Количественное нитевидных актина (F-актин) Puncta на крысиной корковых нейронов

Резюме

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Аннотация

Нитчатых актина белок (F-актина) играет важную роль в spinogenesis, синаптической пластичности и синаптической стабильности. Изменения в дендритных F-актин богатых структур предложить изменения в синаптической целостность и связность. Здесь мы предлагаем подробный протокол для культивирования первичных крысиных корковых нейронов, фаллоидином окрашивание для F-актина Puncta и последующих методов количественного. Во-первых, фронтальная кора E18 крысиных эмбрионов диссоциируют на культуре низкой плотности клеток, затем нейроны, выращенные в пробирке в течение по крайней мере 12-14 дней. После экспериментального лечения, кортикальные нейроны окрашивали AlexaFluor 488 фаллоидином (маркировать дендритных F-актина Puncta) и ассоциированный с микротрубочками белок 2 (map2; для проверки нервных клеток и дендритных целостности). Наконец, специализированное программное обеспечение используется для анализа и количественной оценки случайно выбранных нейронов дендриты. F-актин богатых структур идентифицируются на дендритных ветвей второго порядка (диапазон длины 25-75 &# 181; м) при непрерывном map2 иммунофлюоресценции. Протокол, представленные здесь будет полезным методом для исследования изменений в дендритных синапсов структур последующих экспериментальных процедур.

Введение

Основная цель данного исследования заключается в разработке надежного метода измерения (оценки) синаптической целостности нейронов дендритных сети. Здесь мы опишем количественный анализ F-актина Puncta в первичной крыса культивируемых нейронов, используя комбинацию фаллоидином окрашивания и иммуноцитохимическое (МУС) обнаружения дендритов с последующим анализом с использованием специализированного программного обеспечения (NIS-Elements).

Меченые phallotoxins имеют схожую аффинность к больших и малых нитей (F-актин), но не связываются с мономерной шаровое актина (Г-актина), в отличие от некоторых актина антителами ^1. Неспецифическое связывание из фаллоидином незначительна, тем самым обеспечивая минимальный фон во визуализации клетки. Фаллоидином намного меньше, чем антитела, которые обычно используемых для обозначения клеточных белков для флуоресцентной микроскопии, который делает возможным более интенсивное маркировки F-актина фаллоидином. Таким образом, детальные изображения F-актина локализации в нейронах может бытьполучены при использовании меченого фаллоидином.

Фаллоидином (F-актин) окрашивание нейронов дендриты генерирует дискретные "горячие точки" или ярко "Puncta", которые представляют собой различные дендритных структур, в том числе зрелых шипов, без колючих синапсов ^{2 и} незрелых шипами. Незрелые шипы включают тонкие филоподий и некоторые формы патч морфологии, и может представлять собой начало spinogenesis ^3. Незрелые шипы и без колючих пластыри хватает PSD95 ^4. Изменения в производстве F-актина приводит к последующим изменениям не только в шипов, но и дополнительных дендритных структур, в результате чего фаллоидином важным инструментом для исследования synaptodendritic целостность ^5-7. В общем, количество фаллоидином-положительной (F-актин) Puncta отражать баланс между активными синапсов (возбуждающих и тормозных), динамику актина и стабильности синапсов ^8.

Хотя важно, чтобы изучить специфические Тypes синапсов (т.е. возбуждающие шипов), когда мишень для лечения неизвестна надо сначала оценить общую целостность различных дендритных структур. Так как F-актин является основным компонентом дендритных шипиков и других структур, в том числе тормозных синапсов, различным числом F-актина Puncta может указывать на synaptopathy. Это synaptopathy затем может быть исследован в дальнейшем для более конкретных изменений. Наш метод количественное для обнаружения нескольких синаптические типы / структуры дает общую оценку дендритных синаптических изменений (увеличений и уменьшений) следующих различных экспериментальных методов лечения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все протоколы животных были рассмотрены и одобрены уходу и использованию комитета животных в Университете Южной Каролины (количество обеспечение: A3049-01) по.

