JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает простой способ подготовки к золотой наночастицы интегрированной фотоальбомы проблематику липосом с коммерчески доступных материалов. Она также показывает, как измерить микропузырьков процесс кавитации синтезированных липосом при лечении импульсным лазером.

Аннотация

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

Введение

Возможность вызвать высвобождение лекарства с помощью внешних стимулов является привлекательным способом для доставки лекарств в пространственно-, temporal- и лекарственных управлением мод с максимальным специфичности и минимальными побочными эффектами. Среди широкого спектра экзогенных раздражителей проблематику систем (света, магнитное поле, ультразвук, СВЧ-излучение), легкие инициируется платформы являются привлекательными из-за их не-инвазивности, простота и адаптивности в клиниках. 1 Обширные исследования в последнее десятилетие предоставил ряд технологий платформы, такие как в ближней инфракрасной области освещенности ответственного золота (Au) наноклетки покрыты смарт полимеров, 2 фото-лабильным, полимерные наночастицы (NPS), конъюгированные с наркотиками, 3 и самоорганизующихся porphysome nanovesicles. 4 Однако эти технологии все еще находятся на доклинических стадиях развития, и требуют четкого понимания и оптимизации параметров, участвующих в процессе инициирования и продолжениепрокатки высвобождение лекарственного средства.

Один из самых простых и легкодоступных способов получения такой системы состоит в интеграции Au NPS с термически чувствительных липосом 5,6, оба из которых широко доступны на рынке и широко исследованных в доклинических и клинических испытаний даже. Несмотря на ограничение активации глубокие ткани из Au наночастиц при их плазмонного волны, по сравнению с ближней инфракрасной активированные наноструктур Au (например, наноклетки), эта система по-прежнему имеет большие перспективы при использовании в малых животных или для местной доставки в организме человека. 7 Есть некоторые ранние усилия в объединение Au NPS с липосомами для светлой срабатывает выпуска. 8-11 Хотя большинство из них сосредоточиться на новизне материалов, проблемы доступности и масштабируемости необходимо решать. Кроме того, отчеты о механизмах высвобождения, использующих эти наноносителей все еще ограничены.

В данном случае изготовление фото-отзывчивымлипосомы, одновременно с грузом наркотиков и гидрофильных Au наночастиц была описана. Кальцеин используется в качестве модельного соединения для оценки эффективности инкапсуляции и профиль высвобождения системы. Кроме того, в этой системе, свет, поглощенный Au наночастиц рассеивает в окружающую микросреду в виде тепла, что приводит к увеличению локальной температуры. Воздушные микропузырьки образуются в процессе лазерного нагрева и вызвать механическое разрушение липосом (рисунок 1). Механизм микропузырьков кавитации подтверждается измерениями гидрофонов.

протокол

1. Подготовка

  1. Чистые 100 мл с круглым дном колбы с использованием царской водки (1 часть концентрированной азотной кислоты (HNO 3), и 3 частей концентрированной соляной кислоты (HCl)) и мыть колбы дистиллированной водой. Автоклав колб и высушить их в печи с горячим воздухом при температуре 100 ° С в течение 15 мин. Оберните и не хранить стерильные колбы до использования.
  2. Стерилизовать ручной набор мини-экструдер с использованием 70% этанола.
  3. Включите роторном испарителе и установить температуру горячей водяной бане и градирни при 37 ° С и 4 ° С соответственно.
  4. Подготовьте 60 мм кальцеиновыми маточного раствора путем растворения 374 мг кальцеина в 10 мл 0,1 мМ фосфатным буферным раствором (PBS) (рН 7,4). Доводят рН до 7,4 с помощью 1 М раствора гидроксида натрия (NaOH).

