JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol piyasada mevcut malzemeler ile foto-duyarlı lipozomlar entegre altın nanopartikülüne için basit bir hazırlık yöntem açıklanır. Aynı zamanda darbeli lazer tedavisi üzerine sentezlenen lipozom mikro-kabarcık kavitasyon sürecini ölçmek için nasıl gösterir.

Özet

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

Giriş

olasılık maksimize özgüllük ve minimal yan etkileri ile, spatial- temporal- ve dozaj kontrollü modası uyuşturucu teslim çekici bir şekilde dış uyaranlara kullanılarak ilaç salımını tetiklemek için. Eksojen uyaranlara duyarlı sistemlerin (ışık, manyetik alan, ultrason, mikrodalga radyasyon) geniş bir yelpazede arasında, ışık tetiklenen platformlar kliniklerinde onların non-invaziv, sadelik ve uyum sayesinde, caziptir. Geçtiğimiz on yıl içinde 1 Kapsamlı bir araştırma Ancak bu tür yakın kızılötesi ışık sorumlu altın gibi platform teknolojileri, çeşitli sağlamıştır (Au) nanocages akıllı polimerler ile kaplanmış, uyuşturucu, 3 ve kendini monte porphysome nanovesicles ile konjuge 2 fotoğraf kararsız, polimerik nanopartiküller (NPS). 4 bu teknolojiler geliştirme preklinik aşamalarında hala ve başlatılması ve cont sürecine dahil parametrelerin net bir anlayış ve optimizasyon gerektiririlaç salınımı döndürülmektedir.

Böyle bir sistemin hazırlanması için basit ve kolay erişilebilir yöntemlerden biri piyasada yaygın olarak bulunmaktadır ve yoğun klinik öncesi ve hatta klinik çalışmalarda araştırılmıştır her ikisi de termal duyarlı lipozomlar 5,6, Au NPS entegre etmektir. Küçük hayvanlarda veya insanlarda lokal uygulama için kullanıldığı zaman yakın kızılötesi aktive Au nano-(ör nanocages) göre kendi plasmonik dalgaboyunda Au NPlerin derin doku aktivasyonu sınırlama rağmen, bu sistem hala büyük ümit vaat etmektedir. 7 ışık tetiklenen serbest bırakılması için lipozomlar ile Au NPS birleştiren bazı erken çabalar vardır. 8-11 çoğu malzeme yenilik odaklanırken, erişilebilirlik ve ölçeklenebilirlik sorunları ele alınması gerekmektedir. Ayrıca, bu nanocarriers kullanarak serbest bırakma mekanizmalarına raporlar hala sınırlıdır.

Burada, fabrikasyonu fotoğrafın duyarlıeş zamanlı olarak ilaç ve hidrofilik Au NPS yüklü lipozomlar tarif edilmiştir. Kalsein Kapsülleme verimliliği ve sistemin salınım profilini değerlendirmek için bir model bileşik olarak kullanılır. Buna ek olarak, bu sistemde, Au, NPS tarafından emilen ışık lokal bir sıcaklık artışı ile sonuçlanan ısı şeklinde çevreleyen mikro ortama yayar. Hava mikrokabarcıklar lazer ısıtma esnasında üretilen ve lipozomlar (Şekil 1) mekanik bozulmasına yol açar. mikro-kabarcık kavitasyon mekanizması hidrofon ölçümleri ile teyit edilir.

Protokol

1. Hazırlık

  1. Yuvarlak temiz 100 mi su regia (konsantre nitrik asidin 1 parçası (HNO 3) ve konsantre edilmiş hidroklorik asit (HCI) 3 ölçü) ve DI suyla şişeler yıkama ile taban şişe içine tartılır. şişeler Otoklav ve 15 dakika boyunca 100 ° C'de sıcak hava fırınında kurutun. Sarın ve kullanılıncaya kadar steril şişeler saklayın.
  2. % 70 etanol kullanılarak elle tutulan mini ekstruder kümesi sterilize edin.
  3. Döner buharlaştırıcı açın ve sırasıyla 37 ° C ve 4 ° C'de sıcak su banyosu ve soğutma kulesi sıcaklığını ayarlamak.
  4. 10 ml 0.1 mM, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) (pH 7.4) içinde kalseinin 374 mg çözülmesiyle stok solüsyonu kalsein 60 mM hazırlayın. 1 M sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi kullanılarak pH 7.4 ayarlayın.