1. Низкая плотность нервные эмбриональные Культура

1. Подготовка к первичной коркового нейрона культуры
   1. Решения:
      1. Подготовьте поли-L-лизина исходного раствора растворением 5 мг поли-L-лизин в 10 мл боратного буфера.
      2. Подготовьте рабочий раствор путем разбавления 1 мл поли-L-лизин складе в 49 мл боратного буфера.
      3. Подготовьте боратный буфер, рН 8,4, начиная с 395 мл _{дН 2} O, а затем добавить все ингредиенты (1,24 г борной кислоты + 1,9 г буры). Регулировка рН до 8,4 с помощью 1 М NaOH. Отрегулируйте до 400 мл и фильтруют с 0,2 мкм нейлоновый мембранный фильтр под капотом.
      4. Приготовьте раствор HBSS, рН 7,2, начиная с 445 мл _{дН 2} O и добавляя все остальные ингредиенты (50 мл 10X HBSS Стоковые + 1,2 г HEPES). Регулировка рН до 7,2 с помощью 1 N HCl, BRIнг до 500 мл и фильтруют с 0,2 мкм фильтр из нейлона мембраны под капотом.
      5. Подготовьте осажденный среду: DMEM / F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Фильтр с 0,2 мкм фильтр нейлоновый мембранный под капотом.
      6. Подготовить всю среду для роста: До 50 мл среды Neurobasal, добавить добавки (500 мкл GlutaMAX (100X) + 500 мкл Глюкоза + 1 мл B-27 (50X) + 500 мкл антибиотикам противогрибкового раствора (100х) + 100 мкл 7,5% бикарбонат натрия. фильтр с 0,2 мкм фильтр нейлоновый мембранный под капотом.
   2. За два дня до культуры:
      1. Coat двенадцать 35 мм со стеклянным дном блюда с 2 мл рабочего раствора поли-L-лизин и держать под капотом O / N.
   3. За один день до культуры:
      1. Пустой покрывающий агент из блюд и промыть DDH _{2 O.} Разрешить блюда высохнуть в течение часа под капотом.
      2. Подготовьте покрытие среды (DMEM / F12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (10% от общего раствора). Внесите 2 мл среды вкаждое блюдо, и инкубировать O / N при 37 ^{° С,} 5% _{СО 2.}
         Примечание: Важно, чтобы избежать пластиковые чашки для культивирования при культивировании. Использование стеклянным дном посуды (для инвертированных микроскопов) или покровные стекла (для вертикальных микроскопов) дает четкие и ясные изображения. По сравнению с пластиковым дном блюдо, со стеклянным дном блюдо избегает нежелательных оттенков или бликов во флуоресцентной микроскопии.
2. Протокол Клеточная культура:
   1. Положите в холодильнике HBSS буфера (100-150 мл), 100 мм чашках Петри, пинцет, ножницы, 50 мл трубки и 15 мл пробирки под УФ-светом в капот.
   2. Эвтаназии беременных крыс с летальным ингаляции 5% севофлурана под капотом пределами комнатной культуре.
   3. Стерилизовать 70% этанола, палатки коже нижней части живота с помощью щипцов во время резки из хвоста в середине брюшной cavity.Open матка с помощью ножниц, чтобы выставить через плаценту.
   4. Удалить 8-10 E18 плодов. Пласе 8-10 плодов в чашки Петри, содержащие раствор HBSS.
   5. Держите затылок плода щипцами, а затем использовать ножницы, чтобы отрезать голову от тела. Поместите его в другом Петри, наполненной 5-7 мл HBSS. Передача блюдо, чтобы капот.
   6. Заполните два дополнительных 100 мм чашки Петри с холодной HBSS.
   7. Пил сторону черепа, и совок мозг в новой чашки Петри, наполненной HBSS.
   8. Используйте острые изогнутые щипцы, отдельный мозжечок и ствол мозга от мозга, а затем перенести мозг в новом Петри с холодной HBSS в нем.
   9. Используйте пинцет, чтобы обеспечить, отделить полушария с изогнутыми щипцами. Удалить мозговых оболочек; изолировать лобной коры и кусочки передачи в отмеченных 15 мл центрифужные пробирки.
   10. Заполните 15 мл пробирку со свежим 2 мл HBSS и добавить 20 мкл трипсин ЭДТА (10x концентрированную смесь с 0,5% трипсина и 5,3 мМ ЭДТА). Каждому 15 мл пробирку.
   11. Инкубируйте 10-15 мин при комнатной температуре. Аккуратно водоворот трубку каждые несколько минут, не позволяют исчерпывающим.
   12. Мтер 10-15 мин, использование стеклянной пипетки, чтобы удалить старую HBSS и дважды промыть новой HBSS.
   13. Погрузитесь в ингибитор трипсина (1 мг мл, 2 мг ингибитора / Трипсин в 2 мл HBSS), хорошо перемешать и оставьте на 5 мин. Промыть дважды свежей HBSS.
   14. Используя стеклянную пипетку с резиновой грушей, растирают штук мозга 10-15 раз очень медленно, чтобы избежать bubbles.Triturate снова с помощью калиброванного пипетку и стерильный наконечник с уменьшенным диаметром наконечника очень медленно до гомогенного состояния.
   15. Передача диссоциируют клеток при требуемой плотности в заранее подготовленные, покрытые культуральные чашки (50 клеток / мм2). Выдержите O / N при 37 ^{° С,} 5% СО2.
   16. Через 24 часа заменить DMEM / F12, с свежеприготовленный бессывороточной среде Neurobasal полная роста.
   17. Поддержание клеток во все времена в 5% CO _2/95% воздуха в помещении увлажненном инкубаторе в течение по крайней мере 12-14 дней до эксперимента. Дополнение клетки каждые 5-6 дней свежей средой Neurobasal замены примерно 50% старой среде.

2. Люминесцентные Маркировка и Иммуноцитохимическая

Примечание: иммунофлуоресцентного маркировка первичных культурах корковых клеток проводили в стеклянным дном 35 мм чашках для культивирования клеток с рабочим объемом 1 мл.

