JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة تحضير بسيط للجسيمات متناهية الصغر من الذهب متكاملة الجسيمات الشحمية-صور متجاوبة مع المواد المتاحة تجاريا. كما يبين كيفية قياس عملية التجويف microbubble من الجسيمات الشحمية توليفها على علاج ليزر نابض.

Abstract

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

Introduction

إمكانية لتحريك الافراج عن المخدرات باستخدام مؤثرات الخارجية هو وسيلة جذابة لتقديم الأدوية في الموضات spatial-، temporal- والتي تسيطر عليها الجرعة مع خصوصية مكبر والآثار السلبية الحد الأدنى. من بين مجموعة واسعة من أنظمة خارجية-المحفزات التي تستجيب (ضوء، المجال المغناطيسي والموجات فوق الصوتية، أشعة الميكروويف)، منصات أثار ضوئية جذابة، بسبب من غير الغازية، والبساطة والقدرة على التكيف في العيادات. 1 بحوث مستفيضة في العقد الماضي قدمت مجموعة متنوعة من التقنيات منصة، مثل الذهب مسؤولة بالقرب من الأشعة تحت الحمراء، الضوء (الاتحاد الافريقي) قفص نانوي المغلفة مع البوليمرات الذكية، 2-صورة عطوب، النانوية البوليمرية (NPS) مترافق مع الأدوية و 3 و nanovesicles porphysome الذاتي تجميعها. 4 ولكن ، هذه التقنيات لا تزال في مراحل ما قبل السريرية للتنمية، وتتطلب فهم واضح والتحسين من المعلمات المشاركين في عملية بدء وتابعالمتداول الافراج عن المخدرات.

واحد من أبسط ويمكن الوصول إليها بسهولة طرق لإعداد مثل هذا النظام هو دمج الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية مع الجسيمات الشحمية حراريا الحساسة 5،6، متاحة على نطاق واسع في السوق وكلاهما وتم التحقيق فيها على نطاق واسع في التجارب قبل السريرية والسريرية حتى. وعلى الرغم من القيود المفروضة على تنشيط الأنسجة العميق من الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية في الطول الموجي من plasmonic، بالمقارنة مع النانو الاتحاد الافريقي الأشعة تحت الحمراء القريبة تنشيط (على سبيل المثال، قفص نانوي)، وهذا النظام لا يزال يحمل وعودا كبيرة عند استخدامها في الحيوانات الصغيرة أو للتسليم الموضعي في البشر. 7 هناك بعض الجهود المبكرة في الجمع بين الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية مع الجسيمات الشحمية لإطلاق أثار خفيفة 8-11 في حين أن معظمهم من التركيز على الجدة من المواد، وتحتاج إلى معالجة المسائل المتعلقة بإمكانية الوصول وتطويره. وعلاوة على ذلك، تقارير عن آليات الإفراج استخدام هذه nanocarriers لا تزال محدودة.

هنا، وتلفيق الصور تستجيبوقد وصفت الجسيمات الشحمية، تحميل في وقت واحد مع المخدرات ومصادر القدرة النووية الاتحاد الافريقي ماء. يستخدم Calcein كمركب نموذج لتقييم كفاءة التغليف والتعريف الافراج عن النظام. وبالإضافة إلى ذلك، في هذا النظام، وعلى ضوء استيعابها من قبل الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية تبدد إلى المكروية المحيطة بها في شكل حرارة، مما أدى إلى زيادة في درجة الحرارة المحلية. يتم إنشاء microbubbles الهواء أثناء التسخين ليزر ويسبب اضطراب الميكانيكية من الجسيمات الشحمية (الشكل 1). وأكد آلية التجويف microbubble بواسطة القياسات مائي.

Protocol

1. إعداد

  1. نظيفة 100 مل جولة قوارير السفلية باستخدام الماء الملكي (1 جزء من حمض النتريك (HNO 3) و 3 أجزاء من حامض الهيدروكلوريك المركز (حمض الهيدروكلوريك)) وغسل القوارير بالماء DI. الأوتوكلاف قوارير وتجفيفها في فرن الهواء الساخن عند 100 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. التفاف وتخزين قوارير معقمة حتى الاستخدام.
  2. تعقيم مجموعة مصغرة الطارد باليد باستخدام الايثانول 70٪.
  3. بدوره على المبخر الدوار وضبط درجة الحرارة في حمام الماء الساخن وبرج التبريد عند 37 درجة مئوية و 4 درجات مئوية على التوالي.
  4. إعداد 60 ملي calcein حل الأسهم عن طريق إذابة 374 ملغ من calcein في 10 مل من 0.1 ملي الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (7.4 درجة الحموضة). ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 باستخدام 1 M هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) حل.