2. Синтез липосом

  1. Удалить липиды (1,2-Dipalmitoyl- SN глицеро-3-фосфохолин (ДПФХ), 1-пальмитоил-2-гидрокси-SN глицеро-3-phosphochoЛиния (MPPC) и 1, 2-distearoyl- SN глицеро-3-phosphoethanol-аминов N - [карбокси (полиэтиленгликоль) -2000] (соль аммония) (DSPE-PEG2000)) из морозильника (-20 ° С) и оттаивать их до комнатной температуры.
  2. Взвешивание 15,9 мг ДПФХ, 1,3 мг MPPC и 2,8 мг DSPE-PEG2000. Растворите их вместе в 2 мл хлороформа.
  3. Передача раствора хлороформа к стерильной круглодонной колбе и испарения растворителя с использованием роторного испарителя при пониженном давлении, чтобы сформировать тонкую, сухую липидный слой.
  4. Гидрат липидный слой при 45 ° С с 2 мл водного раствора в течение 30 мин, содержащей 1,95 мл 60 мМ кальцеиновыми полученного на стадии 1.4, и 50 мкл Au NPS (3,36 × 10 16 частиц / мл).
  5. Предварительно нагреть нагревательный блок до 45 ° С. Поместите фильтр поликарбонатную мембрану 200 нм между фильтрующим опор и собрать множество мини-экструдера. Проверьте потенциальную утечку с дистиллированной водой.
  6. Заполните один из шприцов 1 мл раствора липосом с шага 2.4 и extruде образца пропусканием раствора к шприцу на другом конце сборки мини-экструдере. Повторите 11 раз.
  7. Запуск синтезированные липосом через колонку обессоливания PD-10 для удаления свободных Au NPS, липиды и кальцеина помощью PBS в качестве элюента соответствии с протоколом производителя.
  8. Хранить образцы в стерильные пробирки при температуре 4 ° С и используют в течение 2 дней.

3. Кальцеин Освобождение от липосом с Кондиционер

  1. Рассчитать липидный молярность раствора путем сложения molarities ДПФХ, MPPC и ДСФЭ-PEG2000 в шаге 2.2. Развести липосома маточного раствора до 5 мм концентрации липидов с использованием 0,1 мМ PBS буфера (рН 7,4). Передача образцов в центрифужную пробирку (2 мл).
  2. Поместите пробирку в горячую водяную баню, и повышать температуру постепенно от 25 до 70 ° C. Повышение температуры со скоростью 1 ° С / мин здесь.
  3. Собирают аликвот (10 мкл) при различных температурных точек (27, 32, 37, 39, 41,43, 45, 52, 57, 62, 67 и 70 ° С).
  4. Добавить 10 мкл 2% Triton X-100 до 2 мл аликвоты раствора липосомальной переварить липосом в течение 10 мин при комнатной температуре и для достижения полного освобождения кальцеина.
  5. Передача 200 мкл раствора липосомальной в каждую лунку в 96-луночный микропланшет и измеряют интенсивность флуоресценции собранных образцов с использованием ридера флуоресценции микропланшетов. Возбуждения и излучения длин волн кальцеина являются 480 и 515 нм соответственно.
  6. Принимая интенсивность флуоресценции Тритон Х-100, обработанных образцов за 100% выпуска, вычислить процент высвобожденного кальцеина в каждый момент времени, используя формулу:
    figure-protocol-3819
    Ft является интенсивность флуоресценции раствора в данной точке времени. F я и F х нормированные начальные и конечные интенсивности флуоресценции раствора соответственно.

4. Кальцеин Reарендовать у липосом с импульсным лазером

  1. Передача 100 мкл раствора липосом в кварцевую кювету и поместите его в держатель кювет. Используйте импульсный Nd: YAG лазер с длительностью импульса 6 нс при 532 нм в качестве источника света. Используйте следующую параметров лазера - Частота повторения: 1 Гц; Плотность Лазерная энергия: 1 мДж / см 2; Диаметр луча: 0,5 мм.
  2. Руководство коллимированный лазерный луч через кювету таким образом, что свет проходит через раствор липосом и собирать аликвот после различных импульсов.
  3. Добавить 10 мкл 2% Triton X-100 до 2 мл аликвоты раствора липосомальной переварить липосом в течение 10 мин при комнатной температуре и для достижения полного освобождения кальцеина.
  4. Учитывая кальцеина чувствителен к свету и может быть беленой течение лазерного эксперимента, предварительно измерить отбеливающий эффект импульсного лазера на кальцеиновой раствора для нормализации данных от выпуска липосом.
    1. В частности, выставить кальцеина решение (60 мм) до импульсного лазерного Wiй частоте 1 Гц в течение различного количества импульсов (0, 25, 50 и 100). Измерить интенсивность флуоресценции кальцеиновыми с возбуждения и излучения длиной волны 480 и 515 нм соответственно, до и после лазерного воздействия.
    2. Рассчитать количество отбеливания (интенсивность флуоресценции кальцеина перед интенсивности лазерного воздействия / флуоресценции кальцеина после определенного числа импульсов). Используйте этот фактор для нормализации значений, полученных из образцов липосом путем умножения интенсивности флуоресценции липосом с коэффициентом.
  5. Измерить интенсивность флуоресценции отобранной пробы с помощью устройства чтения флуоресценции микропланшетов при возбуждения и излучения длин волн при 480 и 515 нм соответственно.
  6. Принимая интенсивность флуоресценции Тритон Х-100, обработанных образцов за 100% выпуска, вычислить процент высвобожденного кальцеина на каждом номера импульса, используя формулу:
    figure-protocol-6174
    Ft является интенсивность флуоресценции раствора при заданном числе импульсов после нормализации. F я и F х нормированные начальные и конечные интенсивности флуоресценции раствора соответственно.

5. Измерение импульсов давления

  1. Поместите 100 мкл образца на предметное стекло и установить фокус лазера на образец.
  2. Погрузитесь иглы гидрофон (диаметр 1 мм и 450 чувствительность нВ / Па) в растворе.
    Внимание: Гидрофон не должен быть освещен светом лазера, чтобы избежать повреждения.
  3. Облучать образец с импульсным лазером с различным числом импульсов (0-100) и энергии импульса (20-160 мкДж / импульс).
  4. Запись сигналов давления использовании цифрового осциллографа.

Результаты

Липосомы получали при помощи обычного способа тонкая гидратации пленки с DPPC, MPPC и ДСФЭ-PEG2000 в молярном соотношении 86: 10: 4 или 7,95: 0,65:. 1,39 мг / мл 12 Размер Au наночастиц является критическим для определения свет нагреть эффективность преобразования в ходе следующего ?...

Обсуждение

Тонкий гидратации пленки является обычным методом для получения липосом. Органические растворители (хлороформ в данном случае) впервые были использованы для растворения липидов, а затем удаляют на роторном испарителе при 37 ° С для генерирования липидный тонкую пленку на колбу. Это ли?...

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов не объявлены.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Tier-1 академический исследовательские фонды по Министерство образования Сингапура (RG 64/12 к CX) и NTU-Northwestern Института Наномедицины.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)Avanti Polar Lipids (Alabama, US)850355PPowder, Store at -20 °C
1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (MPPC)Avanti Polar Lipids (Alabama, US)855675PPowder, Store at -20 °C
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000)Avanti Polar Lipids (Alabama, US)880120PPowder, Store at -20 °C
Gold NanoparticlesSigma Aldrich752568-100mL5 nm particles, stabilized at 0.1 mM PBS
CalceinSigma AldrichC0875-10g60 mM, pH 7.4 (adjusted using NaOH)
phosphate buffered saline (PBS)Sigma AldrichP54930.1 mM, pH 7.4
Double distilled waterMillipore Milli-DI water purification system
Triton X100  Sigma, Life SciencesX-100To disrupt the liposomes to calculate total encapsulation
Rotavapor  Buchi (Switzerland)R 210Used for Lipososme preparation
Heating bathBuchi (Switzerland)B 491Used for Lipososme preparation
Vacuum Controller  Buchi (Switzerland)V-850Used for Lipososme preparation
Vacuum PumpBuchi (Switzerland)V-700Used for Lipososme preparation
Recirculation bath with temperature controllerPolyscienceUsed for Lipososme preparation
Mini-extruder assembly with heating block Avanti Polar Lipids (Alabama, US)610000Used for extrusion of liposomes
Syringes, 1,000 μlAvanti Polar Lipids (Alabama, US)610017Used for extrusion of liposomes
Polycarbonate filter membrane, 200 nmWhatmann800281Used for extrusion of liposomes
Filter SupportAvanti Polar Lipids (Alabama, US)610014Used for extrusion of liposomes
PD 10 Desalting coulumns, Sephadex G-25 mediumGE Healthcare, Life sciences17-0851-01Used to purify the liposomes
Centrifuge  Sigma Laboratory Centrifuges3K30Used to concentrate the liposomal solution 
RotorSigma19777-HUsed to concentrate the liposomal solution 
Zetasizer  Nano ZS MalvernUsed for the determination of liposome size and zetapotential
UV-Visible SpectrophotometerShimadzuUV-2450Used to measure the absorbance of the samples
Fluorescent Spectrofluorometer  Molecular DevicesSpectraMax M5Used to measure the fluorescence emission of the samples
Nd:YAG LaserNewWave Research532 nm; Maximum power: 17 mJ; Width: 406 nsec; Used for sample irradiation
HNR HydrophoneONDAHNR-10001 mm diameter and 450 nV/Pa sensitivity, Proper working frequency range: 0.25-10 MHz; Calibration: 50 mV/Bar; Used to measure the acoustic signals
Digital OsciloscopeLECORY - Wave Runner 64Xi-AFrequency: 600 MHz; Max sample rate: 10 Gs/sec (at two channel); Used to record the measured acoustic signals