1. Промыть со стеклянным дном блюдо дважды фосфатно-солевом буфере, рН 7,4 (PBS).
2. Устранить клетки с 4% параформальдегидом в течение 15 минут при комнатной температуре.
3. Промыть клетки дважды PBS и проницаемыми с 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 5 мин.
4. Treat клетки в течение 20 мин при комнатной температуре с F-актина конкретного пятна, AlexaFluor 488 фаллоидином (1:40, 25 мкл фаллоидином в 1 мл PBS).
5. Промыть клетки дважды PBS и блокируют с 10% нормальной козьей сывороткой при комнатной температуре в течение 1-2 ч.
6. Развести куриные поликлональных анти-map2 антитела (1: 2500) в PBS с 2% нормальной козьей сывороткой и инкубировать O / N при 4 ^{о С.}
7. После инкубации, промыть в PBS в два раза.
8. Развести вторичными антителами (Alexa Rред 594-конъюгированного козьего антитела против IgG куриное (1: 500) с 2% нормальной козьей сывороткой и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре.
9. Промыть PBS и добавить 10 мкл / блюдо Hoescht красителя.
10. Выдержите 3 мин при комнатной температуре и промывают PBS в два раза.
    Примечание: меченые клетки теперь готов к шагу 3 (F-актин счетной Puncta).
11. Сохранение клеточного образца с 100 мкл реагента antifade как coverslipping агента и держать при температуре 4 ^{° С} в темноте в течение длительного хранения.
    Примечание: фаллоидином относительно стабилен в PBS при 4 ° С в темноте в течение до 1 недели и флуоресценции может быть сохранена с antifade coverslipping реагентов. Тем не менее, оптимальные изображения получаются из 1-3 дней после окрашивания, так как фаллоидином может начать диффундировать с длительного хранения.

3. F-актин Puncta Подсчет

1. Включите флуоресцентным микроскопом и переключиться на 20 × цели. Открытое программное обеспечение микроскопа, а также создать программу на × 960 пикселей размером изображения 1280, и 0,1разрешение изображения / пиксель 7 мкм на 1 × зумом.
2. Получение изображений СО-меченых F-актина / map2 нейронов под зеленым (495 нм) / красный (613 нм) флуоресцентных каналов.
3. Выберите 5 Зеленый (F-актин) / Красный (map2) immunolabeled / синий (Hoescht) флуоресцентные изображения индивидуального нейрона с четко определенными дендритных беседки.
4. Определить F-актин богатых структур в дендритных сегменте второго порядка (диапазон длины 25-75 мкм) с непрерывным map2 иммунофлюоресценции.
5. Поворот выделенной области изображения в горизонтальном уровне. Копирование и вставка в виде нового изображения.
6. Вычтите фон изображений, используя последовательную корректировку для каждого блюда.
7. Подсчитайте ярко-зеленый F-актин Puncta и проследить длину выбранного дендритных сегменте вручную обученным независимых наблюдателей. Экспорт данных в файл электронной таблицы.
8. Рассчитайте плотность путем деления общей F-актина с надписью Puncta (N) на длину (L) из КАРТА 2 меченого дендриты. Экспресс данные как количество F-ACолова Puncta за 10 мкм дендритов
   Примечание: Puncta (размер ≤1.5 мкм) из F-актина флуоресценции с пиковой интенсивности, по крайней мере 50% выше средней интенсивности окрашивания в дендритной вала были включены в каждой выбранной дендритной сегмента.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В нынешних методов, мы впервые культуры крысы корковых нейронов при низкой плотности в 35 мм с прозрачным дном посуды, что позволяет выявить дендритов отдельных нейронов. На рисунке 1, дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображения показывают...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом протоколе, мы описываем культивирования крысы корковых нейронов при низкой плотности в 35 мм с прозрачным дном посуды, которая позволяет нам идентифицировать дендритов отдельных нейронов. Далее, мы используем фаллоидином и map2 окрашивание для выявления дендритные изменения. Зат?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium	Life Technologies	10565-018
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054
Poly-L-Lysine	Sigma	P9155
Boric acid	Sigma	B0252
Borax	Sigma	B9876
GlutaMax	Life Technologies	35050-061	100X
Glucose	VWR	101174Y
HBSS	Sigma	H4641	10X
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
B-27 supplement	Life Technologies	17504-044	50X
Antibiotic-Antimycotic solution	Cellgro	30004CI	100X
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080
Vannas Scissors	World Precision Instruments	500086
Iris Scissors	World Precision Instruments	500216
Iris Forceps	World Precision Instruments	15914
Dumont #7 Forceps	World Precision Instruments	14097
Dumont #5 Forceps	World Precision Instruments	14095
ProLong Gold	Life Technologies	P36930
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Cover glass	VWR	631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin	Life Technologies	A12379
Normal horse serum	Life Technologies	26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2	abcam	Ab92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG	Life Technologies	A11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342	Life Technologies	R37605
NIS-Elements software package	Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope	Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene nylon membrane filter	Fishersci	151-4020