Synthese von Gold-Nanopartikeln Integrated Photo-responsive Liposomen und Messung ihrer Mikroblasen Kavitation auf Pulse Laseranregung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Herstellungsmethode für Gold-Nanopartikel integriert fotoempfindlichen Liposome mit den im Handel erhältlichen Materialien. Es zeigt auch, wie die Mikrobläschen Kavitationsprozess der synthetisierten Liposomen bei der Behandlung von gepulsten Laser zu messen.

Zusammenfassung

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

Einleitung

Die Möglichkeit, Arzneimittel-Freisetzung durch externe Stimuli ausgelöst wird eine attraktive Möglichkeit, die Drogen in räumlich, zeitlich-und Dosierung gesteuerten Moden mit maximierter Spezifität und minimalen Nebenwirkungen zu liefern. Unter einer Vielzahl von exogenen Stimuli reagierende Systeme (Licht, Magnetfeld, Ultraschall, Mikrowellen-Strahlung), lichtgesteuerten Plattformen sind attraktiv, wegen ihrer Nicht-Invasivität, Einfachheit und Anpassungsfähigkeit in den Kliniken. ¹ Umfangreiche Forschung in den letzten zehn Jahren eine Vielzahl von Plattformtechnologien, wie beispielsweise im nahen Infrarot-Licht verantwortlich Gold (Au) Nanokäfige beschichtet mit intelligenten Polymeren, ^zwei Foto-labile polymere Nanopartikel (NP) konjugiert mit ^{Drogen, 3 und} selbstorganisierten porphysome Nanovesikeln zur Verfügung gestellt hat. ⁴ jedoch sind diese Technologien noch in den präklinischen Entwicklungsstadien, und ein klares Verständnis und die Optimierung der Parameter in den Prozess der Einleitung und Fortsetzung beteiligt erfordernWalzen der Wirkstofffreisetzung.

Eine der einfachsten und leicht zugängliche Verfahren zur Herstellung eines solchen Systems ist Gold-Nanopartikeln mit wärmeempfindlichen Liposomen ^5,6, von denen beide weithin auf dem Markt verfügbar sind, zu integrieren und haben in präklinischen und klinischen Studien noch ausgiebig untersucht worden. Trotz der Beschränkung der tiefen Gewebe Aktivierung von Gold-Nanopartikeln an ihren plasmonischer Wellenlänge im Vergleich zu im nahen Infrarotbereich aktiviert Au-Nanostrukturen (zB Nanokäfige), dieses System hält immer noch sehr vielversprechend, wenn bei Kleintieren oder für topische Verabreichung beim Menschen eingesetzt. ⁷ Es gibt einige frühe Bemühungen in Kombination Gold-Nanopartikeln mit Liposomen für Licht ausgelöste Freisetzung. ^8-11 Während die meisten von ihnen auf der Neuheit von Materialien konzentrieren, Zugänglichkeit und Skalierbarkeit Probleme müssen angegangen werden. Darüber hinaus Berichte über Freigabemechanismen dieser Nanotransporter verwenden, sind noch begrenzt.

Hierbei ist die Herstellung von fotoempfindlichenLiposomen gleichzeitig mit Drogen und hydrophilen Gold-Nanopartikel geladen ist beschrieben worden. Calcein wird als Modellverbindung verwendet, um die Verkapselungseffizienz und das Freisetzungsprofil des Systems zu bewerten. Zusätzlich wird in diesem System Licht, das von Gold-Nanopartikeln absorbiert leitet an die umgebende Mikroumgebung in Form von Wärme, was zu einer Erhöhung der lokalen Temperatur. Luftmikrobläschen während der Lasererhitzung und verursachen mechanische Zerstörung von Liposomen (Figur 1) erzeugt. Der Mechanismus der Mikrobläschen Kavitation wird durch Hydrophonmessungen bestätigt.

Protokoll

1. Vorbereitung

1. Saubere 100 ml Rundkolben mit Königswasser (1 Teil konzentrierter Salpetersäure _(HNO3) und 3 Teilen konzentrierter Salzsäure (HCl)) und waschen Sie die Flaschen mit DI-Wasser. Autoklavieren der Kolben und trocknen Sie sie in einem Heißluftofen bei 100 ° C für 15 min. Wickeln Sie und speichern Sie die sterile Fläschchen bis zur Verwendung.
2. Sterilisieren des Hand Mini-Extruder Satz mit 70% Ethanol.
3. Schalten Sie den Rotationsverdampfer und stellen Sie die Temperatur des heißen Wasserbad und den Kühlturm bei 37 ° C und 4 ° C auf.
4. Vorbereitung 60 mM Calcein Stammlösung durch Auflösen von 374 mg von Calcein in 10 ml von 0,1 mM phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (pH 7,4). Den pH-Wert auf 7,4 mit 1 M Natriumhydroxid (NaOH) -Lösung.

2. Synthese von Liposomen

1. Entfernen der Lipide (1,2-Dipalmitoyl- sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC), 1-Palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphochoLeitung (MPPC) und 1, 2-Distearoyl- sn-glycero-3-phosphoethanol-Amin- N - [Carboxy (Polyethylenglykol) -2000] (Ammoniumsalz) (DSPE-PEG2000)) aus dem Gefrierschrank (-20 ° C) und tauen sie auf RT.
2. Wiegen 15,9 mg DPPC, 1,3 mg gängigste Preisklasse und 2,8 mg DSPE-PEG2000. Man löst sie in 2 ml Chloroform zusammen.
3. Übertragen der Chloroform-Lösung in den sterilen Kolben mit rundem Boden und verdampfe das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck unter Verwendung eines dünnen, trockenen Lipidschicht zu bilden.
4. Hydrat der Lipidschicht bei 45 ° C mit 2 ml wässrige Lösung 30 min enthält, 1,95 ml 60 mM Calcein, hergestellt in Schritt 1,4 und 50 & mgr; l Gold-Nanopartikel (3,36 ^{× 10 16} Partikel / ml).
5. Vorheizen Heizblock auf 45 ° C. Legen Sie eine 200 nm Polycarbonat-Membranfilter zwischen den Filterträger und montieren Sie den Mini-Extruder-Set. Schauen Sie sich die möglichen Leckagen mit DI-Wasser.
6. Füllen einer der Spritzen mit 1 ml Liposomenlösung aus Schritt 2.4 und EXTRUde der Probe, indem die Lösung auf die Spritze am anderen Ende des zusammen Mini-Extruder verläuft. Wiederholen Sie 11 mal.
7. Führen Sie die synthetisierten Liposomen durch eine PD-10 Entsalzungssäule der freien Gold-Nanopartikeln, Lipide und Calcein unter Verwendung von PBS als Laufmittel zu entfernen, dem Protokoll des Herstellers nach.
8. Lagern Sie die Proben in sterilen Röhrchen bei 4 ° C und in 2 Tagen nutzen.

3. Calceinfreisetzung von Liposomen mit Heizung

1. Berechnen der Lipid Molarität der Vorratslösung durch die Molaritäten von DPPC, MPPC Addition und DSPE-PEG2000 in Schritt 2.2. Verdünne die Liposomenstammlösung zu 5 mM Lipidkonzentration unter Verwendung von 0,1 mM PBS-Puffer (pH 7,4). Übertragen Sie die Proben in ein Zentrifugenröhrchen (2 ml).
2. Das Röhrchen wird in ein heißes Wasserbad, und erhöhen die Temperatur nach und nach von 25 bis 70 ° C. Erhöhen der Temperatur mit einer Geschwindigkeit von 1 ° C / min zu.
3. Sammeln Aliquots (10 ul) bei verschiedenen Temperaturpunkten (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 und 70 ° C).
4. Zugabe von 10 ul 2% Triton X-100 2 ml Aliquot von liposomalen Lösung, die die Liposomen für 10 min bei RT zu verdauen und vollständigen Freisetzung von Calcein zu erzielen.
5. Übertragen Sie 200 ul der liposomalen Lösung in jede Vertiefung der 96-Well-Mikroplatten und messen die Fluoreszenzintensität der gesammelten Proben eine Fluoreszenz-Mikroplattenlese verwenden. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen von Calcein sind 480 und 515 nm auf.
6. Unter dem Fluoreszenzintensität der Triton X-100 behandelten Proben als 100% Release, berechnen den Anteil des frei Calcein zu jedem Zeitpunkt, nach der Formel:
   
   Ft ist die Fluoreszenzintensität bei einer gegebenen Zeitpunkt Lösung. F _i und F _x die normalisierten Anfangs- und End-Fluoreszenzintensitäten der Lösung sind.

4. Calcein ReLeasing von Liposomen mit Pulsed Laser

1. Übertragen Sie 100 ul Liposomen-Lösung zu einer Quarzküvette und legen Sie sie in einem Küvettenhalter. Verwenden eines gepulsten Nd: YAG-Laser mit einer Pulsdauer von 6 ns bei 532 nm Wellenlänge als Lichtquelle. Verwenden Sie das folgende Laserparameter - Wiederholungsrate: 1 Hz; Laserenergiedichte: 1 mJ / cm ^2; Strahldurchmesser: 0,5 mm.
2. Führe den kollimierten Laserstrahl durch die Küvette so dass das Licht durch die Liposomenlösung und sammeln Aliquots nach verschiedenen Impulse.
3. Zugabe von 10 ul 2% Triton X-100 2 ml Aliquot von liposomalen Lösung, die die Liposomen für 10 min bei RT zu verdauen und vollständigen Freisetzung von Calcein zu erzielen.
4. Calcein Anbetracht ist lichtempfindlich und können während der Laser Experiment Prämaß der bleichenden Wirkung gepulster Laser auf Calcein Lösung zur Normalisierung der Daten von Liposomenfreigabe gebleicht werden.
   1. Insbesondere Calcein-Lösung (60 mM) auf gepulste Laser wi aussetzenth Frequenz von 1 Hz für variierende Impulszahlen (0, 25, 50 und 100). Messen der Fluoreszenzintensität von Calcein mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 480 und 515 nm jeweils vor und nach der Laserbelichtung.
   2. Berechnen Sie die Menge an Bleich (Fluoreszenzintensität von Calcein vor der Laserbelichtung / Fluoreszenzintensität von Calcein nach dem spezifischen Impulszahl). Verwenden dieser Faktor die Werte aus Liposom erhaltenen Proben zu normalisieren, indem die Fluoreszenzintensität der Liposomen mit dem Faktor multipliziert wird.
5. Messen der Fluoreszenzintensität des aufgefangenen Probe eine Fluoreszenzmikroplattenlesegerät bei Anregungs- und Emissionswellenlängen bei 480 und 515 nm unter Verwendung von jeweils.
6. Unter dem Fluoreszenzintensität der Triton X-100 behandelten Proben als 100% Release, berechnen den Anteil des frei Calcein bei jedem Pulszahl, nach der Formel:
   
   Ft ist die Fluoreszenzintensität bei einer bestimmten Impulszahl nach Normalisierung der Lösung. F _i und F _x die normalisierten Anfangs- und End-Fluoreszenzintensitäten der Lösung sind.

5. Messung der Druckimpulse

1. Zeigen 100 ul der Probe auf einen Objektträger und den Fokus des Lasers auf die Probe.
2. Tauchen eine Nadel Hydrophon (1 mm Durchmesser und 450 nV / Pa Empfindlichkeit) in die Lösung.
   Achtung: Das Hydrophon darf nicht durch das Laserlicht beleuchtet werden, um die Beschädigungen zu vermeiden.
3. Bestrahlen der Probe mit dem gepulsten Laser mit unterschiedlichen Impulszahlen (0-100) und Pulsenergie (20-160 & mgr; J / Impuls).
4. Nehmen Sie die Drucksignale ein digitales Oszilloskop.

