大鼠皮层神经元丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）泪点的量化

摘要

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

摘要

肌动蛋白丝状蛋白（F-肌动蛋白）起着spinogenesis，突触可塑性，突触稳定的重大作用。树突状F-肌动蛋白丰富的结构变化表明突触的完整性和连通性的改变。在这里，我们为主要培养大鼠皮层神经元，鬼笔环肽染色F-肌动蛋白泪点，和随后的量化技术的详细协议。首先，E18大鼠胚胎的额叶皮层解离成低密度细胞培养，然后在体外生长至少12-14天的神经元。以下实验性治疗，皮质神经元染色AlexaFluor 488鬼笔环肽（标记树枝状F-肌动蛋白泪点）和微管相关蛋白2（MAP2;验证神经元细胞和树突完整性）。最后，专门的软件，用于分析和量化随机选择的神经元树突。 F-肌动蛋白丰富的结构被确定二阶树突分支（长度范围25-75＆＃181;米），连续MAP2免疫。这里介绍的协议将是调查到实验处理后续树突突触结构的变化的有用方法。

引言

本研究的主要目标是开发测量（估计）的神经元的树突状网络的突触完整性的可靠方法。在这里，我们描述了使用鬼笔环肽染色和使用专门的（NIS元素）软件与后续分析树突免疫细胞化学（ICC）检测结合原代大鼠神经细胞培养F-肌动蛋白泪点的定量。

标毒肽对大型和小型丝（F-肌动蛋白）相似的亲和力，但不绑定到单体球状肌动蛋白（G-actin的），不像有些肌动蛋白抗体^，1。鬼笔环肽非特异性结合是微不足道的，因此，细胞成像过程中提供最小的背景。鬼笔环肽是比通常被用于标记细胞蛋白为荧光显微镜，其允许由鬼笔环肽F-肌动蛋白的更强烈标记抗体小得多。因此，在神经元F-肌动蛋白本地化的详细图像可以通过使用标记的鬼笔环肽而获得的。

毒伞素（F-肌动蛋白），神经元树突染色产生离散的"热点"或明亮的"泪点"，它代表了各种树状结构，包括成熟的刺，无刺的突触²和不成熟的刺。未成熟的棘包括薄丝状伪足和某些形式的贴剂的形态，并且可以代表spinogenesis ³的启动。未成熟的刺和非多刺补丁缺乏PSD95 ^4。从而在生产F-肌动蛋白导致不仅刺后续变化，而 ​​且还附加树枝状结构的变化，使得鬼笔环肽进行调查synaptodendritic完整性^5-7的重要工具。一般情况下，鬼笔环肽阳性（F-肌动蛋白）泪点的数字反映了积极的突触之间的平衡（兴奋和抑制），肌动蛋白和突触的稳定性^8。

虽然研究特异性T是非常重要的突触（即，兴奋性刺）的ypes，当治疗的靶标是未知有必要首先估计各种树枝状结构的总体完整性。由于F-肌动蛋白是树突棘和其它结构，包括抑制性突触，改变的数目F-肌动蛋白泪点的可指示synaptopathy的主要组成部分。这synaptopathy然后可用于更具体的变化进一步调查。我们的检测多种类型的突触/结构的量化方法产生的树突突触的改变（增加和减少）以下的各种实验性治疗的总体估计。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

所有动物方案进行了审查，并经动物护理和使用委员会在南卡罗来纳大学（保证号码:A3049-01）的批准。

1.低密度胚胎神经文化

1. 初级皮层神经元文化的制备
   1. 解决方案:
      1. 由5毫克多聚L-赖氨酸溶解在10毫升硼酸盐缓冲液制备聚-L-赖氨酸原液。
      2. 制备通过在49毫升硼酸缓冲液稀释1毫升聚L-赖氨酸库存工作溶液。
      3. 通过395毫升卫生署_{2 O}开始，然后添加的所有成分（1.24克硼酸+1.9克硼砂）准备硼酸盐缓冲液，pH值8.4。为1M NaOH调节pH值至8.4。调整至400毫升，并引擎盖下的0.2微米尼龙滤网过滤。
      4. 通过445毫升卫生署_{2 O}开始，添加所有其他配料准备HBSS液，pH值7.2（50毫升10X HBSS股票+1.2克HEPES）。由1N盐酸，BRI调节pH至7.2纳克至500ml，并与发动机罩下的0.2微米尼龙滤网过滤。
      5. 准备电镀培养基:DMEM / F12，用10％的胎牛血清。与引擎盖下的0.2微米的尼龙膜滤膜过滤。
      6. 准备完全生长培养基:向50ml Neurobasal培养基中添加添加剂（500微升GLUTAMAX（100X）+ 500微升葡萄糖+1毫升B-27（50X）+ 500微升抗生素抗真菌溶液（100倍）+ 100微升7.5％小苏打与引擎盖下的0.2微米的尼龙膜滤膜过滤。
   2. 文化前两天:
      1. 外套1235毫米玻璃底菜用2ml聚L-赖氨酸的工作溶液，并保持罩O / N下。
   3. 文化前一天:
      1. 从培养皿空涂层剂并用的DDH _{2 O}冲洗允许碗碟干燥发动机机罩下一个小时。
      2. 制备电镀培养基（DMEM / F12，用10％胎牛血清（总溶液的10％）。加入2毫升培养基成每道菜和孵育O / N ^在 37℃，5％ _的 CO 2。
         注意:培养时，为了避免塑料培养皿是很重要的。玻璃底菜（适用于倒置显微镜）或盖玻片（适用于正置显微镜）的使用产生锐利和清晰的图像。相比于塑料底皿中，在玻璃底培养皿荧光显微镜中避免了不必要的色调或眩光。
2. 细胞培养协议:
   1. 放冷藏的HBSS缓冲液（100-150毫升），100 25mm培养皿，镊子，剪刀，50ml试管，并在UV光下15ml试管中罩。
   2. 安乐死有5％的七氟烷吸入致死孕鼠引擎盖下培养室之外。
   3. 用70％乙醇，帐幕使用镊子而从尾部上腹部cavity.Open用剪刀以暴露胎盘子宫的中间切割下腹部的皮肤消毒。
   4. 删除8-10 E18胎儿。解放军CE含HBSS液的培养皿8-10胎儿。
   5. 握住钳子胎儿的后脑​​勺，然后用剪刀从身体切断头。将其放置在另一个培养皿中充满了5-7毫升的HBSS。转移菜罩。
   6. 装满冷的HBSS两个额外百毫米培养皿。
   7. 皮尔一边头骨和大脑舀到一个新的培养皿中充满了HBSS。
   8. 用锋利弯钳，独立的小脑和脑干脑，大脑再冷HBSS中转移到一个新的培养皿。
   9. 用镊子固定，半球用弯钳分离。删除脑膜;隔离额叶皮层和传输块放入标有15ml离心管中。
   10. 用新鲜2毫升HBSS填充15ml试管中，加入20微升胰蛋白酶EDTA（10倍与0.5％胰蛋白酶和5.3毫米EDTA。浓缩的混合物），以每次15毫升管。
   11. 孵育10-15分钟在室温。轻轻旋转管每隔几分钟，不允许沉降。
   12. 房颤之三10-15分钟，用玻璃吸管移除旧的HBSS，并与新的HBSS冲洗两次。
   13. 浸入胰蛋白酶抑制剂（1毫克/毫升，2毫克胰蛋白酶在2毫升HBSS抑制剂），拌匀，让它坐5分钟。用新鲜的HBSS洗两次。
   14. 使用玻璃吸管与橡胶球，磨碎脑件10-15倍非常缓慢，以避免bubbles.Triturate再次使用校准的移液管和一个无菌尖端具有减小尖端直径非常缓慢直至均匀。
   15. 转移解离细胞以所需密度预先制备涂布培养皿（50个细胞/平方毫米）。孵育O / N在^{37℃，5％CO2。}
   16. 24小时后，用新鲜的完全生长的无血清Neurobasal培养基替代DMEM / F12培养基。
   17. 保持在任何时候都将细胞在_5％的CO 2/95％的室内空气加湿培养箱用于实验前至少12-14天。补充细胞每5-6天用新鲜的Neurobasal培养基更换旧培养基的约50％。

2.荧光标记和免疫组化

注:原代皮质细胞培养物的免疫荧光标记是在玻璃底部35 MM细胞培养皿进行与1毫升工作体积。

1. 用磷酸盐缓冲盐水pH值7.4（PBS）洗玻璃底皿两次。
2. 用4％多聚甲醛的细胞在室温15分钟。
3. 用PBS洗涤细胞两次并在PBS中与0.1％的Triton X-100通透5分钟。
4. 处理细胞在室温20分钟用F-肌动蛋白特异性染色，AlexaFluor 488鬼笔环肽（1:40，25微升鬼笔环肽的在1毫升PBS）中。
5. 冲洗细胞两次，用PBS，并在室温，用10％正常山羊血清阻断1-2小时。
6. 稀释的鸡多克隆抗MAP2抗体（1:2,500）在PBS中的2％正常山羊血清，并在^4℃孵育O / N
7. 温育后，冲洗在PBS两次。
8. 稀释二级抗体（Alexa的 - [RED 594缀合的山羊抗鸡IgG（1:500），用2％正常山羊血清和在室温下孵育2小时。
9. 用PBS冲洗，加10微升/赫司特染料菜。
10. 孵育3分钟在室温下，并用PBS洗两次。
    注:现在标​​记的细胞准备第3步（F-actin的泪点计数）。
11. 保持细胞样品用100微升抗淬灭剂作为盖片剂，并保持^在 4℃在黑暗中长时间存放。
    注意:鬼笔环肽是在PBS中在长达1周和荧光能与抗褪色盖片的试剂保留在黑暗+4℃下相对稳定。不过，最佳的图像是从染色后1-3天获得自鬼笔环肽可以开始扩展存储扩散出去。

3. F-肌动蛋白泪点计数

1. 打开荧光显微镜，并切换到20倍的目标。打开显微镜软件，并设置方案在1280×960像素的图像尺寸，以及0.1在1倍变焦7微米/像素的图像分辨率。
2. 根据获取绿色（495纳米）/红（613 nm）的荧光渠道共标记F-肌动蛋白/微管相关蛋白神经元的图像。
3. 选择5格林（F-肌动蛋白）/红（MAP2）免疫标记/蓝（赫司特）有明确界定的树突状乔木单个神经元的荧光图像。
4. 确定二阶树突段（长度范围25-75微米）连续MAP2免疫的F-肌动蛋白丰富的结构。
5. 图像的所选区域旋转到水平位置。复制和粘贴为新的图像。
6. 减去的图像的背景，使用为每个菜一致的调整。
7. 算上亮绿色F-肌动蛋白泪点和手动由训练有素的独立观察员跟踪选定的树突状段的长度。将数据导出到电子表格文件。
8. 计算由长度（L）的MAP2标记树突将总F-肌动蛋白标记的泪点（N）的密度。 Express数据为F-AC的数每10微米枝蔓锡泪点
   注意:泪点F-肌动蛋白荧光与在树突轴染色的平均强度以上的至少50％的峰强度的（大小≤1.5微米）包括在每个所选树突段。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

在本发明的方法，我们首先培养的大鼠密度低35毫米的玻璃底菜，这使我们能够识别单个神经元的树突皮层神经元。在图1中，微分干涉对比（DIC）图像显示在天4，6，10，14， 在体外 21和27显影胎大鼠皮质神经元的形态学变化。注意，长度和树突的数量与培养的大鼠原代神经元的成熟增加。神经元在实验中只后14天成熟使用。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

在这个协议中，我们描述了在35毫米的玻璃底菜低密度这使我们能够识别单个神经元树突培养大鼠皮层神经元。接下来，我们使用鬼笔环肽和MAP2染色检测树枝状的改变。然后，我们使用专门的软件来量化在F-肌动蛋白泪点的变化。

为了确定F-肌动蛋白泪点的个体神经元的神经全网络必须是清晰可见的变化，这使得从单个神经元适当二阶树突段的选择。低密度电镀是为了既可视?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium	Life Technologies	10565-018
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054
Poly-L-Lysine	Sigma	P9155
Boric acid	Sigma	B0252
Borax	Sigma	B9876
GlutaMax	Life Technologies	35050-061	100X
Glucose	VWR	101174Y
HBSS	Sigma	H4641	10X
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
B-27 supplement	Life Technologies	17504-044	50X
Antibiotic-Antimycotic solution	Cellgro	30004CI	100X
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080
Vannas Scissors	World Precision Instruments	500086
Iris Scissors	World Precision Instruments	500216
Iris Forceps	World Precision Instruments	15914
Dumont #7 Forceps	World Precision Instruments	14097
Dumont #5 Forceps	World Precision Instruments	14095
ProLong Gold	Life Technologies	P36930
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Cover glass	VWR	631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin	Life Technologies	A12379
Normal horse serum	Life Technologies	26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2	abcam	Ab92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG	Life Technologies	A11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342	Life Technologies	R37605
NIS-Elements software package	Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope	Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene nylon membrane filter	Fishersci	151-4020