Quantificação de filamentosas actina (F-actina) puncta no Rat neurônios corticais

Resumo

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Resumo

proteína actina filamentosa (F-actina) desempenha um papel importante na spinogenesis, plasticidade sináptica, e estabilidade sináptica. Mudanças nas estruturas ricas F-actina dendríticas sugerem alterações na integridade sináptica e conectividade. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a cultura de rato primária neurônios corticais, coloração faloidina para puncta F-actina, e técnicas de quantificação subsequentes. Em primeiro lugar, o córtex frontal de embriões de rato E18 são dissociados em cultura celular de baixa densidade, em seguida, os neurónios cultivados in vitro durante pelo menos 12-14 dias. Após o tratamento experimental, os neurônios corticais estão manchadas com AlexaFluor 488 faloidina (para rotular o puncta F-actina dendrítica) e proteína associada a microtúbulos 2 (MAP2; para validar as células neuronais e integridade dendrítica). Finalmente, software especializado é usado para analisar e quantificar dendrites neuronais selecionados aleatoriamente. F-actina estruturas ricas são identificados na segunda ordem ramos dendríticas (variação de comprimento 25-75 &# 181; m) com imunofluorescência MAP2 contínua. O protocolo apresentado aqui vai ser um método útil para investigar mudanças nas estruturas sinapse dendríticas subsequentes aos tratamentos experimentais.

Introdução

O principal objetivo deste estudo é desenvolver um método fiável de medição (estimativa) de integridade sináptica da rede dendrítica neuronal. Aqui nós descrevemos quantificação de puncta F-actina em ratos primário neurônios cultivados usando uma combinação de coloração faloidina e detecção imunocitoquímica (ICC) de dendrites com posterior análise usando software especializado (NIS-Elements).

Falotoxina rotulados têm afinidade semelhante tanto para grandes e pequenos filamentos (F-actina), mas não se ligam a monomérica actina globular (G-actina), ao contrário de alguns anticorpos de actina ^1. A ligação não específica de faloidina é insignificante, proporcionando assim fundo mínima durante imagiologia celular. Faloidina é muito menor do que os anticorpos que seria normalmente usado para marcar as proteínas celulares para a microscopia de fluorescência, o que permite muito mais intensa marcação da actina F por faloidina. Assim, imagens detalhadas de localização F-actina em neurônios pode serobtida através do uso de faloidina etiquetada.

Phalloidin (F-actina) coloração das dendrites neuronais gera discretos "pontos quentes" ou brilhante "puncta", que representam uma variedade de estruturas dendríticas, incluindo espinhas maduras, sinapses não-espinhosos ^{2 e} espinhas imaturos. Espinhos imaturos incluem filopódios finas e algumas formas de morfologia remendo, e pode representar o início de spinogenesis ^3. Espinhos imaturos e patches não-espinhosos falta PSD95 ^4. Mudanças na produção de chumbo F-actina para alterações subsequentes não só espinhos, mas também estruturas dendríticas adicionais, tornando assim faloidina uma ferramenta importante para a investigação de integridade synaptodendritic ^5-7. Em geral, o número de (F-actina) puncta faloidina-positivos refletem um equilíbrio entre as sinapses ativas (excitatórios e inibitórios), dinâmica de actina e estabilidade sinapse ^8.

Embora seja importante para o estudo específico tYpes de sinapses (isto é, espinhas excitatórios), quando o alvo de um tratamento é desconhecido, é necessário primeiro estimar a integridade geral de uma variedade de estruturas dendríticas. Uma vez que a actina F é um componente importante das espinhas dendriticas e outras estruturas, incluindo sinapses inibitórias, um número alterado de pontos lacrimais F-actina pode indicar um synaptopathy. Este synaptopathy pode então ser mais investigada para alterações mais específicos. O nosso método de quantificação para a detecção de vários tipos / sinápticas estruturas produz uma estimativa global das alterações sinápticas dendríticas (aumentos e diminuições) após vários tratamentos experimentais.