2. تجميع الليبوزومات

  1. إزالة الدهون (1،2-Dipalmitoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine (DPPC)، 1-بالميتويل-2-هيدروكسي التعطيل -glycero-3-phosphochoخط (MPPC) و 1، 2-distearoyl- التعطيل -glycero-3-phosphoethanol-amine- N - [كربوكسي (البولي ايثيلين جلايكول) -2000] (ملح النشادر) (DSPE-PEG2000)) من الثلاجة (-20 درجة مئوية) وذوبان الجليد لهم RT.
  2. تزن 15.9 ملغ DPPC، 1.3 ملغ MPPC، و 2.8 ملغ DSPE-PEG2000. حل لهم معا في 2 مل الكلوروفورم.
  3. نقل الحل الكلوروفورم إلى الجولة معقمة قارورة أسفل وتتبخر المذيب باستخدام المبخر الدوار تحت ضغط منخفض، لتشكيل طبقة رقيقة من المادة الدهنية الجافة.
  4. ترطيب طبقة الدهون عند 45 درجة مئوية مع 2 مل من محلول مائي لمدة 30 دقيقة تحتوي على 1.95 مل 60 ملي calcein أعدت في الخطوة 1.4 و 50 ميكرولتر الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية (3.36 × 10 16 الجسيمات / مل).
  5. قبل تسخين كتلة التدفئة إلى 45 درجة مئوية. وضع 200 نانومتر مرشح غشاء البولي بين دعامات تصفية وتجميع مجموعة مصغرة الطارد. فحص التسرب المحتمل بالماء DI.
  6. ملء واحدة من الحقن مع 1 مل من محلول الحويصلية من الخطوة 2.4 و extruدي العينة عن طريق تمرير الحل لحقنة في الطرف الآخر من تجميع مصغرة الطارد. كرر 11 مرة.
  7. تشغيل الجسيمات الشحمية توليفها من خلال عمود تحلية PD-10 لإزالة الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية حرة والدهون وcalcein باستخدام برنامج تلفزيوني كما شاطف وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  8. تخزين العينات في أنابيب معقمة في 4 درجات مئوية واستخدامها في 2 يوما.

3. Calcein بيان من الليبوزومات تدفئة

  1. حساب المولية الدهون من محلول المخزون بجمع molarities من DPPC، MPPC، وDSPE-PEG2000 في الخطوة 2.2. تمييع الحل الأسهم الحويصلية إلى 5 ملي تركيز الدهون باستخدام 0.1 عازلة ملي برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). نقل العينات إلى أنبوب الطرد المركزي (2 مل).
  2. وضع الأنبوب في حمام الماء الساخن، ورفع درجة الحرارة تدريجيا 25-70 درجة مئوية. زيادة درجة الحرارة بمعدل 1 ° C / دقيقة هنا.
  3. جمع قسامات (10 ميكرولتر) في نقاط مختلفة في درجة الحرارة (27، 32، 37، 39، 41،43، 45، 52، 57، 62، 67 و 70 درجة مئوية).
  4. إضافة 10 ميكرولتر من 2٪ تريتون X-100-2 مل قسامة من حل liposomal لهضم الجسيمات الشحمية لمدة 10 دقيقة في RT وتحقيق الإفراج الكامل للcalcein.
  5. نقل 200 ميكرولتر من الحل liposomal إلى كل بئر في صفيحة 96 جيدا وقياس كثافة مضان من العينات التي تم جمعها باستخدام قارئ مضان صفيحة. الإثارة وانبعاث موجات من calcein هي 480 و 515 نانومتر على التوالي.
  6. أخذ كثافة مضان من تريتون X-100 عينة يعامل إطلاق 100٪، وحساب النسبة المئوية للcalcein صدر في كل نقطة زمنية، وذلك باستخدام المعادلة التالية:
    figure-protocol-4348
    قدم هو كثافة مضان من الحل في نقطة زمنية معينة. ط F و F س هي تطبيع كثافة مضان الأولية والنهائية من الحل على التوالي.

4. Calcein إعادةتأجير من الليبوزومات مع ليزر نابض

  1. نقل 100 ميكرولتر حل الحويصلية إلى كفيت الكوارتز ووضعه في حامل كوفيت. استخدام نابض الثانية: YAG الليزر مع مدة نبضة من 6 NSEC في 532 الطول الموجي نانومتر كمصدر للضوء. استخدم ما يلي المعلمات ليزر - معدل التكرار: 1 هرتز؛ كثافة طاقة الليزر: 1 ميغا جول / سم 2. شعاع قطره: 0.5 مم.
  2. توجيه شعاع ليزر موازى من خلال كفيت بحيث يمر الضوء من خلال حل الحويصلية وجمع قسامات بعد مختلف البقول.
  3. إضافة 10 ميكرولتر من 2٪ تريتون X-100-2 مل قسامة من حل liposomal لهضم الجسيمات الشحمية لمدة 10 دقيقة في RT وتحقيق الإفراج الكامل للcalcein.
  4. النظر calcein حساس للضوء، ويمكن أن يكون ابيض خلال التجربة الليزر، قبل قياس تأثير تبييض ليزر نابض على حل calcein لتطبيع البيانات من الإفراج الحويصلية.
    1. على وجه التحديد، فضح حل calcein (60 ملم) إلى واي ليزر نابضتردد التاسع من 1 هرتز لمدة متفاوتة نبض الأرقام (0، 25، 50 و 100). قياس كثافة مضان من calcein مع الإثارة وانبعاث موجات من 480 و 515 نانومتر على التوالي، وذلك قبل وبعد التعرض لليزر.
    2. حساب كمية تبيض (كثافة مضان من calcein قبل كثافة الليزر التعرض / مضان من calcein بعد عدد معين النبض). استخدام هذا العامل لتطبيع القيم التي تم الحصول عليها من عينات الحويصلية بضرب كثافة مضان من الجسيمات الشحمية مع عامل.
  5. قياس كثافة مضان من العينة التي تم جمعها باستخدام قارئ مضان صفيحة في الإثارة وانبعاث موجات في 480 و 515 نانومتر على التوالي.
  6. أخذ كثافة مضان من تريتون X-100 عينة يعامل إطلاق 100٪، وحساب النسبة المئوية للcalcein صدر في كل عدد النبض، وذلك باستخدام المعادلة التالية:
    figure-protocol-6578
    قدم هو كثافة مضان من الحل في عدد النبض تعطى بعد التطبيع. ط F و F س هي تطبيع كثافة مضان الأولية والنهائية من الحل على التوالي.

5. قياس النبضات الضغط

  1. وضع 100 ميكرولتر من العينة على شريحة مجهرية وتعيين تركيز الليزر على العينة.
  2. تزج مائي إبرة (قطر 1 ملم و 450 حساسية نيفادا / باسكال) إلى الحل.
    تحذير: يجب ألا تكون مضيئة ومائي بواسطة ضوء الليزر لتجنب الضرر.
  3. أشرق العينة مع ليزر نابض مع اختلاف الأرقام النبض (0-100) والطاقة النبض (20-160 μJ / نبض).
  4. تسجيل إشارات الضغط باستخدام الذبذبات الرقمية.

النتائج

تم إعداد الجسيمات الشحمية باستخدام تقنية رقيقة فيلم الترطيب التقليدية مع DPPC، MPPC وDSPE-PEG2000 في نسبة المولي من 86: 10: 4 أو 7.95: 0.65: 1.39 ملغ / مل 12 حجم الاتحاد الافريقي مصادر القدرة النووية أمر بالغ الأهمية لتحديد الضوء للحرارة كفاءة التحويل خلال التجربة ...

Discussion

رقيقة ترطيب الفيلم هو الأسلوب التقليدي لإعداد الجسيمات الشحمية. استخدمت المذيبات العضوية (كلوروفورم في هذه الحالة) أولا بحل الدهون ومن ثم إزالتها في المبخر الدوار عند 37 درجة مئوية لتوليد طبقة رقيقة الدهون في القارورة. كان رطب هذا الفيلم الدهون مع محلول مائي يحتوي عل?...

Disclosures

وأعلن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل جزئيا من قبل صناديق بحوث العلمية الشق 1 من سنغافورة وزارة التربية والتعليم (RG 64/12 إلى CX) ومعهد جامعة تايوان الوطنية-نورث وسترن من النانوي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)Avanti Polar Lipids (Alabama, US)850355PPowder, Store at -20 °C
1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC)Avanti Polar Lipids (Alabama, US)855675PPowder, Store at -20 °C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000)Avanti Polar Lipids (Alabama, US)880120PPowder, Store at -20 °C
Gold NanoparticlesSigma Aldrich752568-100mL5 nm particles, stabilized at 0.1 mM PBS
CalceinSigma AldrichC0875-10g60 mM, pH 7.4 (adjusted using NaOH)
phosphate buffered saline (PBS)Sigma AldrichP54930.1 mM, pH 7.4
Double distilled waterMillipore Milli-DI water purification system
Triton X100  Sigma, Life SciencesX-100To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation
Rotavapor  Buchi (Switzerland)R 210Used for Lipososme preparation
Heating bathBuchi (Switzerland)B 491Used for Lipososme preparation
Vacuum Controller  Buchi (Switzerland)V-850Used for Lipososme preparation
Vacuum PumpBuchi (Switzerland)V-700Used for Lipososme preparation
Recirculation bath with temperature controllerPolyscienceUsed for Lipososme preparation
Mini-extruder assembly with heating block Avanti Polar Lipids (Alabama, US)610000Used for extrusion of liposomes
Syringes, 1,000 μlAvanti Polar Lipids (Alabama, US)610017Used for extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 200 nmWhatmann800281Used for extrusion of liposomes
Filter SupportAvanti Polar Lipids (Alabama, US)610014Used for extrusion of liposomes
PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 mediumGE Healthcare, Life sciences17-0851-01Used to purify the liposomes
Centrifuge  Sigma Laboratory Centrifuges3K30Used to concentrate the liposomal solution 
RotorSigma19777-HUsed to concentrate the liposomal solution 
Zetasizer  Nano ZS MalvernUsed for the determination of liposome size and zetapotential
UV-Visible SpectrophotometerShimadzuUV-2450Used to measure the absorbance of the samples
Fluorescent Spectrofluorometer  Molecular DevicesSpectraMax M5Used to measure the fluorescence emission of the samples
Nd:YAG LaserNewWave Research532 nm; Maximum power: 17 mJ; Width: 406 nsec; Used for sample irradiation
HNR HydrophoneONDAHNR-10001 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals
Digital OsciloscopeLECORY - Wave Runner 64Xi-AFrequency: 600 MHz; Max sample rate: 10 Gs/sec (at two channel); Used to record the measured acoustic signals

References

  1. McCoy, C. P., et al. Triggered drug delivery from biomaterials. Expert Opin. Drug Deliv. 7 (5), 605-616 (2010).
  2. Yavuz, M. S., et al. Gold nanocages covered by smart polymers for controlled release with near-infrared light. Nat. Mater. 8 (12), 935-939 (2009).
  3. Gohy, J. F., Zhao, Y. Photo-responsive block copolymer micelles: design and behavior. Chem. Soc. Rev. 42 (17), 7117-7129 (2013).
  4. Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat. Mater. 10 (4), 324-332 (2011).
  5. Needham, D., Dewhirst, M. W. The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors. Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (3), 285-305 (2001).
  6. Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. Nanoscale drug delivery and hyperthermia: the materials design and preclinical and clinical testing of low temperature-sensitive liposomes used in combination with mild hyperthermia in the treatment of local cancer. Open Nanomed. J. 3, 38-64 (2011).
  7. Sykes, E. A., Dai, Q., Tsoi, K. M., Hwang, D. M., Chan, W. C. Nanoparticle exposure in animals can be visualized in the skin and analysed via skin biopsy. Nat. Commun. 5, 3796 (2014).
  8. Paasonen, L., et al. Gold nanoparticles enable selective light-induced contents release from liposomes. J. Control. Release. 122 (1), 86-93 (2007).
  9. Wu, G., et al. Remotely Triggered Liposome Release by Near-Infrared Light Absorption via Hollow Gold Nanoshells. J. Am. Chem. Soc. 130 (26), 8175-8177 (2008).
  10. Leung, S. J., Kachur, X. M., Bobnick, M. C., Romanowski, M. Wavelength-Selective Light-Induced Release from Plasmon Resonant Liposomes. Adv. Funct. Mater. 21 (6), 1113-1121 (2011).
  11. Volodkin, D. V., Skirtach, A. G., Möhwald, H. Near-IR Remote Release from Assemblies of Liposomes and Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (10), 1807-1809 (2009).
  12. Mills, J. K., Needham, D. Lysolipid incorporation in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membranes enhances the ion permeability and drug release rates at the membrane phase transition. Biochim. Biophys. Acta. 1716 (2), 77-96 (2005).
  13. Jiang, K., Smith, D. A., Pinchuk, A. O. Size-dependent Photothermal Conversion Efficiencies of Plasmonically Heated Gold Nanoparticles. J. Phys. Chem. C. 117 (51), 27073-27080 (2013).
  14. Chongsiriwatana, N., Barron, A., Giuliani, A., Rinaldi, A. C. Comparing bacterial membrane interaction of antimicrobial peptides and their mimics. Antimicrobial Peptides. 618, 171-182 (2010).
  15. Egerev, S., et al. Acoustic signals generated by laser-irradiated metal nanoparticles. Appl. Opt. 48 (7), C38-C45 (2009).
  16. González, M. G., Liu, X., Niessner, R., Haisch, C. Strong size-dependent photoacoustic effect on gold nanoparticles by laser-induced nanobubbles. Appl. Phys. Lett. 96, 174104 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

108 microbubble

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved