الكمي لشعيري أكتين (F-الأكتين) نقاط وفي الجرذ العصبونات القشرية

Summary

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Abstract

الخيطية بروتين الأكتين (F-الأكتين) يلعب دورا رئيسيا في spinogenesis، اللدونة متشابك، والاستقرار متشابك. تغييرات في الهياكل الغنية شجيري-F الأكتين تشير التعديلات في سلامة متشابك والاتصال. نحن هنا نقدم بروتوكول مفصل لزراعة الفئران الأساسي العصبونات القشرية، تلطيخ Phalloidin للنقاط وF-أكتين، وتقنيات القياس الكمي لاحقة. أولا، وفصل القشرة الأمامية من أجنة الفئران E18 في زراعة الخلايا منخفض الكثافة، ثم الخلايا العصبية المزروعة في المختبر ل12-14 يوما على الأقل. بعد العلاج التجريبية، هي ملطخة الخلايا العصبية القشرية مع AlexaFluor 488 Phalloidin (لتسمية نقاط وF-أكتين شجيري) والمرتبطة أنيبيب بروتين 2 (MAP2، للتحقق من صحة الخلايا العصبية وسلامة شجيري). وأخيرا، يتم استخدام برنامج خاص لتحليل وتحديد التشعبات العصبية تم اختيارها عشوائيا. F-الأكتين هياكل الغنية التي تم تحديدها في الدرجة الثانية الفروع الشجيرية (مدى طول 25-75 و# 181؛ م) مع المناعي MAP2 المستمر. فإن بروتوكول المعروضة هنا تكون وسيلة مفيدة لتحقيق تغييرات في هياكل المشبك الجذعية لاحقة لعلاجات تجريبية.

Introduction

الهدف الرئيسي من هذه الدراسة هو تطوير طريقة يمكن الاعتماد عليها لقياس (تقدير) من سلامة متشابك من شبكة الجذعية العصبية. نحن هنا وصف الكمي من نقاط وF-أكتين في الخلايا العصبية مثقف الفئران الأساسي باستخدام مزيج من تلطيخ Phalloidin وكشف immunocytochemical (ICC) من التشعبات مع تحليل لاحقة باستخدام (NIS-عناصر) البرمجيات المتخصصة.

phallotoxins المسمى يكون تقارب مماثلة لخيوط الكبيرة والصغيرة (F-الأكتين) ولكن لا ربط أحادى الأكتين كروية (G-الأكتين)، خلافا لبعض الأجسام المضادة الأكتين ^1. غير محددة ملزمة من Phalloidin لا يكاد يذكر، وبالتالي توفير الحد الأدنى من الخلفية أثناء التصوير الخلوي. Phalloidin هو أصغر بكثير من الأجسام المضادة التي من شأنها عادة أن تستخدم لتسمية البروتينات الخلوية للفحص المجهري الفلورسنت، والذي يسمح لوضع العلامات أكثر كثافة بكثير من F-الأكتين من قبل Phalloidin. وهكذا، صورا تفصيلية للتوطين F-الأكتين في الخلايا العصبية يمكن أن يكونالحصول عليها من خلال استخدام Phalloidin المسمى.

Phalloidin (F-الأكتين) تلطيخ من التشعبات العصبية يولد "النقاط الساخنة" منفصلة أو مشرق "نقاط و"، التي تمثل مجموعة متنوعة من هياكل الجذعية، بما في ذلك العمود الفقري ناضجة، نقاط الاشتباك العصبي غير شائك ² والعمود الفقري غير ناضجة. وتشمل العمود الفقري غير ناضجة أرجل كاذبة خيطية رفيعة وبعض أشكال التصحيح التشكل، وربما تمثل بدء spinogenesis ^3. العمود الفقري غير ناضجة وبقع غير شائك تفتقر PSD95 ^4. التغيرات في إنتاج الرصاص F-الأكتين لتغييرات لاحقة في العمود الفقري فحسب، بل أيضا الهياكل شجيري إضافية، مما يجعل Phalloidin أداة هامة لتحقيق سلامة synaptodendritic ^5-7. بشكل عام، عدد Phalloidin إيجابية (F-الأكتين) نقاط وتعكس التوازن بين نقاط الاشتباك العصبي نشطة (مثير والمثبطة)، وديناميات الأكتين والاستقرار المشبك ^8.

على الرغم من أنه من المهم دراسة ر محددةypes من نقاط الاشتباك العصبي (أي العمود الفقري مثير)، عندما يكون الهدف من العلاج هو معروف فإنه من الضروري تقدير أولا سلامة العامة من مجموعة متنوعة من هياكل الجذعية. منذ F-الأكتين عنصرا رئيسيا في العمود الفقري شجيري وغيرها من الهياكل، بما في ذلك نقاط الاشتباك العصبي المثبطة، عدد غيرت من نقاط وF-أكتين قد تشير إلى وجود synaptopathy. ويمكن بعد ذلك مزيد من التحقيق في هذا synaptopathy لإجراء تعديلات أكثر تحديدا. لدينا طريقة القياس الكمي للكشف عن عدة متشابك أنواع / الهياكل غلة تقدير عام للتغييرات متشابك شجيري (الزيادة والنقصان) في أعقاب العديد من العلاجات التجريبية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم استعراض جميع البروتوكولات الحيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام في جامعة ولاية كارولينا الجنوبية (رقم ضمان: A3049-01).

1. منخفضة الكثافة الجنينية العصبية الثقافة

1. استعدادا للثقافة العصبية القشرية الأولية
   1. الحلول:
      1. إعداد بولي-L-ليسين حل الأسهم عن طريق إذابة 5 ملغ من بولي-L-ليسين في 10 مل العازلة بورات.
      2. يعد حل العاملة عن طريق تمييع 1 مل بولي-L-ليسين المالية في 49 مل بورات العازلة.
      3. إعداد بورات العازلة، ودرجة الحموضة 8.4 من خلال البدء مع 395 مل _O 2 درهم ثم إضافة كافة المكونات (1.24 غ حمض البوريك + 1.9 غرام من البوراكس). ضبط درجة الحموضة إلى 8.4 من 1 M هيدروكسيد الصوديوم. ضبط 400 مل وتصفية مع 0.2 ميكرون تصفية غشاء النايلون تحت غطاء محرك السيارة.
      4. يعد حل HBSS، ودرجة الحموضة 7.2 من خلال البدء مع 445 مل درهم _{2 O} وإضافة جميع المكونات الأخرى (50 مل 10X HBSS المالية + 1.2 غرام HEPES). ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 من 1 N حمض الهيدروكلوريك، وبرينانوغرام إلى 500 مل وتصفية مع 0.2 ميكرون تصفية غشاء النايلون تحت غطاء محرك السيارة.
      5. إعداد المتوسطة تصفيح: DMEM / F12 مع 10٪ الجنين المصل البقري. مرشح مع 0.2 ميكرون تصفية غشاء النايلون تحت غطاء محرك السيارة.
      6. إعداد متوسط ​​النمو الكامل: ل50 مل Neurobasal المتوسطة، إضافة المكملات الغذائية (500 ميكرولتر GlutaMax (100X) + 500 ميكرولتر الجلوكوز + 1 مل B-27 (50X) + 500 ميكرولتر من محلول مضاد حيوي، مضاد فطري (100X) + 100 ميكرولتر 7.5٪ بيكربونات الصوديوم. فلتر مع 0.2 ميكرون تصفية غشاء النايلون تحت غطاء محرك السيارة.
   2. قبل يومين الثقافة:
      1. معطف اثني عشر 35 ملم أطباق الزجاج السفلي مع 2 مل من محلول العمل بولي-L-ليسين، والحفاظ على تحت غطاء محرك السيارة O / N.
   3. قبل يوم واحد الثقافة:
      1. فارغة عامل طلاء من الأطباق وشطف مع ده _{2 O.} السماح للأطباق لتجف لمدة ساعة تحت غطاء محرك السيارة.
      2. إعداد المتوسطة الطلاء (DMEM / F12 مع 10٪ مصل بقري جنيني (10٪ من الحل الكلي). الماصة 2 مل المتوسطة فيكل طبق، واحتضان O / N ^عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2.
         ملاحظة: من المهم تجنب أطباق ثقافة البلاستيكية عند زراعة. استخدام الأطباق الزجاجية القاع (لالمجاهر المقلوب) أو coverslips الزجاج (لالمجهر تستقيم) ينتج صورا حادة وواضحة. بالمقارنة مع طبق من البلاستيك أسفل، وطبق من الزجاج السفلي يتجنب الأشكال غير المرغوب فيها أو وهج خلال المجهر الفلورسنت.
2. بروتوكول زراعة الخلايا:
   1. وطرح المبردة HBSS العازلة (100-150 مل)، 100 مم أطباق بتري، ملقط، مقص، 50 مل أنابيب، و 15 مل أنابيب تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في غطاء محرك السيارة.
   2. الموت ببطء الفئران الحوامل مع استنشاق قاتلة من 5٪ سيفوفلوران تحت غطاء محرك السيارة خارج غرفة الثقافة.
   3. تعقيم مع 70٪ ETOH، خيمة جلد البطن باستخدام ملقط في حين خفض من الذيل يصل في منتصف البطن cavity.Open الرحم باستخدام مقص لفضح المشيمة.
   4. إزالة 8-10 الأجنة E18. جيش التحرير الشعبى الصينىم 8-10 الأجنة في أطباق بتري تحتوي على حل HBSS.
   5. عقد الجزء الخلفي من رأس الجنين بالملقط، ثم استخدام مقص لقطع الرأس من الجسد. وضعه في طبق بتري أخرى مليئة 5-7 مل من HBSS. نقل طبق على غطاء محرك السيارة.
   6. ملء اثنين إضافيين طبق بتري 100 ملم مع HBSS الباردة.
   7. قشر جانبا الجمجمة، ومغرفة الدماغ في طبق بتري جديدة مليئة HBSS.
   8. استخدام ملقط منحنية حادة، المخيخ منفصل وجذع الدماغ من المخ، ثم نقل الدماغ على طبق بتري جديد مع HBSS الباردة في ذلك.
   9. استخدام ملاقط لتأمين فصل نصفي الكرة الأرضية مع ملقط المنحنية. إزالة السحايا. عزل القشرة الأمامية وقطع نقل إلى تميز أنابيب الطرد المركزي 15 مل.
   10. ملء أنبوب 15 مل مع الطازجة 2 مل HBSS وإضافة 20 ميكرولتر التربسين EDTA (10X مزيج مركزة مع 0.5٪ التربسين و 5.3 ملي EDTA) إلى كل أنبوب 15 مل.
   11. احتضان 10-15 دقيقة في RT. دوامة بلطف أنبوب كل بضع دقائق، لا تسمح تسوية.
   12. بالعربيةثالثا 10-15 دقيقة، واستخدام الزجاج ماصة لإزالة HBSS القديم وشطف مرتين مع HBSS الجديد.
   13. تزج في مثبط التربسين (1 ملغ / مل، 2 ملغ التربسين المانع في 2 مل HBSS)، وتخلط جيدا، والسماح لها الجلوس 5 دقائق. يغسل مرتين مع HBSS الطازجة.
   14. باستخدام ماصة الزجاج مع لمبة المطاط، وقطع الدماغ يسحن 10-15 مرات ببطء شديد وذلك لتجنب bubbles.Triturate مرة أخرى باستخدام ماصة معايرة وتلميح العقيمة التي يبلغ قطرها طرف انخفاض ببطء شديد حتى متجانسة.
   15. نقل فصل الخلايا في كثافة المطلوبة لأطباق ثقافة المغلفة (50 خلية / MM2) مستعدين قبل. احتضان O / N ^عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO2.
   16. بعد 24 ساعة، استبدال المتوسطة DMEM / F12 مع تقدم طازجة النمو الكامل المصل خالية Neurobasal المتوسطة.
   17. الحفاظ على الخلايا في جميع الأوقات في 5٪ CO _2/95٪ هواء الغرفة حاضنة مرطب لل12-14 يوما على الأقل قبل التجريب. استكمال خلايا كل 5-6 أيام مع Neurobasal متوسطة جديدة تحل محل ما يقرب من 50٪ من متوسط ​​العمر.

2. بطاقات المواد الفلورية وسيتولوجية مناعية

ملاحظة: تم تنفيذ وسم مناعي من مزارع الخلايا القشرية الأولية في أسفل أطباق زراعة الخلايا الزجاج 35 ملم مع حجم العمل من 1 مل.

1. غسل طبق من الزجاج السفلي مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة 7.4 درجة الحموضة (PBS).
2. إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 15 دقيقة في RT.
3. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وpermeabilize مع 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
4. علاج الخلايا لمدة 20 دقيقة في RT مع وصمة عار محددة F-أكتين، AlexaFluor 488 Phalloidin (01:40، 25 ميكرولتر من Phalloidin في 1 مل PBS).
5. شطف الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني ومنع مع 10٪ مصل الماعز العادي في RT لمدة 1-2 ساعة.
6. تمييع الأجسام المضادة بولكلونل الدجاج مكافحة MAP2 (1: 2500) في برنامج تلفزيوني مع 2٪ مصل الماعز العادي واحتضان O / N عند 4 ^{درجة مئوية.}
7. بعد الحضانة، وشطف في برنامج تلفزيوني مرتين.
8. تمييع الضد الثانوية (اليكسا Rإد الماعز 594 مترافق مفتش مكافحة الدجاج (1: 500) مع 2٪ مصل الماعز العادي واحتضان لمدة 2 ساعة على RT.
9. شطف مع برنامج تلفزيوني وإضافة 10 ميكرولتر / طبق من Hoescht صبغ.
10. احتضان 3 دقائق على RT ويغسل مع برنامج تلفزيوني مرتين.
    ملاحظة: الخلايا المسمى الآن جاهزة للخطوة 3 (F-الأكتين نقاط والعد مستمر).
11. الحفاظ على عينة الخلايا مع 100 ميكرولتر من antifade كاشف كعامل coverslipping والحفاظ على 4 ^{درجة مئوية في} الظلام لمدة التخزين على المدى الطويل.
    ملاحظة: Phalloidin مستقرة نسبيا في برنامج تلفزيوني في +4 درجة مئوية في الظلام لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع ومضان يمكن الحفاظ عليها مع antifade الكواشف coverslipping. ومع ذلك، يتم الحصول على الصور المثالية 1-3 أيام بعد تلطيخ منذ Phalloidin قد تبدأ في نزع فتيل خارج مع التخزين الموسعة.

3. F-الأكتين عد نقاط و

1. تشغيل المجهر الفلورسنت والتبديل إلى 20 × الهدف. برنامج المجهر فتح، وإنشاء برنامج في 1280 × 960 بكسل حجم الصورة، و 0.17 ميكرون دقة وضوح الصورة / بكسل في 1 × التكبير.
2. الحصول على صور من وصفت المشارك F-الأكتين / الخلايا العصبية MAP2 تحت الأخضر (495 نانومتر) / أحمر (613 نانومتر) قنوات الفلورسنت.
3. اختيار 5 الأخضر (F-الأكتين) / الأحمر (MAP2) immunolabeled / الأزرق (Hoescht) الصور الفلورسنت من الخلايا العصبية الفردية مع العرش شجيري محددة بوضوح.
4. تحديد F-الأكتين هياكل الغنية في المرتبة الثانية قطاع شجيري (مدى طول 25-75 ميكرون) مع المناعي MAP2 المستمر.
5. وتناوب على منطقة مختارة من الصور إلى المستوى الأفقي. نسخ ولصق كصورة جديدة.
6. طرح الخلفية من الصور، وذلك باستخدام تعديلات متسقة لكل طبق.
7. عد-F الأكتين الخضراء نقاط ومشرقة وتتبع طول الجزء شجيري اختيار يدويا من قبل مراقبين مستقلين المدربين. تصدير البيانات إلى ملف البيانات.
8. حساب الكثافة بقسمة مجموع F-الأكتين نقاط والمسمى (N) من طول (L) من MAP2 المسمى التشعبات. البيانات كما أعرب عن عدد من F-ميلاننقاط والقصدير في 10 ميكرون من التغصنات
   ملاحظة: نقاط و(حجم ≤1.5 ميكرون) من مضان F-أكتين مع كثافة الذروة لا يقل عن 50٪ أعلى من متوسط ​​كثافة تلطيخ في رمح شجيري كانت مدرجة في كل جزء شجيري المحدد.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في الأساليب الحالية، ونحن أول الفئران ثقافة العصبونات القشرية في منخفض الكثافة في أطباق الزجاج السفلي 35 مم، والذي يسمح لنا لتحديد التشعبات من الخلايا العصبية الفردية. في الشكل 1، وعلى النقيض تدخل الفرق (DIC) صور تظهر تغيرات شكلية في تطوير ال?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذا البروتوكول، وصفنا زراعة الفئران الخلايا العصبية القشرية في منخفض الكثافة في أطباق الزجاج السفلي 35 مم والتي تسمح لنا لتحديد التشعبات من الخلايا العصبية الفردية. التالي، ونحن نستخدم Phalloidin وتلطيخ MAP2 للكشف عن تغيرات الجذعية. ثم، استخدمنا برنامج خاص لقياس التغير?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium	Life Technologies	10565-018
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054
Poly-L-Lysine	Sigma	P9155
Boric acid	Sigma	B0252
Borax	Sigma	B9876
GlutaMax	Life Technologies	35050-061	100X
Glucose	VWR	101174Y
HBSS	Sigma	H4641	10X
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
B-27 supplement	Life Technologies	17504-044	50X
Antibiotic-Antimycotic solution	Cellgro	30004CI	100X
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080
Vannas Scissors	World Precision Instruments	500086
Iris Scissors	World Precision Instruments	500216
Iris Forceps	World Precision Instruments	15914
Dumont #7 Forceps	World Precision Instruments	14097
Dumont #5 Forceps	World Precision Instruments	14095
ProLong Gold	Life Technologies	P36930
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Cover glass	VWR	631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin	Life Technologies	A12379
Normal horse serum	Life Technologies	26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2	abcam	Ab92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG	Life Technologies	A11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342	Life Technologies	R37605
NIS-Elements software package	Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope	Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene nylon membrane filter	Fishersci	151-4020