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Protocolo

Todos os protocolos de animais foram revistos e aprovados pela Comissão de animal Cuidado e Uso da Universidade da Carolina do Sul (número de garantia: A3049-01).

1. baixa densidade Embryonic Neuronal Cultura

1. Preparação para a primária neurônio cultura cortical
   1. soluções:
      1. Preparar a solução da poli-L-lisina por dissolução de 5 mg de poli-L-lisina em 10 ml de tampão de borato.
      2. Preparar uma solução de trabalho por diluição de 1 ml de poli-L-lisina em 49 ml da tampão de Borato.
      3. Preparar tampão de borato, pH 8,4, iniciando com 395 ml de dH _{2 O e} em seguida a adição de todos os ingredientes (1,24 g de ácido bórico + 1,9 g de bórax). Ajustar o pH para 8,4 com NaOH 1 M. Ajustar a 400 ml e filtrar com filtro de membrana de nylon 0,2 m sob o capô.
      4. Preparar a solução de HBSS, pH 7,2, iniciando com 445 ml de dH _{2 O e} a adição de todos os outros ingredientes (50 mL de Stock 10X HBSS + 1,2 g de HEPES). Ajustar o pH para 7,2 com HCl 1 N, BRIng para 500 ml e filtrar com 0,2 m de filtro de membrana de nylon sob o capô.
      5. Prepare meio de plaqueamento: DMEM / F12 com soro de bovino fetal a 10%. Filtro com 0,2 m de filtro de membrana de nylon sob o capô.
      6. Preparar o meio de crescimento completo: Para 50 mL de meio Neurobasal, adicionar os suplementos (500 ul de GlutaMax (100X) + 500 ul de glucose + 1 ml de B-27 (50X) + 500 ul de solução de antibiótico-antimicótico (100X) + 100 ul de 7,5% Bicarbonato de sódio. Filtro com 0,2 m de filtro de membrana de nylon sob o capô.
   2. Dois dias antes da cultura:
      1. Brasão de doze 35 mm pratos com fundo de vidro com 2 ml de solução de trabalho de poli-L-lisina, e manter sob o capô O / N.
   3. Um dia antes da cultura:
      1. Agente de revestimento vazio dos pratos e enxaguar com _DDH 2 O. Permitir pratos para secar por uma hora sob o capô.
      2. Prepare meio de plaqueamento (DMEM / F12 com soro de bovino fetal a 10% (10% da solução total). Pipeta 2 ml de meio emcada prato, e incubar O / N ^a 37 ° C, 5% de CO _2.
         Nota: É importante evitar a pratos de cultura de plástico, quando a cultura. Use de pratos com fundo de vidro (para microscópios invertidos) ou lamelas de vidro (para microscópios verticais) produz imagens nítidas e claras. Comparado a um prato de plástico de baixo, o prato com fundo de vidro evita tons indesejados ou brilho durante microscopia fluorescente.
2. Protocolo de cultura celular:
   1. Colocar refrigerado Tampão HBSS (100-150 ml), 100 mm pratos de petri, fórceps, tesouras, tubos de 50 ml e 15 ml tubos sob luz UV na capa.
   2. Euthanize rato grávida de inalação letal de 5% sevoflurano sob o capô fora da sala de cultura.
   3. Esterilizar com 70% de EtOH, tenda a pele da parte inferior do abdômen, utilizando fórceps durante o corte da cauda para cima no meio da cavity.Open abdominal do útero usando uma tesoura para expor a placenta.
   4. Remover 8-10 E18 fetos. Place 8-10 fetos em placas de Petri contendo solução de HBSS.
   5. Segure a parte de trás da cabeça do feto com uma pinça, em seguida, usar a tesoura para cortar a cabeça do corpo. Coloque-o em uma outra placa de petri preenchida com 5-7 ml de HBSS. Transferir prato para capuz.
   6. Encha dois prato adicional petri 100 mm, com HBSS frio.
   7. Peel lado crânio, e colher cérebro em uma nova placa de petri preenchida com HBSS.
   8. Use uma pinça curvas acentuadas, cerebelo separada e tronco cerebral do cérebro, em seguida, transferir cérebro para uma nova placa de Petri com HBSS frio nele.
   9. Use uma pinça para fixar, separar os hemisférios com uma pinça curva. Remover meninges; isolar córtex frontal e peças de transferência para marcados tubos de centrífuga de 15 ml.
   10. Encha o tubo de 15 ml com frescos 2 ml HBSS e adicionar 20 ul de tripsina EDTA (10x mistura concentrada com 0,5% de tripsina e EDTA 5,3 mM.) A cada tubo de 15 ml.
   11. Incubar 10-15 min à temperatura ambiente. Agite cuidadosamente tubo a cada poucos minutos, não permitem resolver.
   12. After 10-15 min, o uso pipeta de vidro para remover velho HBSS e lavar duas vezes com HBSS novo.
   13. Mergulhe na inibidor de tripsina (1 mg / ml, 2 mg Inibidor de tripsina em 2 ml de HBSS), misture bem e deixe descansar 5 min. Lavar duas vezes com HBSS fresco.
   14. Usando uma pipeta de vidro com bulbo de borracha, pedaços de cérebro Triturar 10-15 vezes muito lentamente, de modo a evitar bubbles.Triturate novamente utilizando uma pipeta calibrada e uma ponta estéril com um diâmetro de ponta reduzida muito lentamente até à homogeneidade.
   15. Transferência dissociada células a densidade desejada para pré-preparados pratos de cultura revestidos (50 células / mm2). Incubar O / N ^a 37 ° C, 5% de CO2.
   16. Após 24 h, substitua meio DMEM / F12 com meio Neurobasal sem soro crescimento completo feitos na hora.
   17. Manter as células em todos os momentos em CO _2/95% ar ambiente incubadora humidificada de 5% de, pelo menos, 12-14 dias antes da experimentação. Suplemento as células a cada 5-6 dias com meio Neurobasal fresco substituindo aproximadamente 50% do meio velho.

2. Labeling fluorescentes e Imunocitoqu�ica

Nota: A marcação imunofluorescente de culturas de células corticais primárias foi realizado em pratos de vidro de fundo de cultura de células de 35 mm com um volume de trabalho de 1 ml.

1. Lava-se a placa com fundo de vidro duas vezes com tampão fosfato salino pH 7,4 (PBS).
2. Fixar as células com paraformaldeído a 4% durante 15 min à TA.
3. Lavar as células duas vezes com PBS e permeabilizar com 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 5 min.
4. Tratar as células durante 20 minutos à TA com uma coloração específica F-actina, AlexaFluor 488 faloidina (01:40, 25 ul de faloidina em 1 mL de PBS).
5. Lavar as células duas vezes com PBS e bloquear com soro de cabra normal a 10% à temperatura ambiente durante 1-2 h.
6. Dilui-se o anticorpo policlonal anti-galinha MAP2 (1: 2500) em PBS com soro de cabra normal a 2% e incubar O / N ^a 4 o C.
7. Após a incubação, lavar duas vezes em PBS.
8. Dilui-se o anticorpo secundário (R AlexaEd cabra-594 conjugado anti-IgG de galinha (1: 500) com soro de cabra normal a 2% e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente.
9. Lavar com PBS e adicionar 10 mL / prato de Hoescht corante.
10. Incubar 3 min à temperatura ambiente e lava-se duas vezes com PBS.
    Nota: As células marcadas agora pronto para o passo 3 (contagem de pontos lacrimais F-actina).
11. Preservar amostra de células com 100 ml de reagente Antifade como um agente de lamínula e manter ^a 4 ° C no escuro para armazenamento a longo prazo.
    Nota: faloidina é relativamente estável em PBS a 4 ° C no escuro durante 1 semana e fluorescência podem ser preservados com antifade reagentes lamínulas. No entanto, imagens óptimas são obtidas a partir de 1-3 dias após coloração com faloidina desde pode começar a difundir para fora com o armazenamento prolongado.

Contando puncta 3. F-actina

1. Ligue microscópio de fluorescência e mudar para 20 × objetiva. microscópio software Open, e configurar programa em 1280 × 960 pixels tamanho da imagem, e 0,1resolução de imagem / pixel 7 mm a 1 × zoom.
2. Adquirir imagens de co-marcado F-actina / neurônios MAP2 sob verde (495 nm) / vermelho (613 nm) canais fluorescentes.
3. Escolha 5 Green (F-actina) / vermelho (MAP2) immunolabeled / Blue (Hoescht) imagens fluorescentes de neurônio individual com mandris dendríticas claramente definidos.
4. Identificar os F-actina estruturas ricas em segunda ordem segmento dendríticas (gama de comprimento 25-75 mm) com imunofluorescência MAP2 contínua.
5. Gire a região selecionada de imagens para um nível horizontal. Copie e cole como uma nova imagem.
6. Subtrair o fundo das imagens, usando uma ajustes consistentes para cada prato.
7. Contar o puncta verde brilhante F-actina e traçar o comprimento do segmento dendrítica selecionados manualmente por observadores independentes treinados. Exportar os dados para um arquivo de planilha.
8. Calcula-se a densidade dividindo F-actina total de pontos lacrimais marcada (N) por o comprimento (L) da MAP2 marcado dendritos. Dados expressos como o número de F-acpontos lacrimais estanho por 10 uM de dendrite
   Nota: puncta (tamanho ≤1.5 uM) de fluorescência F-actina com uma intensidade de pico de pelo menos 50% superior à média de intensidade de coloração no eixo dendríticas foram incluídos em cada segmento seleccionado dendrítica.

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Resultados

Nos presentes métodos, primeiro cultura rato neurônios corticais em baixa densidade em pratos com fundo de vidro de 35 mm, o que nos permite identificar os dendritos de neurônios individuais. Na Figura 1, o contraste interferência diferencial (DIC) imagens mostram as alterações morfológicas no desenvolvimento de rato fetal neurônios corticais nos dias 4, 6, 10, 14, 21 e 27 in vitro. Note-se que o comprimento e o número de dendritos aumentar com a matura...

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Discussão

Neste protocolo, descrevemos a cultura de neurônios corticais de rato em baixa densidade em pratos com fundo de vidro de 35 mm, o que nos permite identificar dendritos de neurônios individuais. Em seguida, usamos faloidina e coloração MAP2 para detectar alterações dendríticas. Em seguida, foi utilizado um software especializado para quantificar mudanças na puncta F-actina.

Para determinar mudanças na puncta F-actina toda a rede neuronal de um neurônio individual deve ser claramente...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium	Life Technologies	10565-018
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054
Poly-L-Lysine	Sigma	P9155
Boric acid	Sigma	B0252
Borax	Sigma	B9876
GlutaMax	Life Technologies	35050-061	100X
Glucose	VWR	101174Y
HBSS	Sigma	H4641	10X
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
B-27 supplement	Life Technologies	17504-044	50X
Antibiotic-Antimycotic solution	Cellgro	30004CI	100X
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080
Vannas Scissors	World Precision Instruments	500086
Iris Scissors	World Precision Instruments	500216
Iris Forceps	World Precision Instruments	15914
Dumont #7 Forceps	World Precision Instruments	14097
Dumont #5 Forceps	World Precision Instruments	14095
ProLong Gold	Life Technologies	P36930
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Cover glass	VWR	631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin	Life Technologies	A12379
Normal horse serum	Life Technologies	26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2	abcam	Ab92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG	Life Technologies	A11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342	Life Technologies	R37605
NIS-Elements software package	Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope	Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene nylon membrane filter	Fishersci	151-4020