хранятся до стадии испарения).

3. Подготовка производных для газовой хроматографии

ВНИМАНИЕ: Выполните шаги 3.1.2 и 3.1.5 - 3.1.8 под вытяжкой; всегда носить лаборатории пальто, перчатки и защитные очки всплеск.

1. Производные триметилсилила
   1. Разогреть тепла блок до 100 ° С.
   2. Добавить 100 мкл пиридина и 100 мкл (БСТФА N, О бис-триметилсилил-трифторацетамид) в каждую пробирку и колпачок их.
   3. Образцы тепла при 100 ° С в течение 10 мин.
   4. Давайте образцы остыть до комнатной температуры.
   5. Выпаривают образцы в атмосфере азота при комнатной температуре. Избегать применения тепла к образцам, мономеры обладают высокой летучестью на данном этапе.
   6. Добавить 500 мкл 1: 1 (объем / объем) гептан: толуол.
   7. Образцы Вихревые в течение 1 мин и центрифугируют в течение 2 мин при 800 х г в.
   8. Добавить образцы GC флаконы и приступить к GC / MS анализа.
2. Ацетилпроизводные
   Примечание: ацетилирование, изменять шаги 3.1.1-3.1.3 выше следующим образом (не показано на видео); шаги 3.1.4-3.1.8 те же:
   1. Разогреть тепло блок 60 ° C.
   2. Добавить 100 мкл пиридина и 100 мкл уксусного ангидрида (AC _{2 O)} в пробирки.
   3. Тепловые пробы 1 часа при 60 ° С.

4. ГХ / МС анализ

1. Использование капиллярной колонки HP-5 (30 м х 0,25 мм х 0,25 мкм толщины пленки) или эквивалент (т.е.., 5% дифенил, 95% диметилполисилоксану). Программа ГХ с потоком газа гелия-носителя устанавливают при 1,5 мл / мин и температуре печи запрограммированной от 150 до 300 ° С со скоростью 3 ° С / мин.
2. Используйте сплит инъекции (сплит соотношение 1:10) и установить масс-спектрометр в режим сканирования по 40-600 а.е.м. (ударной ионизации электрона).
3. Создайте таблицу последовательности в том числе растворителей (пустой), WT и мутантных повторов, каждый с использованием указанного метода кутина анализа.
4. Нагрузка растворителяи флаконы на карусели, добавить гексан шприцев полоскания флаконах в пробоотборник при необходимости, и начать последовательность. После того, как последовательность завершена, общей ионной хроматограммы следов доступны для всех образцов.

Анализ данных 5.

1. Определить липидный полиэфирные мономеры, сравнивая масс-спектр каждого пика к опубликованному масс-спектров, либо путем поиска коммерческих библиотеку, если можно.
2. Для каждого идентифицированного пика в общем ионного тока хроматограмме, использовать их соответствующие сроки хранения, чтобы найти области на таблицу результатов интеграции с GC / MS программного обеспечения (Справочная Рисунок 1).
3. Для каждого мономера (столбцы AB), добавьте значения площади, найденные в таблице интеграции (Справочная Рисунок 1, колонка D) в соответствующей колонке для каждого повторить образец в Excel таблицы мономеров (Справочная файла 2, колонн CF), которая электронные таблицы для количественного арабидопсисакутина TMSI производные. Используйте Дополнительный файл 3, если ацетилированные производные получают вместо этого.
4. Добавить области внутренних стандартов (IS) в колоннах (HK). Для тех мономеров, которые не дериватизированных, а именно жирных кислот метиловых эфиров (FAMEs), и дикарбоновых сложных эфиров кислоты диметилового (DCA DME,), использовать 17: 0 FAME (IS1), как для количественного (фиолетовый тени ячеек в таблице мономера; Справочная Файлы 2/3). Для гидроксилированных мономеров, в том числе первичных спиртов, феруловая кислоты и ω-гидроксикислот, используют 15: 0 15-гидрокси FAME (IS2), как выбор для соединения количественной (зелено-shadded ячеек в таблице мономера; дополнительные файлы 2/3) ,
5. Добавить сухую массу листьев для каждого репликации на колонках АХ-BA (Справочная файла 2) или AQ-АТ (Справочная файла 3); альтернативно, сканировать листья для расчета площади поверхности и добавить значения площади к столу мономера, чтобы выразить мономера нагрузки на единицуплощадь поверхности.

Результаты

Протокол, описанный в этой рукописи устанавливается для определения липидов мономеров полиэфира, минимизируя вклад без кутина липидов ¹⁰ Рисунок 1 представляет обзор анализа, который вообще занимает от 8 (т.е., кутина или суберина.) -. 10 дней (от начальной заготовки ткани получения данных ГХ), в зависимости от того, сколько образцы дают высохнуть.

