Quantification des filamenteuses Actine (F-actine) punctas chez le rat neurones corticaux

Résumé

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Résumé

Filamenteux protéine d'actine (actine F) joue un rôle majeur dans spinogenèse, la plasticité synaptique et la stabilité synaptique. L'évolution des structures riches dendritiques F-actine suggèrent des modifications dans l'intégrité synaptique et la connectivité. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la culture de rat primaires neurones corticaux, phalloïdine coloration pour puncta F-actine, et les techniques de quantification ultérieures. Tout d'abord, le cortex frontal des embryons de rat E18 sont dissociées dans une culture de cellules de faible densité, alors les neurones cultivés in vitro pendant au moins 12-14 jours. Après un traitement expérimental, les neurones corticaux sont colorées avec AlexaFluor 488 phalloïdine (pour marquer les points lacrymaux F-actine dendritique) et associée aux microtubules protein 2 (MAP2; pour valider les cellules neuronales et l'intégrité dendritique). Enfin, un logiciel spécialisé est utilisé pour analyser et quantifier les dendrites neuronales choisis au hasard. F-actine structures riches sont identifiés sur le deuxième ordre branches dendritiques (gamme 25-75 et de la longueur# 181; m) avec immunofluorescence MAP2 continue. Le protocole présenté ici sera une méthode utile pour étudier l'évolution des structures des synapses dendritiques subséquentes à des traitements expérimentaux.

Introduction

L'objectif principal de cette étude est de développer une méthode fiable de mesure (estimation) de l'intégrité synaptique du réseau dendritique neuronale. Nous décrivons ici la quantification des points lacrymaux F-actine dans rat primaire des neurones en culture en utilisant une combinaison de phalloïdine coloration et immunocytochimique (ICC) détection des dendrites avec une analyse ultérieure en utilisant (NIS-Elements) spécialisée logiciel.

Phallotoxins marquées ont une affinité similaire pour les grands et petits filaments (F-actine), mais ne se lient pas à monomère actine globulaire (G-actine), contrairement à certains anticorps d'actine ^1. La liaison non spécifique de phalloïdine est négligeable, offrant ainsi fond minimal lors de l'imagerie cellulaire. Phalloïdine est beaucoup plus faible que les anticorps qui sont généralement utilisées pour marquer les protéines cellulaires par microscopie à fluorescence, ce qui permet beaucoup plus intense marquage de l'actine F par la phalloïdine. Ainsi, des images détaillées de localisation F-actine dans les neurones peuvent êtreobtenue grâce à l'utilisation de phalloïdine marquée.

Phalloïdine (F-actine) coloration des dendrites neuronales génère discrets "points chauds" ou brillant "puncta», qui représentent une variété de structures dendritiques, y compris les épines matures, synapses non épineuses ^{2 et} épines immatures. Épines immatures comprennent filopodes minces et certaines formes de correctif morphologie, et peuvent représenter l'ouverture d'spinogenèse ^3. Épines immatures et des correctifs non-épineux manquent PSD95 ^4. Evolution de la production de plomb F-actine des variations ultérieures non seulement épines mais aussi des structures dendritiques supplémentaires, faisant ainsi phalloïdine un outil important pour étudier l'intégrité synaptodendritic ^5-7. En général, le nombre de phalloïdine-positive (F-actine) puncta reflètent un équilibre entre les synapses actives (excitateurs et inhibiteurs), dynamique de l'actine et de la stabilité de la synapse ^8.

Bien qu'il soit important d'étudier spécifique types de synapses (c.-à épines excitateurs), lorsque la cible d'un traitement est inconnue, il faut d'abord évaluer l'intégrité générale d'une variété de structures dendritiques. Depuis F-actine est une composante majeure des épines dendritiques et d'autres structures, y compris les synapses inhibitrices, un nombre altéré de puncta F-actine peut indiquer un synaptopathy. Cette synaptopathy peut alors être étudiée plus pour des modifications plus spécifiques. Notre méthode de quantification pour détecter plusieurs types synaptiques / structures donne une estimation globale des modifications synaptiques dendritiques (augmentations et diminutions) suivantes divers traitements expérimentaux.

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Protocole

Tous les protocoles d'animaux ont été examinés et approuvés par le soin et l'utilisation Comité animale de l'Université de la Caroline du Sud (numéro d'assurance: A3049-01).

1. basse densité neuronale embryonnaire Culture

1. Préparation pour la culture de neurones corticaux primaires
   1. Solutions:
      1. Préparer Poly-L-lysine solution mère en dissolvant 5 mg de poly-L-lysine dans 10 ml de tampon borate.
      2. Préparer la solution de travail en diluant 1 ml Poly-L-lysine Stock dans 49 ml Tampon borate.
      3. Préparer un tampon de borate, pH 8,4 en commençant par 395 DH _{2 O,} puis en ajoutant tous les ingrédients (1,24 g d'acide borique + 1,9 g de borax). Ajuster le pH à 8,4 par 1 M NaOH. Ajuster à 400 ml et on filtre avec 0,2 um filtre à membrane en nylon sous le capot.
      4. Préparer la solution HBSS, pH 7,2 en commençant par 445 DH _{2 O} et en ajoutant tous les autres ingrédients (50 ml 10X HBSS Stock + 1,2 g HEPES). Ajuster le pH à 7,2 par du HCl 1 N, bring à 500 ml et d'un filtre de 0,2 um filtre à membrane en nylon sous le capot.
      5. Préparer le milieu de placage: DMEM / F12 avec du sérum de veau fœtal à 10%. Filtre à 0,2 um filtre à membrane en nylon sous le capot.
      6. Préparer un milieu de croissance complet: A 50 ml de milieu Neurobasal, ajouter les suppléments (500 ul Glutamax (100X) + 500 ul de glucose + 1 ml de B-27 (50X) + 500 pi de solution antibiotique-antimycotique (100X) + 100 ul de 7,5% bicarbonate de sodium. filtre à 0,2 um filtre à membrane en nylon sous le capot.
   2. Deux jours avant la culture:
      1. Manteau de douze 35 mm plats à fond de verre avec 2 ml de solution de travail Poly-L-lysine, et garder sous le capot O / N.
   3. Un jour avant la culture:
      1. Agent d'enrobage vide de la vaisselle et rincer à l'ddH ₂ O. Autoriser les plats à sécher pendant une heure sous une hotte.
      2. Préparer le milieu placage (DMEM / F12 avec 10% de sérum de veau fœtal (10% de la solution totale). La pipette 2 ml de milieu danschaque plat, et incuber O / N ^{à 37 °} C, 5% de CO _2.
         Note: Il est important d'éviter les boîtes de culture en plastique lors de la culture. L'utilisation de plats à fond de verre (pour microscopes inversés) ou des lamelles de verre (pour microscopes droits) donne des images nettes et claires. Par rapport à un plat en plastique à fond, le plat à fond de verre évite teintes indésirables ou l'éblouissement pendant la microscopie à fluorescence.
2. Protocole de culture cellulaire:
   1. Mettez au réfrigérateur tampon HBSS (100-150 ml), 100 mm boîtes de Petri, des pinces, des ciseaux, tubes de 50 ml et 15 ml tubes sous lumière UV dans la hotte.
   2. Euthanasier rat enceinte de l'inhalation létale de 5% sévoflurane sous le capot extérieur de la salle de culture.
   3. Stériliser avec EtOH à 70%, tente la peau de l'abdomen inférieur à l'aide des pinces pendant la coupe de la queue au milieu de l'abdomen cavity.Open l'utérus en utilisant des ciseaux pour exposer le placenta.
   4. Retirer 8-10 fœtus E18. PlaCE 8-10 fœtus dans des boîtes de Pétri contenant une solution HBSS.
   5. Maintenez l'arrière de la tête du fœtus avec une pince, puis utilisez des ciseaux pour couper la tête du corps. Placez-le dans une autre boîte de Pétri remplie de 5-7 ml de HBSS. Transfert plat à capuche.
   6. Remplir deux boîte de Pétri de 100 mm supplémentaire avec HBSS froid.
   7. Peel crâne de côté, et Scoop cerveau dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de HBSS.
   8. Utilisez une pince tranchants courbes, le cervelet et séparée du tronc cérébral du cerveau, puis transférer cerveau à une nouvelle boîte de Pétri avec HBSS froid en elle.
   9. Utilisez des pinces pour fixer, séparer les hémisphères avec une pince courbes. Retirer méninges; isoler cortex frontal et des morceaux de transfert dans des tubes de 15 ml à centrifuger marqués.
   10. Remplir le tube de 15 ml avec des produits frais 2 ml de HBSS et ajouter 20 ul de trypsine EDTA (10x mélange concentré avec 0,5% de trypsine et mM EDTA 5.3.) À chaque tube de 15 ml.
   11. Incuber 10-15 min à température ambiante. Agitez doucement le tube toutes les quelques minutes, ne permettent pas de régler.
   12. Un Fter 10-15 min, l'utilisation pipette en verre pour enlever la vieille HBSS et rincer deux fois avec HBSS nouvelle.
   13. Plongez dans l'inhibiteur de trypsine (ml, inhibiteur de la trypsine 1 mg / 2 mg dans 2 ml de HBSS), bien mélanger et laisser reposer 5 min. Laver deux fois avec HBSS frais.
   14. En utilisant une pipette en verre avec poire en caoutchouc, des morceaux de cerveau Broyez 10-15 fois très lentement afin d'éviter bubbles.Triturate nouveau à l'aide d'une pipette calibrée et une pointe stérile avec un diamètre de pointe réduite très lentement jusqu'à homogénéité.
   15. Transfert dissocié les cellules à une densité désirée pour boîtes recouvertes culture (50 cellules / mm2) préparé au préalable. Incuber O / N ^{à 37 °} C, 5% de CO2.
   16. Après 24 heures, remplacer le milieu DMEM / F12 avec fraîchement préparé milieu Neurobasal de croissance complet sans sérum.
   17. Maintenir les cellules à tout moment dans un _{CO 2/95%} d'air ambiante incubateur humidifié à 5% pendant au moins 12-14 jours avant l'expérimentation. Compléter les cellules tous les 5-6 jours avec un milieu Neurobasal frais remplacer environ 50% de l'ancien milieu.

2. Marquage fluorescent et Immunocytochimie

Remarque: Le marquage par immunofluorescence des cultures de cellules corticales primaires a été effectuée en 35 mm du fond des boîtes de culture cellulaire de verre avec un volume utile de 1 ml.

1. Laver le plat à fond de verre à deux reprises avec un tampon phosphate salin pH 7,4 (PBS).
2. Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde 4% pendant 15 min à température ambiante.
3. Laver les cellules deux fois avec du PBS et perméabiliser avec 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min.
4. Traiter les cellules pendant 20 min à température ambiante avec un colorant spécifique F-actine, AlexaFluor 488 phalloïdine (1h40, à 25 pi de phalloïdine dans 1 ml de PBS).
5. Rincer les cellules deux fois avec du PBS et bloquer avec 10% de sérum de chèvre normal à température ambiante pendant 1-2 heures.
6. Diluer l'anticorps polyclonal de poulet anti-MAP2 (1: 2500) dans du PBS avec 2% de sérum de chèvre normal et incuber O / N à 4 ^{° C}
7. Après l'incubation, rincer deux fois dans PBS.
8. Diluer l'anticorps secondaire (Alexa Red 594 chèvre conjugué IgG anti-poulet (1: 500) avec 2% de sérum de chèvre normal et incuber pendant 2 heures à température ambiante.
9. Rincer avec du PBS et ajouter 10 ul / plat du colorant Hoescht.
10. Incuber 3 min à température ambiante et laver avec du PBS deux fois.
    Remarque: Les cellules marquées maintenant prêt pour l'étape 3 (de comptage de points lacrymaux F-actine).
11. Préserver échantillon de cellules avec 100 ul de antifade réactif comme agent de lamelles et de garder ^{à 4 °} C dans l'obscurité pendant le stockage à long terme.
    Remarque: phalloïdine est relativement stable dans du PBS à 4 ° C dans l'obscurité pendant 1 semaine et la fluorescence peut être conservé avec Antifade réactifs de lamelles. Cependant, les images optimaux sont obtenus à partir de 1-3 jours après coloration depuis phalloïdine peut commencer à diffuser à l'extérieur avec un stockage prolongé.

3. F-actine punctas comptage

1. Allumez microscope à fluorescence et de passer à 20 × objectif. logiciel de microscope ouverte, et mis en place le programme de 1280 × 960 pixels taille de l'image, et de 0,17 um / pixel de résolution d'image à 1 × zoom.
2. Acquérir des images de co-marqué F-actine / neurones MAP2 sous le drapeau vert (495 nm) / rouge (613 nm) canaux fluorescents.
3. Choisissez 5 Green (F-actine) / Rouge (MAP2) immuno / Bleu (Hoescht) images fluorescentes de neurone individuel avec arbres dendritiques clairement définis.
4. Identifier les structures riches F-actine dans second ordre segments dendritiques (plage de longueur 25-75 um) avec immunofluorescence MAP2 continue.
5. Tournez la région sélectionnée d'images à un niveau horizontal. Copier et coller comme une nouvelle image.
6. Soustraire l'arrière-plan des images, en utilisant une cohérentes ajustements pour chaque plat.
7. Comptez le vert F-actine puncta lumineux et tracer la longueur du segment dendritique sélectionné manuellement par des observateurs indépendants formés. Exporter les données vers un fichier tableur.
8. Calculer la masse volumique en divisant F-actine marqué puncta totale (N) par la longueur (L) de la MAP2 marqué dendrites. Data Express que le nombre de F-acétain puncta par 10 um de Dendrite
   Remarque: punctas (taille ≤1.5 um) de la fluorescence F-actine avec une intensité de pic d'au moins 50% au-dessus de l'intensité moyenne de la coloration de l'arbre dendritique ont été inclus dans chaque segment sélectionné dendritique.

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Résultats

Dans les présentes méthodes, nous avons d'abord rat de culture de neurones corticaux à faible densité dans les plats à fond de verre de 35 mm, ce qui nous permet d'identifier les dendrites des neurones individuels. Sur la figure 1, le contraste interférentiel différentiel (DIC) images montrent les changements morphologiques dans le développement foetal neurones corticaux de rat aux jours 4, 6, 10, 14, 21 et 27 in vitro. A noter que la longueur et...

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Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons la culture de neurones corticaux de rat à faible densité dans les plats à fond de verre de 35 mm, qui nous permet d'identifier les dendrites des neurones individuels. Ensuite, nous utilisons phalloïdine et MAP2 coloration pour détecter les changements dendritiques. Ensuite, nous avons utilisé un logiciel spécialisé pour quantifier les changements dans puncta F-actine.

Pour déterminer les changements dans puncta F-actine l'ensemble du résea...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium	Life Technologies	10565-018
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054
Poly-L-Lysine	Sigma	P9155
Boric acid	Sigma	B0252
Borax	Sigma	B9876
GlutaMax	Life Technologies	35050-061	100X
Glucose	VWR	101174Y
HBSS	Sigma	H4641	10X
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
B-27 supplement	Life Technologies	17504-044	50X
Antibiotic-Antimycotic solution	Cellgro	30004CI	100X
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080
Vannas Scissors	World Precision Instruments	500086
Iris Scissors	World Precision Instruments	500216
Iris Forceps	World Precision Instruments	15914
Dumont #7 Forceps	World Precision Instruments	14097
Dumont #5 Forceps	World Precision Instruments	14095
ProLong Gold	Life Technologies	P36930
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Cover glass	VWR	631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin	Life Technologies	A12379
Normal horse serum	Life Technologies	26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2	abcam	Ab92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG	Life Technologies	A11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342	Life Technologies	R37605
NIS-Elements software package	Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope	Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene nylon membrane filter	Fishersci	151-4020