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摘要

这个协议描述了金纳米颗粒集成光响应的脂质体与市售材料的简单制备方法。这也说明了如何在脉冲激光治疗测量合成脂质体的微泡空化进程。

摘要

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

引言

可能使用外部的刺激是一个有吸引力的方式为客户提供药物以最大的特异性和最小的不利影响spatial-，temporal-和剂量控制的时装来触发药物释放。之间广泛的外源刺激响应系统（光，磁场，超声波，微波辐射），光触发的平台是有吸引力的，因为它们的非侵入性，简便性和适应性的诊所。在过去的十年1广泛的研究已经提供了各种平台技术，例如近红外光负责金的涂有智能聚合物（Au）的纳米笼，用药物，3和自组装porphysome纳米囊泡共轭2对光不稳定的，聚合物纳米颗粒（纳米颗粒）。4但是这些技术仍处于发展的临床前阶段，要求参与发起和续的工艺参数清醒的认识和优化滚动药物的释放。

一种用于制备这种系统的最简单和方便的方法是对金纳米粒子与热敏感脂质体5,6，这两者都是在市场上广泛使用，并已在临床前和甚至临床试验被广泛地研究集成。尽管金纳米粒子的深层组织活化的在其电浆波长的限制，相对于近红外活化的Au纳米结构（例如，纳米笼），在小动物或用于人类局部递送时使用该系统仍然保持很大的希望。 7中有金纳米粒子与脂质体相结合的用于光触发释放一些早期的努力。8-11虽然大多集中在材料的新颖性，需要解决可访问性和可扩展性的问题。此外，在使用这些纳米载体释放机构的报告仍然有限。

这里，在制造光响应脂质体，同时装载有药物和亲水性金纳米粒子已经描述。钙黄绿素被用作模型化合物以评价包封效率和系统的释放曲线。另外，在这个系统中，由金纳米粒子吸收的光消散至以热的形式的周围的微环境，从而增加在局部温度。空气微泡是在激光加热过程中产生的，并引起的脂质体（图1）的机械破坏。微泡空化的机制是由水听器测量证实。

研究方案

1.准备

  1. 干净的100毫升园使用王水（浓硝酸1份（HNO 3）和3份浓盐酸（HCl）的）中，用DI水冲洗烧瓶底部的烧瓶中。高压灭菌的烧瓶中并在100℃干燥它们在热空气烘箱中15分钟。换并存储无菌瓶中直至使用。
  2. 消毒用70％的乙醇手持微型挤出集。
  3. 打开旋转蒸发器和分别在37℃和4℃设置热水浴中冷却塔的温度。
  4. 由374毫克的钙黄绿素溶解在0.1毫10毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）中制备60mM的钙黄绿素储备溶液。调整使用1M氢氧化钠（NaOH）溶液的pH至7.4。

2.脂质体的合成

  1. 除去脂质（1,2- Dipalmitoyl- SN -glycero -3-磷酸胆碱（DPPC），1-棕榈酰-2-羟基- SN -glycero -3- phosphocho线（MPPC）和1，2- distearoyl- SN -glycero -3- phosphoethanol-胺-N - [羧基（聚乙二醇）-2000]（铵盐）（DSPE-PEG2000））从冷冻机（-20℃）和它们解冻至室温。
  2. 称重15.9毫克DPPC，1.3毫克MPPC，和2.8毫克DSPE-PEG2000。在2ml氯仿溶解在一起。
  3. 转移氯仿溶液至无菌圆底烧瓶中，并用减压旋转蒸发器，以形成一个薄的，干的脂质层蒸发溶剂。
  4. 水合在45℃用2ml水溶液脂质层含有1.95毫升60毫钙黄绿素在步骤1.4和50微升金纳米粒子（3.36×10 16个粒子/ ml）中制备30分钟。
  5. 预加热加热块至45℃。放置过滤器支撑件之间的200纳米的聚碳酸酯膜过滤器，并装配微型挤出集。检查用DI水的潜在泄漏。
  6. 填用1ml脂质体溶液的注射器中的一个来自步骤2.4和extru德通过将溶液的注射器在装配微型挤出机的另一端的样品。重复11次。
  7. 通过将PD-10脱盐柱运行合成脂质体以除去游离的金纳米粒子，脂质和钙黄绿素使用PBS作为根据制造商的协议洗脱剂。
  8. 存储在无菌试管中的样品在4℃和在2天内使用。