Выбранный катализируемой основанием метанолиза (рис 2) способ деполимеризации полиэфиры ранее утверждены для семян Arabidopsis, которые содержат как кутин и суберина. Ткани сначала гомогенизировали и исчерпывающе delipidated для удаления растворителя-извлекаемые липиды. Выход остатка после экстракции в процентах от первоначальной сырой массы, в обычно 6% для A. THALIANA Кол-0 листья. Клеточной стенки обогащенного остатки сушат в вакуумном эксикаторе и затем деполимеризации на составляющие мономеров сложного метилового эфира скатализируемой основанием трансметилирования. Два часа инкубации был выбран в качестве критического времени, необходимого для правильного деполимеризации и восстановления липидных компонентов полиэфирных. Более длительные времена инкубации в результате увеличения 2-оксикислот; это потенциально извлечь из мембранных сфинголипиды ^10.

Типичный хроматограмма, если Arabidopsis дикого типа листьев кутина показано на рисунке 3, для вывода -TMSi эфирных производных (рис 3а) и производных О-ацетил (рис 3b). Каждый пик был определен в сравнении с масс-спектров от литературы и ^7,8 публичной базе данных ¹² протокола .our видео показывает, как подготовить TMSI производные, но образцы могут быть альтернативно ацетилированный для получения производных гидроксильные группы. Силилированный производные полезны для целей идентификации потому что они дают диагностическую масс-спектров. Тем не менее, ацетилированные производные являются более стабильными и хорошая альтернатива Силилированиеодин мономеров были идентифицированы ^10. Чтобы помочь реализовать этот протокол в лабораториях, которые только были ГК, соединенный с пламенно-ионизационным детектором (FID), ГХ / ПИД следы, соответствующие ацетилированного производные WT мономеров лист кутина и в гомолога серии стандартов метилового эфира жирных кислот также показаны (Справочная Рисунок 4).

Этот метод является качественной и обнаруживает количественные различия между образцами, следовательно, его значение для мутанта анализа. Количества отдельных мономеров определяются с использованием метода внутреннего стандарта количественного, что позволяет сравнивать мономера изобилии между образцами. Следует уточнить, однако, что пик размер (суммарного количества ионов) могут не отражать молярные соотношения мономеров в полиэфира. Мы в том числе редактируемых таблиц мономеров для расчета суммы мономеров в Arabidopsis листьев кутина, как метиловых эфиров жирных кислот и производных (TMSI Справочная файла 1), или туз производные TYŁ (Справочная файла 2) спиртов. Эти таблицы могут должны быть адаптированы, если образцы извлекают из различных органов или видов растений.

В качестве примера, мы проанализировали Arabidopsis Талия на Колумбия (Кол-0) листья дикого типа и два ранее охарактеризованных нулевые-мутантных аллелей гена CYP86A2 / att1, att1-1 (м-1) и att1-2 (м-2 ) ^13,14. Цитохрома Р450 монооксигеназ о CYP86A подсемейства кодируют предполагаемые Q-oxydases и участвовать в суберина и кутина мономера биосинтеза. Наши результаты (рисунок 4) показывают, значительное снижение нагрузок трех основных мономеров липидов в листьях мутантных по сравнению с WT листьев. В соответствии с прогнозируемым функции фермента, 16: 0, 18: 2, и 18: 1 дикарбоксилатов были специально затронуты в att1 мутантов.