Ergebnisse

10: 4 oder 7,95: 0,65: Liposomen wurden in einem Molverhältnis von 86 ein herkömmliches Dünnfilm Hydratation Technik mit DPPC, MPPC und DSPE-PEG2000 aufgestellt. 1,39 mg / ml ¹² Die Größe der Gold-Nanopartikel ist entscheidend, das Licht zu ermitteln, Umwandlungswirkungsgrad während des folgenden Laseranregung Experiment zu erhitzen. Kleiner die Größe von Gold-Nanopartikeln, höher ist die Wandlereffizienz. ¹³ So 5 nm Gold-Nanopartikeln, die kleinsten Proben...

Diskussion

Dünnfilmflüssigkeitszufuhr ist das herkömmliche Verfahren zur Herstellung von Liposomen. Organische Lösemittel (Chloroform in diesem Fall) wurden zuerst verwendet, um die Lipide zu lösen und dann bei 37 ° C in einem Rotationsverdampfer entfernt, um einen Lipid-Dünnfilm auf dem Kolben zu erzeugen. Dieser Lipidfilm wurde mit der wässrigen Lösung hydratisiert 60 mM Calcein und 5 nm Gold-Nanopartikeln enthält. Während des Hydrationsvorganges wurde die Temperatur etwa 50 ° C gehalten und der Kolben wurde ständig...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	850355P	Powder, Store at -20 °C
1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	855675P	Powder, Store at -20 °C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	880120P	Powder, Store at -20 °C
Gold Nanoparticles	Sigma Aldrich	752568-100mL	5 nm particles, stabilized at 0.1 mM PBS
Calcein	Sigma Aldrich	C0875-10g	60 mM, pH 7.4 (adjusted using NaOH)
phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493	0.1 mM, pH 7.4
Double distilled water	Millipore Milli-DI water purification system
Triton X100	Sigma, Life Sciences	X-100	To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation
Rotavapor	Buchi (Switzerland)	R 210	Used for Lipososme preparation
Heating bath	Buchi (Switzerland)	B 491	Used for Lipososme preparation
Vacuum Controller	Buchi (Switzerland)	V-850	Used for Lipososme preparation
Vacuum Pump	Buchi (Switzerland)	V-700	Used for Lipososme preparation
Recirculation bath with temperature controller	Polyscience		Used for Lipososme preparation
Mini-extruder assembly with heating block	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610000	Used for extrusion of liposomes
Syringes, 1,000 μl	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610017	Used for extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 200 nm	Whatmann	800281	Used for extrusion of liposomes
Filter Support	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610014	Used for extrusion of liposomes
PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 medium	GE Healthcare, Life sciences	17-0851-01	Used to purify the liposomes
Centrifuge	Sigma Laboratory Centrifuges	3K30	Used to concentrate the liposomal solution
Rotor	Sigma	19777-H	Used to concentrate the liposomal solution
Zetasizer	Nano ZS Malvern		Used for the determination of liposome size and zetapotential
UV-Visible Spectrophotometer	Shimadzu	UV-2450	Used to measure the absorbance of the samples
Fluorescent Spectrofluorometer	Molecular Devices	SpectraMax M5	Used to measure the fluorescence emission of the samples
Nd:YAG Laser	NewWave Research		532 nm; Maximum power: 17 mJ; Width: 406 nsec; Used for sample irradiation
HNR Hydrophone	ONDA	HNR-1000	1 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals
Digital Osciloscope	LECORY - Wave Runner 64Xi-A		Frequency: 600 MHz; Max sample rate: 10 Gs/sec (at two channel); Used to record the measured acoustic signals