Ссылки

  1. McCoy, C. P., et al. Triggered drug delivery from biomaterials. Expert Opin. Drug Deliv. 7 (5), 605-616 (2010).
  2. Yavuz, M. S., et al. Gold nanocages covered by smart polymers for controlled release with near-infrared light. Nat. Mater. 8 (12), 935-939 (2009).
  3. Gohy, J. F., Zhao, Y. Photo-responsive block copolymer micelles: design and behavior. Chem. Soc. Rev. 42 (17), 7117-7129 (2013).
  4. Lovell, J. F., et al. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents. Nat. Mater. 10 (4), 324-332 (2011).
  5. Needham, D., Dewhirst, M. W. The development and testing of a new temperature-sensitive drug delivery system for the treatment of solid tumors. Adv. Drug Deliv. Rev. 53 (3), 285-305 (2001).
  6. Landon, C. D., Park, J. Y., Needham, D., Dewhirst, M. W. Nanoscale drug delivery and hyperthermia: the materials design and preclinical and clinical testing of low temperature-sensitive liposomes used in combination with mild hyperthermia in the treatment of local cancer. Open Nanomed. J. 3, 38-64 (2011).
  7. Sykes, E. A., Dai, Q., Tsoi, K. M., Hwang, D. M., Chan, W. C. Nanoparticle exposure in animals can be visualized in the skin and analysed via skin biopsy. Nat. Commun. 5, 3796 (2014).
  8. Paasonen, L., et al. Gold nanoparticles enable selective light-induced contents release from liposomes. J. Control. Release. 122 (1), 86-93 (2007).
  9. Wu, G., et al. Remotely Triggered Liposome Release by Near-Infrared Light Absorption via Hollow Gold Nanoshells. J. Am. Chem. Soc. 130 (26), 8175-8177 (2008).
  10. Leung, S. J., Kachur, X. M., Bobnick, M. C., Romanowski, M. Wavelength-Selective Light-Induced Release from Plasmon Resonant Liposomes. Adv. Funct. Mater. 21 (6), 1113-1121 (2011).
  11. Volodkin, D. V., Skirtach, A. G., Möhwald, H. Near-IR Remote Release from Assemblies of Liposomes and Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (10), 1807-1809 (2009).
  12. Mills, J. K., Needham, D. Lysolipid incorporation in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer membranes enhances the ion permeability and drug release rates at the membrane phase transition. Biochim. Biophys. Acta. 1716 (2), 77-96 (2005).
  13. Jiang, K., Smith, D. A., Pinchuk, A. O. Size-dependent Photothermal Conversion Efficiencies of Plasmonically Heated Gold Nanoparticles. J. Phys. Chem. C. 117 (51), 27073-27080 (2013).
  14. Chongsiriwatana, N., Barron, A., Giuliani, A., Rinaldi, A. C. Comparing bacterial membrane interaction of antimicrobial peptides and their mimics. Antimicrobial Peptides. 618, 171-182 (2010).
  15. Egerev, S., et al. Acoustic signals generated by laser-irradiated metal nanoparticles. Appl. Opt. 48 (7), C38-C45 (2009).
  16. González, M. G., Liu, X., Niessner, R., Haisch, C. Strong size-dependent photoacoustic effect on gold nanoparticles by laser-induced nanobubbles. Appl. Phys. Lett. 96, 174104 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

108

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены