Síntesis de nanopartículas de oro liposomas Integrado fotosensible y la medición de su microburbujas cavitación al pulso láser de excitación

Resumen

Este protocolo describe un método de preparación sencilla para nanopartículas de oro liposomas fotosensible integrado con los materiales disponibles en el mercado. También muestra cómo medir el proceso de cavitación de las microburbujas de los liposomas sintetizados en el tratamiento de láser pulsado.

Resumen

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

Introducción

La posibilidad de desencadenar la liberación del fármaco mediante estímulos externos es una forma atractiva para entregar los medicamentos en las modas espacialidad, temporalidad y dosificación controlada con especificidad maximizada y efectos adversos mínimos. Entre una amplia gama de sistemas exógenos estímulos que responden (la luz, el campo magnético, ultrasonido, radiación de microondas), plataformas de luz provocada son atractivos, debido a su carácter no invasivo, la sencillez y la adaptabilidad en las clínicas. ¹ Una amplia investigación en la última década ha proporcionado una variedad de tecnologías de plataforma, como el oro responsables del infrarrojo cercano luz (Au) nano-cajas recubiertas con polímeros inteligentes, ^2, nanopartículas poliméricas foto-lábil (NPS) conjugados con ^fármacos, 3 y nanovesículas porphysome autoensambladas. ⁴ Sin embargo , estas tecnologías están aún en las etapas preclínicas de desarrollo, y requieren una comprensión clara y optimización de los parámetros que intervienen en el proceso de iniciar y controdar la liberación del fármaco.

Uno de los métodos más simples y de fácil acceso para la preparación de un sistema de este tipo es la integración de Au NPs con liposomas térmicamente sensibles ^5,6, ambos de los cuales están ampliamente disponibles en el mercado y han sido ampliamente investigados en ensayos preclínicos y clínicos aún. A pesar de la limitación de la activación de tejido profundo de Au NPs en su longitud de onda plasmónica, en comparación con Au nanoestructuras del infrarrojo cercano activado (por ejemplo, nano-cajas), este sistema todavía una gran promesa cuando se utiliza en animales pequeños o para la administración tópica en los seres humanos. ⁷ Hay algunos esfuerzos tempranos en la combinación de Au PN con liposomas para la liberación luz disparado. ^8-11 Si bien la mayoría de ellos se centran en la novedad de los materiales, los problemas de accesibilidad y escalabilidad deben ser abordados. Por otra parte, los informes sobre los mecanismos de liberación que utilizan estos nanoportadores son todavía limitados.

En este documento, la fabricación de foto-sensibleliposomas, cargados simultáneamente con las drogas y el hidrófilos Au NPs se ha descrito. Calceína se utiliza como un compuesto modelo para evaluar la eficacia de encapsulación y el perfil de liberación del sistema. Además, en este sistema, la luz absorbida por Au NPs disipa al microambiente que rodea en forma de calor, lo que resulta en un aumento de la temperatura local. Microburbujas de aire se generan durante el calentamiento por láser y causan la rotura mecánica de liposomas (Figura 1). El mecanismo de la cavitación de las microburbujas se confirmó por mediciones de hidrófonos.

Protocolo

1. Preparación

1. Limpias redondo de 100 ml matraces de fondo utilizando agua regia (1 parte de ácido nítrico concentrado (HNO _{3) y} 3 partes de ácido clorhídrico concentrado (HCl)) y lavar los frascos con agua DI. Autoclave los frascos y se secan en un horno de aire caliente a 100 ° C durante 15 minutos. Envolver y almacenar los frascos estériles hasta su uso.
2. Esterilizar el conjunto de mini-extrusora de mano utilizando etanol al 70%.
3. Encienda el evaporador rotatorio y ajustar la temperatura del baño de agua caliente y la torre de refrigeración a 37 ° C y 4 ° C, respectivamente.
4. Preparar 60 mM de calceína solución madre disolviendo 374 mg de calceína en 10 ml de 0,1 mM solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,4). Ajustar el pH a 7,4 utilizando solución 1 M de hidróxido sódico (NaOH).

2. Síntesis de liposomas

1. Retire los lípidos (1,2-sn Dipalmitoyl- glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3 phosphocholínea (MPPC) y 1, 2-distearoyl- sn -glicero-3-phosphoethanol-amina N - [carboxi (polietilenglicol) -2.000] (sal de amonio) (DSPE-PEG2000)) del congelador (-20 ° C) y descongelar a temperatura ambiente.
2. Pesar 15,9 mg de DPPC, 1,3 mg MPPC, y 2,8 mg de DSPE-PEG2000. Disolverlos juntos en 2 ml de cloroformo.
3. Transferir la solución de cloroformo al matraz de fondo redondo estériles y se evapora el disolvente usando un evaporador rotatorio a presión reducida, para formar una capa fina de lípido seco.
4. Hidratar la capa de lípidos a 45 ° C con una solución acuosa 2 ml de 30 min que contiene 1,95 ml 60 mM de calceína preparado en la etapa 1.4 y 50 l de Au NPs (3,36 × 10 ¹⁶ partículas / ml).
5. Pre-calentar el bloque de calentamiento a 45 ° C. Colocar un filtro de membrana de policarbonato de 200 nm entre los soportes de filtro y montar el conjunto de mini-extrusora. Compruebe la posibilidad de fugas de agua DI.
6. Llenar una de las jeringas con 1 ml de solución de liposomas de la etapa 2.4 y Extrude la muestra por paso de la solución a la jeringa en el otro extremo de la montar mini-extrusora. Repetir 11 veces.
7. Ejecutar los liposomas sintetizados a través de una columna de desalación PD-10 para eliminar las gratuito Au NPs, lípidos y calceína utilizando PBS como eluyente según el protocolo del fabricante.
8. Almacenar las muestras en tubos estériles a 4 ° C y el uso en 2 días.

3. calceína lanzamiento de liposomas con calefacción

1. Calcular la moralidad de los lípidos de la solución madre mediante la suma de los molaridad de DPPC, MPPC, y DSPE-PEG2000 en el paso 2.2. Se diluye la solución de liposomas de valores para la concentración de lípidos 5 mM utilizando tampón PBS 0,1 mM (pH 7,4). Transferir las muestras a un tubo de centrífuga (2 ml).
2. Se coloca el tubo en un baño de agua caliente, y aumentar gradualmente la temperatura de 25 a 70 ° C. Aumentar la temperatura a una velocidad de 1 ° C / min aquí.
3. Recoger alícuotas (10 l) a diferentes puntos de temperatura (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 y 70 ° C).
4. Añadir 10 l de 2% de Triton X-100 alícuota de 2 ml de la solución liposomal de digerir los liposomas durante 10 min a RT y para conseguir la liberación completa de calceína.
5. Transferir 200 l de la solución liposomal a cada pocillo en la microplaca de 96 pocillos y se mide la intensidad de fluorescencia de las muestras recogidas utilizando un lector de microplacas de fluorescencia. Las longitudes de onda de excitación y emisión de calceína son 480 y 515 nm, respectivamente.
6. Tomando la intensidad de fluorescencia de las muestras tratadas Triton X-100 como 100% de liberación, calcular el porcentaje de la calceína liberada en cada punto de tiempo, utilizando la fórmula:
   
   Ft es la intensidad de fluorescencia de la solución en un punto de tiempo dado. F _{I y} F _x son las intensidades de fluorescencia inicial y final normalizadas de la solución, respectivamente.

4. Re calceínaarrendamiento de liposomas con láser pulsado

1. Transferir la solución de liposoma 100 l a una cubeta de cuarzo y colocarlo en un soporte de cubetas. Utilice un láser pulsado de Nd: YAG con una duración de pulso de 6 ns a 532 nm de longitud de onda como fuente de luz. Utilice los siguientes parámetros láser - Frecuencia de repetición: 1 Hz; Densidad de energía del láser: 1 mJ / cm ^2; diámetro del haz: 0,5 mm.
2. Guía del rayo láser colimado a través de la cubeta de tal manera que la luz pasa a través de la solución de liposomas y recoger alícuotas después de varios impulsos.
3. Añadir 10 l de 2% de Triton X-100 alícuota de 2 ml de la solución liposomal de digerir los liposomas durante 10 min a RT y para conseguir la liberación completa de calceína.
4. Teniendo en cuenta calceína es sensible a la luz y puede ser blanqueada durante el experimento láser, pre-medir el efecto de blanqueo de láser de impulsos en solución de calceína para normalizar los datos de liberación de liposomas.
   1. En concreto, exponer solución de calceína (60 mM) para wi láser pulsadoTH frecuencia de 1 Hz para un número variable de impulsos (0, 25, 50 y 100). Medir la intensidad de fluorescencia de calceína con excitación y emisión de longitudes de onda 480 y 515 nm, respectivamente, antes y después de la exposición de láser.
   2. Calcular la cantidad de blanqueo (intensidad de la fluorescencia de calceína antes de la intensidad del láser de exposición / fluorescencia de calceína después de que el número de impulsos específico). Usar este factor para normalizar los valores obtenidos de muestras de liposomas multiplicando la intensidad de fluorescencia de los liposomas con el factor.
5. Medir la intensidad de fluorescencia de la muestra recogida usando un lector de microplacas de fluorescencia a longitudes de onda de excitación y emisión a 480 y 515 nm, respectivamente.
6. Tomando la intensidad de fluorescencia de las muestras tratadas Triton X-100 como 100% de liberación, calcular el porcentaje de la calceína liberada en cada número de impulsos, mediante la fórmula:
   
   Ft es la intensidad de fluorescencia de la solución a un número de impulsos dado después de la normalización. F _{I y} F _x son las intensidades de fluorescencia inicial y final normalizadas de la solución, respectivamente.

5. Medición de los impulsos de presión

1. Coloque 100 l de la muestra en un portaobjetos microscópico y ajustar el enfoque del láser sobre la muestra.
2. Sumergir un hidrófono aguja (diámetro de 1 mm y 450 sensibilidad nV / Pa) en la solución.
   Precaución: El hidrófono no debe estar iluminada por la luz láser para evitar el daño.
3. Irradiar la muestra con el láser de impulsos con un número variable de impulsos (0-100) y la energía de impulsos (20 a 160 mu J / pulso).
4. Grabar las señales de presión utilizando un osciloscopio digital.

Resultados

Los liposomas se prepararon usando una técnica de hidratación de película delgada convencional con DPPC, MPPC y DSPE-PEG2000 en una relación molar de 86: 10: 4 o 7,95: 0,65:. 1,39 mg / ml ¹² El tamaño de Au NPs es crítica para determinar la luz para calentar la eficiencia de conversión durante el siguiente experimento de excitación láser. Más pequeño es el tamaño de Au PN, mayor es la eficiencia de transducción. ¹³ Por lo tanto 5 nm Au PN, las muestras ...

Discusión

hidratación de película delgada es el método convencional para la preparación de liposomas. disolventes orgánicos (cloroformo en este caso) se utilizó por primera vez para disolver los lípidos y luego se retiraron en un evaporador rotatorio a 37 ° C para generar una fina película lipídica en el matraz. Esta película de lípido se hidrató con la solución acuosa que contiene 60 mM de calceína y 5 nm Au NPs. Durante el proceso de hidratación, la temperatura se mantuvo alrededor de 50 ° C y el matraz se agit...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	850355P	Powder, Store at -20 °C
1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	855675P	Powder, Store at -20 °C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000)	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	880120P	Powder, Store at -20 °C
Gold Nanoparticles	Sigma Aldrich	752568-100mL	5 nm particles, stabilized at 0.1 mM PBS
Calcein	Sigma Aldrich	C0875-10g	60 mM, pH 7.4 (adjusted using NaOH)
phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5493	0.1 mM, pH 7.4
Double distilled water	Millipore Milli-DI water purification system
Triton X100	Sigma, Life Sciences	X-100	To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation
Rotavapor	Buchi (Switzerland)	R 210	Used for Lipososme preparation
Heating bath	Buchi (Switzerland)	B 491	Used for Lipososme preparation
Vacuum Controller	Buchi (Switzerland)	V-850	Used for Lipososme preparation
Vacuum Pump	Buchi (Switzerland)	V-700	Used for Lipososme preparation
Recirculation bath with temperature controller	Polyscience		Used for Lipososme preparation
Mini-extruder assembly with heating block	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610000	Used for extrusion of liposomes
Syringes, 1,000 μl	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610017	Used for extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 200 nm	Whatmann	800281	Used for extrusion of liposomes
Filter Support	Avanti Polar Lipids (Alabama, US)	610014	Used for extrusion of liposomes
PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 medium	GE Healthcare, Life sciences	17-0851-01	Used to purify the liposomes
Centrifuge	Sigma Laboratory Centrifuges	3K30	Used to concentrate the liposomal solution
Rotor	Sigma	19777-H	Used to concentrate the liposomal solution
Zetasizer	Nano ZS Malvern		Used for the determination of liposome size and zetapotential
UV-Visible Spectrophotometer	Shimadzu	UV-2450	Used to measure the absorbance of the samples
Fluorescent Spectrofluorometer	Molecular Devices	SpectraMax M5	Used to measure the fluorescence emission of the samples
Nd:YAG Laser	NewWave Research		532 nm; Maximum power: 17 mJ; Width: 406 nsec; Used for sample irradiation
HNR Hydrophone	ONDA	HNR-1000	1 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals
Digital Osciloscope	LECORY - Wave Runner 64Xi-A		Frequency: 600 MHz; Max sample rate: 10 Gs/sec (at two channel); Used to record the measured acoustic signals