"SRC =" / файлы / ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Обзор анализа липидов полиэфирной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Механизм NaOMe-катализируемой реакции трансметилирования. Нуклеофильного метоксид анионы атаковать cabonyl углерод липидных сложных полиэфиров, чтобы сформировать нестабильную тетраэдрического интермедиата (а), который легко диссоциирует на метиловых эфиров жирных кислот и алкоксидов анионов (B). Эти алкоксиды являются сопряженными основы, и реагирует с метанолом, регенерации каталитически активных метоксид анионы, тем самым поддерживая дополнительные реакции деполимеризации (C). Если вода присутствует вСистема, он будет реагировать с метоксид натрия с образованием гидроксид натрия, сильное основание, что необратимо гидролизует эфиры, чтобы привести к нежелательным свободных жирных кислот. Метилацетат добавлен в качестве со-растворителя ¹⁵ для удаления небольших количеств гидроксида натрия в системе (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. Представитель общая ионная хроматограмма дикого типа Arabidopsis THALIANA листьев кутина мономеров. (А) О -trimethylsilyl (TMSI) эфир и (Б) ацетат гидроксильные производные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4. кутин мономера состав Arabidopsis THALIANA WT и двух нулевые мутантные аллели гена CYP86A2. (Мутант-1 = att1-1; мутанта-2 = att1-2) Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение среднего (n = 4) , Взято из ^13, с разрешения © Blackwell Publishing (2007). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Справочная Рисунок 1. Пиковая результаты интеграции стол с / MS программного обеспечения GC. Пики, соответствующие выявленных мономеров и внутренних стандартов идентифицируются по их retenti на время (столбец С) и значения площадь приведены в колонке Д. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Справочная файла 2. Таблица Arabidopsis кутина мономеров (производных триметилсилил эфира гидроксильных метиловые эфиры жирных кислот). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Справочная файла 3. Таблица Arabidopsis кутина мономеров (производных О-ацетил гидроксильных метиловые эфиры жирных кислот).ком / файлы / ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivatives.xlsx "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Справочная Рисунок 4. ГХ / FID следы от (АВ) метил жирной кислоты (FAME) стандарты индекса удерживания (пики помечены каждого насыщенного FAME длиной цепи); и (С) А. ацетилированный THALIANA WT лист кутина мономеры. Цифры на пике соответствуют: 16: 0 FAME (1), ферулата (2), 18: 3 FAME (3), 18: 1/18: 2 FAMEs (4), 18: 0 FAME (5), (6 sinapate ), 16: 0 DCA (7), 16-ОН 16: 0 FAME (8), 18: 2 DCA (9), 18: 1 DCA (10) 18: 0 DCA (11), 18-ОН 18: 2 FAME (12), 18-ОН 18: 1 FAME (13), 20: 0 FAME (14), 10,16-diOH 16: 0 FAME (15), 24: 0 FAME (16). DCA: диметиловый эфир дикарбоновой кислоты; FAME: метиловый эфир жирной кислоты; IS1: внутренний стандарт 1, 17: 0 Слава; ИС2: внутренний улandard 2, 15-ОН 15: 0 славы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

В отличие от других биополимеров, таких как ДНК и белков, липидов растений полиэфиры не сделаны из шаблона. Вместо этого их композиции зависит от специфичности ферментов, присутствующих в тканях, которые делают эти внеклеточные полимеры. Таким образом, химические анализы на компоненты которой важно понять липидный состав сложного полиэфира.

Химические методы расщепляют эфирные связи, включают омыление, гидрогенолиз, кислотный катализируемой трансметилирования и катализируемой основанием трансметилирования ^2. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. Омыления производит свободные жирные кислоты, которые гидроксильные могут подвергаться вторичной реакции. Гидрирование алюмогидридом лития (LiAlH ₄₎ ¹⁶ была использована для анализа кутина ^7. Гидрогенолиз уменьшает функциональными углерода спирты и оригинальные структуры должны быть выведены с помощью deuteriolysis с литий-алюминий дейтеридом (LiAlD _4).Недостатком этого подхода является требование высокой разрешающей ГХ / МС, чтобы сравнить степень deuteriation жирных полиолов, полученных, чтобы сделать их назначений структур. Катализируемой кислотой переэтерификации с метанольным трифторида бора (BF ₃₎ был часто используется в кутин и суберина деполимеризации ^8,17,18, но реагент имеет ограниченный срок годности и может ввести искажений, обусловленных побочных реакций ^15. Метанольный серной кислоты также дает метиловые эфиры мономеров, но с более значительным числом 2-гидрокси жирные кислоты, которые, предположительно, не являются истинными липидных компонентов полиэфирные, по сравнению с другими методами ^10.

NaOMe катализируемой Способ переэтерификации описано в данном протоколе производит метиловых эфиров жирных кислот, которые модифицируют силилированием гидроксильных групп, обеспечивая характерный масс-спектров для идентификации или ацетилированием, чтобы обеспечить более стабильные производные гидроксильных групп FOг количественная. Одним из недостатков этого метода является то, что гидролиз конкурирует с переэтерификации, когда вода присутствует в реакции. Вода реагирует с NaOMe (катализатор) и производит NaOH, который в свою очередь гидролизует жирные кислоты метиловый эфиры с образованием свободных кислот (рис 2D). Это нежелательно, так как побочная реакция два пика будет присутствовать для каждого жирной кислоты: метилового эфира и сложного эфира производного TMSI, что усложняет анализ. С использованием безводного реагентов и добавление метилацетат, как сорастворитель, чтобы конкурировать с омылением, таким образом, решающие шаги, чтобы предотвратить гидролиз (рис 2D).

Кутина и суберина содержать от 1 до 26% глицерина ^4. Однако, это мономера не будет обнаружено в экспериментальных условиях, описанных в данном протоколе. Глицерин высокой гидрофильностью и, в отличие от мономеров метилового эфира жирной кислоты, будут устранены в течение водных растворителей шагов стирки. Это ограничение такжеpplies к другим методам кутин деполимеризации, но глицерина может быть определена в водном слое, полученном после переэтерификации с использованием метода ферментативного. В качестве альтернативы, он может быть количественно с использованием более мягких условий (например., 0,05 М NaOMe) без дополнительной водной экстракции для обнаружения всех мономеров, в том числе глицерин ^19,20 .Although полезной для целей количественного глицерина, мягкие условия обычно дают неполное деполимеризации кутина и суберина.

Если ГК соединен с пламенно-ионизационным детектором (FID) доступен, все повторности могут быть проанализированы в настоящем документе для целей количественного после пики репрезентативной выборки были определены ГХ / МС. В качестве альтернативы, мономеров в GC / FID следов могут быть идентифицированы, если их индексы удерживания известны. Детектор ионизации пламени имеет особенно высокую чувствительность и широкий спектр пропорциональности, которая имеет решающее значение для количественного определения главных и второстепенных компонентов пробыв единичных трасс. Кроме того, это надежный и простой в обслуживании и эксплуатации ^15.

Описанный протокол позволяет надежным и воспроизводимым изоляции, идентификации и количественного определения, липидных растений мономеров полиэфира, позволяя химических характеристик мутантов, которые отличаются по составу одного или более липидных мономеров полиэфира. Процедура является масштабируемой, он может быть легко приспособлен для обработки как малых, так и больших количествах различных растительных материалов, в том числе корни, семена, листья, стебли и цветки. Массовые спектральные данные липидных полиэфирных мономеров из многих видов были ^{опубликованы, например,., 21-26} и составляют ценные ресурсы для выявления неизвестных мономеров при адаптации этого протокола для других тканей и / или видов. Этот метод применим к исследованию биосинтеза, регулирования и распределения липидов полиэфиров в высших растений.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
2-propanol	Fisher Scientific	BPA451-4	Solvent for delipidation
Anhydrous sodium sulfate	Fisher Scientific	S421500
Acetic anhydride	Sigma Aldrich	320102	Derivatization agent
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide)	Sigma-Aldrich	15222	Derivatization agent
Butylated hydroxytoluene (BHT)	Sigma-Aldrich	101162	Antioxidant
Calcium chloride, anhydrous	Fisher Scientific	C614-3	Desiccation agent
Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator)	Acros Organics	219090020	Desiccation agent
Chloroform (Trichloromethane)	Fisher Scientific	C6074	Organic solvent
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	BP2401212	Acidification agent
Helium carrier gas, compressed	Air Liquide	ALPHAGAZ1-UN1046	Carrier gas, GC/MS
Heptane	Fisher Scientific	H3501	Organic solvent
Hexanes	Fisher Scientific	H3024	Organic solvent
Methanol	Fisher Scientific	A4124	Organic solvent, transmethylation reactive
Methyl acetate	Sigma-Aldrich	296996	Organic solvent
Methyl heptadecanoate	Sigma-Aldrich	H4515	Internal standard (1mg/mL stock)
Methylene dichloride (Dichloromethane)	Fisher Scientific	D374	Organic solvent
Nitrogen, compressed	Air Liquide	ALPHAGAZ1-UN1044	Carrier gas, GC-FID
Pentadecanolactone	Fluka	76530	Internal standard (1 mg/ml stock)
Pyridine	Sigma-Aldrich	270970	Co-solvent for derivatization
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358212	Saline solution
Sodium methoxide (25wt.%)	Sigma-Aldrich	156256	Nucleophile
Toluene	FIsher Scientific	T2904	Organic solvent
Plant Growth Supplies
Pro-Mix PGX	Premier Tech Horticulture Ltd		Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue Methods for Arabidopsis Growth.
PermaNest Humidity Dome	Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN	GD2211-24
Perma-Nest Plant Trays (22x11in)	Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN	N/A
Square greenhouse pots, 3.5 inch	Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN	P86
General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20	Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON	N/A
Glassware
13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap	Kimble Chase Life Science and Research Products LLC	45066A-13100
16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap	Kimble Chase Life Science and Research Products LLC	45066A-16125
20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap	Kimble Chase Life Science and Research Products LLC	45066A-20125
GC vial caps	National Scientific	C400051A
GC vial microinserts	National Scientific	C4011631
GC vials	National Scientific	C40001
Disposable pasteur pipets	Fisher Scientific	1367820B
Flasks	Fisher Scientific
Equipment
Allegra X15R centrifuge	Beckman Coulter
Analytic balance	Fisher Scientific
Belly dancer			A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available
DB-5 Capillary GC column	J&W Scientific, CA, USA;		30 m x 0.25 mm x 0.25 μm film thickness
Desiccator
Isotemp 202 water bath	Fisher Scientific
ISQ LT single quadupole mass spectrometer	Thermo Scientific
Heat block	Fisher Scientific
Nitrogen evaporator
Polytron homogenizer	Birkmann
Trace 1300 gas chromatograph	Thermo Scientific
Two-stage regulator	Air Liquide	Q1-318B-580
Vacuum desiccator	Fisher Scientific
Vortex mixer	Fisher Scientific