Lipozomların 2. sentezi

  1. Lipidler çıkarın (1,2-Dipalmitoyl- sn -glisero-3-fosfokolin (DPPC), 1-palmitoil-2-hidroksi-sn -glisero-3-phosphochohattı (MPPC) ve 1, 2-distearoil, sn -glisero-3-phosphoethanol-amin- N - [karboksi (polietilen glikol) -2000] (amonyum tuzu) (DSPE-PEG2000)) dondurucu (-20 ° C) ve RT onları çözülme.
  2. 15.9 mg DPPC, 1.3 mg MPPC ve 2.8 mg DSPE-PEG2000 tartılır. 2 ml kloroform bunları birbirine eritin.
  3. Steril yuvarlak tabanlı şişeye kloroform çözeltisini ve ince, kuru lipit tabakası oluşturmak için, düşük basınç altında döner buharlaştırıcı kullanılarak çözücü buharlaştırılır.
  4. Aşama 1.4 ve 50 ul Au NP (3.36 x 10 ila 16 parçacık / ml) içinde hazırlanır kalsein 1.95 mi 60 mM ihtiva eden 30 dakika boyunca 2 ml sulu çözeltisi, 45 ° C lipid tabakası hidratı.
  5. 45 ° C'ye kadar ısıtma bloğu önceden ısıtın. Filtre destekleri arasında 200 nm polikarbonat membran filtre yerleştirin ve mini ekstruder setini monte. DI su ile potansiyel sızıntı kontrol edin.
  6. Aşama 2.4 ve extru gelen lipozom solüsyonu 1 ml şırınga içinde bir dolgumonte mini ekstrüderin diğer ucunda şırınga geçirilmesiyle örnek de. 11 kez tekrarlayın.
  7. bilgilerini Au NP, üreticinin protokolüne uygun olarak, yıkama sıvısı olarak PBS kullanılarak lipidler ve kalsein kaldırmak için, bir PD-10 tuz giderme kolonu boyunca sentezlenmiştir lipozomlar çalıştırın.
  8. 4 ° C'de steril tüplerde örnekleri saklamak ve 2 gün içinde kullanım.

Ile Isıtma Lipozomlar 3. Calcein Yayın

  1. Adım 2.2 DPPC, MPPC ve DSPE-PEG2000 molariteleri ekleyerek stok solüsyonu lipid molaritesi nedir. 0.1 mM, PBS tampon (pH 7.4) ile 5 mM lipit konsantrasyonuna lipozom stok solüsyonu ile seyreltilir. bir santrifüj tüpüne (2 mi) örnekleri aktarın.
  2. Bir sıcak su banyosu içinde tüp yerleştirin ve 25 ile 70 ° C arasında kademeli sıcaklığını yükseltir. Burada 1 ° C / dk bir oranda sıcaklık artışı.
  3. Farklı sıcaklık noktalarında (27, 32, 37, 39, 41 alikotları (10 ul) toplamak43, 45, 52, 57, 62, 67 ve 70 ° C).
  4. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca lipozomları sindirimi ve kalseinin tamamlanmış salımını elde etmek için burada liposomal çözelti% 2 Triton X-100-2 mi kısım 10 ul ekle.
  5. 96 çukurlu bir mikrolevhadaki her oyuğa liposomal çözelti 200 ul aktarın ve bir floresan mikroplaka okuyucu kullanılarak toplanan numunelerin fluoresans şiddetini ölçmek. kalsein eksitasyon ve emisyon dalga boyları sırasıyla 480 ve 515 nm.
  6. % 100 salınımı gibi, Triton X-100 ile muamele edilmiş örneklerde floresans yoğunluğu alarak, aşağıdaki formül kullanılarak, her bir zaman noktasında serbest kalsein yüzdesini hesaplayın:
    figure-protocol-3632
    Ft, belirli bir zaman noktasında çözeltinin floresans şiddetidir. F i ve F x sırasıyla çözümün normalize ilk ve son floresan yoğunlukları vardır.