3.从黄绿素脂质体释放暖气

  1. 通过在步骤2.2相加DPPC，MPPC，和DSPE-PEG2000的摩尔浓度计算原液的脂质摩尔浓度。稀释脂质储备溶液用0.1毫的PBS缓冲液（pH 7.4）的5mM脂质浓度。转移样品到离心管（2毫升）中。
  2. 放置在管中的热水浴中，逐步提高温度从25到70℃。提高温度以1℃/分钟此处的速率。
  3. 在不同的温度点（27，32，37，39，41等分收集（10微升），43，45，52，57，62，67和70°C）。
  4. 添加10微升的脂质体溶液2％的Triton X-100至2ml等分试样的消化脂质体在室温下10分钟，以实现钙黄绿素的完全释放。
  5. 转移200微升脂质体溶液，以每孔在96孔微量并测量使用荧光酶标仪所收集样品的荧光强度。钙黄绿素的激发和发射波长分别为480和515纳米。
  6. 服用的Triton X-100处理的样品为100％的释放的荧光强度，计算在每个时间点所释放的钙黄绿素的百分比，利用下式:
    figure-protocol-1562
    Ft是在给定时间点的溶液的荧光强度。 的 F i和F x分别溶液分别归一化的初始和最终的荧光强度。

4.重新钙黄绿从脂质体与脉冲激光租赁

  1. 转移100微升脂质体溶液到石英比色皿，并将其放置在一个试管支架。使用脉冲Nd:YAG激光在波长532nm作为光源的6毫微秒的脉冲持续时间。使用下面的参数激光 - 重复率:1赫兹;激光的能量密度:1毫焦/厘米2;光束直径:0.5毫米。
  2. 通过试管引导准直激光束，使得光穿过脂质体溶液和各种脉冲之后收集等分试样。
  3. 添加10微升的脂质体溶液2％的Triton X-100至2ml等分试样的消化脂质体在室温下10分钟，以实现钙黄绿素的完全释放。
  4. 考虑钙黄绿素是对光敏感并且激光实验期间可能被漂白，预先测量脉冲激光对钙黄绿素溶液的漂白效果，从脂质体释放正常化的数据。
    1. 具体来说，暴露钙黄绿素溶液（60毫米），脉冲激光无线1Hz的个频率用于改变脉冲数（0，25，50和100）。测量分别为480和515纳米的激发和发射波长钙黄绿素，前，激光照射后的荧光强度。
    2. 计算漂白的量（具体脉冲数后的钙黄绿素的激光曝光/荧光强度前的钙黄绿素的荧光强度）。使用该因子通过与因子的脂质体的荧光强度乘以正常化从脂质体的样品得到的值。
  5. 测量分别利用在激发和发射波长的荧光酶标仪在480和515纳米的所收集样品的荧光强度。
  6. 服用的Triton X-100处理的样品为100％的释放的荧光强度，计算每个脉冲数所释放的钙黄绿素的百分比，利用下式:
    figure-protocol-2412
    Ft是在归一化之后的给定脉冲数溶液的荧光强度。 的 F i和F x分别溶液分别归一化的初始和最终的荧光强度。

5.压力脉冲测量

  1. 放置在显微镜载玻片100微升样品，并设置激光的焦点到样品。
  2. 浸入针水听器（直径为1毫米和450纳伏/帕灵敏度）到溶液中。
    注意:水听器必须不被激光光照射，以避免损坏。
  3. 照射与脉冲激光具有不同的脉冲数（0-100）和脉冲能量（20-160μJ/脉冲）的样品。
  4. 记录用数字示波器中的压力的​​信号。

结果

10:4:4或7.95:使用具有DPPC，MPPC和DSPE-PEG2000的常规薄膜水化技术中的86摩尔比制备的脂质体0.65:1.39毫克/毫升12金纳米粒子的大小是至关重要的，以确定所述光下面激光激发实验期间加热的转换效率。金纳米粒子的尺寸小，高为13因此为5nm金纳米粒子，从供应商的最小样本，被选择为包封传感效率。在合成过程中，加入含有金纳米粒子和水合介质钙黄绿素生成多...

讨论

薄膜水化是用于制备脂质体的常规方法。有机溶剂（在这种情况下，氯仿）首先用于溶解脂质，然后取出在旋转蒸发器于37℃，以产生在烧瓶的脂质薄膜。此脂质膜用含有60mM的钙黄绿素和5纳米金纳米粒子水溶液水合。在水合过程中，将温度维持在大约50℃，将该烧瓶不断受到烧瓶旋转搅拌。该步骤中的关键是在其中的蒸发和水合分别进行温度的选择。 DPPC，脂质体的主要成分，所述的相变温度（T ...

披露声明

没有利益冲突的声明。

致谢

这项工作是部分由一线学术研究经费由新加坡教育部（RG十二分之六十四到CX）和纳米医学台大研究所西北支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)Avanti Polar Lipids (Alabama, US)850355PPowder, Store at -20 °C
1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC)Avanti Polar Lipids (Alabama, US)855675PPowder, Store at -20 °C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000)Avanti Polar Lipids (Alabama, US)880120PPowder, Store at -20 °C
Gold NanoparticlesSigma Aldrich752568-100mL5 nm particles, stabilized at 0.1 mM PBS
CalceinSigma AldrichC0875-10g60 mM, pH 7.4 (adjusted using NaOH)
phosphate buffered saline (PBS)Sigma AldrichP54930.1 mM, pH 7.4
Double distilled waterMillipore Milli-DI water purification system
Triton X100  Sigma, Life SciencesX-100To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation
Rotavapor  Buchi (Switzerland)R 210Used for Lipososme preparation
Heating bathBuchi (Switzerland)B 491Used for Lipososme preparation
Vacuum Controller  Buchi (Switzerland)V-850Used for Lipososme preparation
Vacuum PumpBuchi (Switzerland)V-700Used for Lipososme preparation
Recirculation bath with temperature controllerPolyscienceUsed for Lipososme preparation
Mini-extruder assembly with heating block Avanti Polar Lipids (Alabama, US)610000Used for extrusion of liposomes
Syringes, 1,000 μlAvanti Polar Lipids (Alabama, US)610017Used for extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 200 nmWhatmann800281Used for extrusion of liposomes
Filter SupportAvanti Polar Lipids (Alabama, US)610014Used for extrusion of liposomes
PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 mediumGE Healthcare, Life sciences17-0851-01Used to purify the liposomes
Centrifuge  Sigma Laboratory Centrifuges3K30Used to concentrate the liposomal solution 
RotorSigma19777-HUsed to concentrate the liposomal solution 
Zetasizer  Nano ZS MalvernUsed for the determination of liposome size and zetapotential
UV-Visible SpectrophotometerShimadzuUV-2450Used to measure the absorbance of the samples
Fluorescent Spectrofluorometer  Molecular DevicesSpectraMax M5Used to measure the fluorescence emission of the samples
Nd:YAG LaserNewWave Research532 nm; Maximum power: 17 mJ; Width: 406 nsec; Used for sample irradiation
HNR HydrophoneONDAHNR-10001 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals
Digital OsciloscopeLECORY - Wave Runner 64Xi-AFrequency: 600 MHz; Max sample rate: 10 Gs/sec (at two channel); Used to record the measured acoustic signals

参考文献

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