4. Calcein ReDarbeli lazer lipozomlar arasından kira

  1. kuartz küvete 100 ul lipozom çözeltisini ve bir küvet içine tutucuya yerleştirin. ışık kaynağı olarak 532 nm dalga boyunda 6 nsaniye bir darbe süresi ile: YAG lazer bir darbeli Nd kullanın. 1 Hz: Tekrar hızı - Lazer Parametreleri aşağıdaki kullanın Lazer enerji yoğunluğu: 1 mJ / cm2; Işın çapı: 0.5 mm.
  2. Işık lipozom solüsyonu geçer şekilde küvet ile dengesi ayarlanmış lazer ışını kılavuz ve çeşitli darbe sonrası alikotları toplar.
  3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca lipozomları sindirimi ve kalseinin tamamlanmış salımını elde etmek için burada liposomal çözelti% 2 Triton X-100-2 mi kısım 10 ul ekle.
  4. kalsein göz önüne alındığında ışığa karşı duyarlıdır ve lazer deney beyazlatılabilir olabilir, önceden ölçülmesi lipozom serbest verileri normalleştirmek için kalsein çözeltisi üzerinde darbeli lazer ağartma etkisi.
    1. Spesifik olarak, kalsein çözeltisi (60 mM) darbeli lazer wi maruzDarbe numaraları (0, 25, 50 ve 100) değiştirmek için 1 Hz inci frekans. önce ve lazer maruz kaldıktan sonra, sırasıyla, 480 ve 515 nm uyarma ve emisyon dalga boyları ile kalsein floresan yoğunluğu ölçmek.
    2. ağartma miktarını (özgül darbe sayıdan sonra kalsein lazer pozlama / floresan yoğunluğu önce kalsein floresan yoğunluğu) hesaplayın. faktörlü lipozomlar floresans yoğunluğu çarparak lipozom örneklerinden elde edilen değerlerini normalize bu faktör kullanın.
  5. sırasıyla, 480 ve 515 nm uyarma ve emisyon dalga boylarında bir floresan mikroplaka okuyucu kullanılarak toplanan numunenin fluoresans şiddetini ölçmek.
  6. % 100 salınımı gibi, Triton X-100 ile muamele edilmiş örneklerde floresans yoğunluğu alarak, aşağıdaki formül kullanılarak, her bir atım sayısı tahliye kalsein yüzdesini hesaplayın:
    figure-protocol-5756
    Ft normalleşme sonra belirli bir darbe sayıda çözümün floresan yoğunluğu. F i ve F x sırasıyla çözümün normalize ilk ve son floresan yoğunlukları vardır.

Basınç Impulses 5. Ölçüm

  1. mikroskobik slayt üzerinde numune 100 ul koyun ve örnek üzerine lazer odağı ayarlayın.
  2. solüsyon içine bir iğne Hidrafon (1 mm çapında ve 450 NV / Pa hassasiyet) daldırın.
    Dikkat: hidrofon zarar görmesini önlemek için, lazer ışığı ile aydınlatılmış edilmemelidir.
  3. değişen darbe numaraları (0-100) ve nabız enerji (20-160 μJ / darbe) ile darbeli lazer ile örnek ışın tedavisi.
  4. Dijital osiloskop kullanarak basınç sinyallerini kaydeder.

Sonuçlar

10: 4 ya da 7.95: Lipozomlar 86 mol oranında DPPC, MPPC ve DSPE-PEG2000 ile geleneksel bir ince film hidrasyon tekniği kullanılarak hazırlandı 0.65. 1.39 mg / ml 12 Au NPlerin boyutu ışık belirlenmesi önemlidir aşağıdaki lazer ikaz deney sırasında dönüşüm verimi ısı. Au NPS küçük boyutta yüksek 13 Böylece 5 nm Au NPS, satıcıdan küçük numuneler, kapsülleme için seçildi. Nakleden verimliliktir. Sentez sırasında, hidrasyon Au NP içer...

Tartışmalar

İnce film hidratasyon Lipozomların elde edilmesi için geleneksel bir yöntemdir. Organik çözücü (bu durumda kloroform), ilk şişenin üzerine ince bir lipid filmi oluşturmak için 37 ° C'de bir döner buharlaştırıcı içinde lipitleri yok etmek için kullanılan ve daha sonra çıkarıldı. Bu lipid filmi 60 mM Calcein ve 5 nm ve Au NP içeren sulu bir çözelti ile hidre edilmiştir. Hidratlama işlemi sırasında, sıcaklık 50 ° C civarında muhafaza edildi ve şişe sürekli balon döndürülerek ?...

Açıklamalar

herhangi bir çıkar çatışması beyan edilir.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Milli Eğitim Singapur Bakanlığı (CX için RG 64/12) ve Nanotıp NTU-Northwestern Enstitüsü tarafından Tier-1 Akademik Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)Avanti Polar Lipids (Alabama, US)850355PPowder, Store at -20 °C
1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC)Avanti Polar Lipids (Alabama, US)855675PPowder, Store at -20 °C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000)Avanti Polar Lipids (Alabama, US)880120PPowder, Store at -20 °C
Gold NanoparticlesSigma Aldrich752568-100mL5 nm particles, stabilized at 0.1 mM PBS
CalceinSigma AldrichC0875-10g60 mM, pH 7.4 (adjusted using NaOH)
phosphate buffered saline (PBS)Sigma AldrichP54930.1 mM, pH 7.4
Double distilled waterMillipore Milli-DI water purification system
Triton X100  Sigma, Life SciencesX-100To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation
Rotavapor  Buchi (Switzerland)R 210Used for Lipososme preparation
Heating bathBuchi (Switzerland)B 491Used for Lipososme preparation
Vacuum Controller  Buchi (Switzerland)V-850Used for Lipososme preparation
Vacuum PumpBuchi (Switzerland)V-700Used for Lipososme preparation
Recirculation bath with temperature controllerPolyscienceUsed for Lipososme preparation
Mini-extruder assembly with heating block Avanti Polar Lipids (Alabama, US)610000Used for extrusion of liposomes
Syringes, 1,000 μlAvanti Polar Lipids (Alabama, US)610017Used for extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 200 nmWhatmann800281Used for extrusion of liposomes
Filter SupportAvanti Polar Lipids (Alabama, US)610014Used for extrusion of liposomes
PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 mediumGE Healthcare, Life sciences17-0851-01Used to purify the liposomes
Centrifuge  Sigma Laboratory Centrifuges3K30Used to concentrate the liposomal solution 
RotorSigma19777-HUsed to concentrate the liposomal solution 
Zetasizer  Nano ZS MalvernUsed for the determination of liposome size and zetapotential
UV-Visible SpectrophotometerShimadzuUV-2450Used to measure the absorbance of the samples
Fluorescent Spectrofluorometer  Molecular DevicesSpectraMax M5Used to measure the fluorescence emission of the samples
Nd:YAG LaserNewWave Research532 nm; Maximum power: 17 mJ; Width: 406 nsec; Used for sample irradiation
HNR HydrophoneONDAHNR-10001 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals
Digital OsciloscopeLECORY - Wave Runner 64Xi-AFrequency: 600 MHz; Max sample rate: 10 Gs/sec (at two channel); Used to record the measured acoustic signals

Referanslar

  1. McCoy, C. P., et al. Triggered drug delivery from biomaterials. Expert Opin. Drug Deliv. 7 (5), 605-616 (2010).
  2. Yavuz, M. S., et al. Gold nanocages covered by smart polymers for controlled release with near-infrared light. Nat. Mater. 8 (12), 935-939 (2009).
  3. Gohy, J. F., Zhao, Y. Photo-responsive block copolymer micelles: design and behavior. Chem. Soc. Rev. 42 (17), 7117-7129 (2013).
  4. Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat. Mater. 10 (4), 324-332 (2011).
  5. Needham, D., Dewhirst, M. W. The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors. Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (3), 285-305 (2001).
  6. Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. Nanoscale drug delivery and hyperthermia: the materials design and preclinical and clinical testing of low temperature-sensitive liposomes used in combination with mild hyperthermia in the treatment of local cancer. Open Nanomed. J. 3, 38-64 (2011).
  7. Sykes, E. A., Dai, Q., Tsoi, K. M., Hwang, D. M., Chan, W. C. Nanoparticle exposure in animals can be visualized in the skin and analysed via skin biopsy. Nat. Commun. 5, 3796 (2014).
  8. Paasonen, L., et al. Gold nanoparticles enable selective light-induced contents release from liposomes. J. Control. Release. 122 (1), 86-93 (2007).
  9. Wu, G., et al. Remotely Triggered Liposome Release by Near-Infrared Light Absorption via Hollow Gold Nanoshells. J. Am. Chem. Soc. 130 (26), 8175-8177 (2008).
  10. Leung, S. J., Kachur, X. M., Bobnick, M. C., Romanowski, M. Wavelength-Selective Light-Induced Release from Plasmon Resonant Liposomes. Adv. Funct. Mater. 21 (6), 1113-1121 (2011).
  11. Volodkin, D. V., Skirtach, A. G., Möhwald, H. Near-IR Remote Release from Assemblies of Liposomes and Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (10), 1807-1809 (2009).
  12. Mills, J. K., Needham, D. Lysolipid incorporation in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membranes enhances the ion permeability and drug release rates at the membrane phase transition. Biochim. Biophys. Acta. 1716 (2), 77-96 (2005).
  13. Jiang, K., Smith, D. A., Pinchuk, A. O. Size-dependent Photothermal Conversion Efficiencies of Plasmonically Heated Gold Nanoparticles. J. Phys. Chem. C. 117 (51), 27073-27080 (2013).
  14. Chongsiriwatana, N., Barron, A., Giuliani, A., Rinaldi, A. C. Comparing bacterial membrane interaction of antimicrobial peptides and their mimics. Antimicrobial Peptides. 618, 171-182 (2010).
  15. Egerev, S., et al. Acoustic signals generated by laser-irradiated metal nanoparticles. Appl. Opt. 48 (7), C38-C45 (2009).
  16. González, M. G., Liu, X., Niessner, R., Haisch, C. Strong size-dependent photoacoustic effect on gold nanoparticles by laser-induced nanobubbles. Appl. Phys. Lett. 96, 174104 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 108Eksojen uyaranlara duyarl nanopartik llerk duyarl lipozomlaralt n nanopartik llerila da t mkontroll sal m kabarc k kavitasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır