Quantifizierung von filamentösen Aktin (F-Aktin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Zusammenfassung

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Zusammenfassung

Filamentösen Aktin-Protein (F-Actin) spielt eine wichtige Rolle in spinogenesis, synaptischer Plastizität und synaptischen Stabilität. Änderungen in dendritischen F-Actin-reichen Strukturen deuten darauf hin, Veränderungen der synaptischen Integrität und Konnektivität. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Kultivierung von primären Ratten-kortikalen Neuronen, Phalloidin-Färbung für F-Actin puncta und anschließende Quantifizierung Techniken. Zuerst werden die frontalen Kortex von E18-Rattenembryos dissoziiert in Low-Density-Zellkultur, dann die Nervenzellen in vitro gezüchtet mindestens 12-14 Tage. Folgenden experimentellen Behandlung werden die kortikalen Neuronen gefärbt mit AlexaFluor 488 Phalloidin (die dendritische F-Aktin puncta zu markieren) und Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2; die neuronalen Zellen und dendritischen Integrität zu validieren). Schließlich wird spezielle Software zu analysieren und zu quantifizieren zufällig ausgewählten neuronalen Dendriten verwendet. F-Actin reichen Strukturen sind auf zweiter Ordnung dendritischen Verzweigungen (Längenbereich 25-75 identifiziert &# 181; m) mit kontinuierlicher MAP2 Immunfluoreszenz. Das Protokoll hier vorgestellt wird eine nützliche Methode zur Untersuchung von Veränderungen in dendritische Synapse Strukturen im Anschluss an experimentellen Behandlungen.

Einleitung

Das primäre Ziel dieser Studie ist es, eine zuverlässige Methode zur Messung (Schätzung) der synaptischen Integrität der neuronalen dendritischen Netzwerk zu entwickeln. Hier beschreiben wir die Quantifizierung von F-Actin puncta in primären Ratten kultivierten Neuronen eine Kombination von Phalloidin-Färbung verwendet und immunzytochemische (ICC) Erkennung von Dendriten mit anschließender Analyse mit speziellen (NIS-Elements) Software.

Markierten Phallotoxine haben ähnliche Affinität für sowohl große als auch kleine Filamente (F-Actin), aber binden nicht an monomeren globulären Actin (G-Actin), im Gegensatz zu einigen Aktin Antikörper ^1. Die unspezifische Bindung von Phalloidin vernachlässigbar ist, so minimal Hintergrund während der zellulären Bildgebung bietet. Phalloidin ist viel kleiner als Antikörper, die normalerweise verwendet werden würde zelluläre Proteine ​​für Fluoreszenzmikroskopie zu kennzeichnen, die durch Phalloidin für viel intensiver Markierung von F-Aktin ermöglicht. So detaillierte Bilder von F-Actin-Lokalisierung in Neuronen seindurch die Verwendung von markiertem Phalloidin erhalten.

Phalloidin (F-Actin) Färbung der neuronalen Dendriten erzeugt diskrete "Hot Spots" oder hell "puncta", die eine Vielzahl von dendritischen Strukturen darstellen, einschließlich reifen Stacheln, nicht stachelig Synapsen ^{2 und} unreif Stacheln. Unreife Stacheln sind dünn Filopodien und einige Formen von Patch-Morphologie und kann die Einleitung spinogenesis ³ darstellen. Unreife Stacheln und nicht stachelig Patches fehlen PSD95 ^4. Veränderungen in der Produktion von F-Aktin führen zu Änderungen in nachfolgenden nicht nur Stacheln sondern auch zusätzliche dendritischen Strukturen, wodurch Phalloidin ein wichtiges Werkzeug für synaptodendritic Integrität ^5-7 untersucht. In der Regel Zahlen von Phalloidin-positive (F-Actin) puncta reflektieren ein Gleichgewicht unter den aktiven Synapsen (erregenden und hemmenden), Aktindynamik und Synapse Stabilität ^8.

Zwar ist es wichtig, spezifische t zu studierenypen von Synapsen (dh exzitatorischen Stacheln), wenn das Ziel der Behandlung ist es notwendig, nicht bekannt ist, zuerst die allgemeine Integrität einer Vielzahl von dendritischen Strukturen schätzen. Da F-Aktin ist eine Hauptkomponente von dendritischen Dornen und anderen Strukturen, einschließlich hemmende Synapsen, einer veränderten Anzahl von F-Aktin puncta eine Synaptopathie hinweisen. Diese Synaptopathie kann dann weiter für mehr spezifische Veränderungen untersucht werden. Unsere Quantifizierungsmethode mehrere synaptischen Arten / Strukturen zum Nachweis ergibt eine Gesamtschätzung von dendritischen synaptischen Veränderungen (Zunahmen und Abnahmen) nach verschiedenen experimentellen Behandlungen.

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Protokoll

Alle Tierprotokolle wurden überprüft und durch die Animal Care und Use Committee an der University of South Carolina (Sicherung Nummer: A3049-01) zugelassen.

1. Low-Density-embryonale neuronale Kultur

1. Vorbereitung für die primäre kortikale Neuronen Kultur
   1. Lösungen:
      1. Bereiten Poly-L-Lysin-Stammlösung durch Auflösen von 5 mg Poly-L-Lysin in 10 ml Boratpuffer.
      2. Bereiten Arbeitslösung durch Verdünnen von 1 ml Poly-L-Lysin-Lager auf 49 ml Boratpuffer.
      3. Bereiten Boratpuffer, pH 8,4, indem sie mit 395 ml dH _{2 O} beginnt und dann Zugabe aller Bestandteile (1,24 g Borsäure + 1,9 g Borax). Der pH-Wert auf 8,4 bis 1 M NaOH. Passen zu 400 ml und Filter mit 0,2 um Nylonmembranfilter unter der Motorhaube.
      4. Bereiten HBSS-Lösung, pH 7,2, indem sie mit 445 ml _{dH 2 O} beginnt und das Hinzufügen alle anderen Zutaten (50 ml 10X HBSS Auf + 1,2 g HEPES). Der pH-Wert auf 7,2 mit 1 N HCl, bring bis 500 ml und Filter mit 0,2 um Nylonmembranfilter unter der Motorhaube.
      5. Bereiten Plattenmedium: DMEM / F12 mit 10% fötalem Rinderserum. Filter mit 0,2 um Nylonmembranfilter unter der Motorhaube.
      6. Bereiten komplette Wachstumsmedium: Zu 50 ml Neurobasalmedium, fügen Sie die Ergänzungsmittel (500 ul GlutaMAX (100X) + 500 ul Glucose + 1 ml B-27 (50x) + 500 ul Antibiotika-Antimykotika-Lösung (100X) + 100 ul 7,5% Natriumbicarbonat. Filter mit 0,2 um Nylonmembranfilter unter der Motorhaube.
   2. Zwei Tage vor Kultur:
      1. Mantel zwölf 35 mm Glasbodenschalen mit 2 ml Poly-L-Lysin-Arbeitslösung, und halten unter der Haube O / N.
   3. Einen Tag vor Kultur:
      1. Leere Beschichtungsmittel aus den Schalen und spülen mit ddH ₂ O. Lassen Gerichte für eine Stunde unter der Motorhaube zu trocknen.
      2. Bereiten Plattenmedium (DMEM / F12 mit 10% fötalem Rinderserum (10% der Gesamtlösung). Pipette 2 ml Medium injedes Gericht, und O / N ^{bei 37 °} C, 5% _{CO 2} inkubiert.
         Hinweis: Es ist wichtig, Kunststoff-Kulturschalen zu vermeiden, wenn die Kultivierung. Die Verwendung von Glasbodenschalen (für inverse Mikroskope) oder Deckgläser (für aufrechte Mikroskope) liefert scharfe und klare Bilder. Im Vergleich zu einem Kunststoff-Bodenschale, die Glasbodenschale verhindert unerwünschte Farbtöne oder Blendung während der Fluoreszenzmikroskopie.
2. Zellkultur-Protokoll:
   1. Put gekühlt HBSS Puffer (100-150 ml), 100 mm-Petrischalen, Pinzetten, Scheren, 50 ml-Röhrchen und 15-ml-Röhrchen unter UV-Licht in der Haube.
   2. Euthanize trächtigen Ratten mit tödlichen Einatmen von 5% Sevofluran unter der Haube außerhalb von Kulturraum.
   3. Sterilisieren mit 70% EtOH, Zelt der Haut der Unterleib einer Pinzette, während aus dem Schwanz Zerschneiden in der Mitte der Bauch cavity.Open die Gebärmutter einer Schere, die Plazenta zu belichten.
   4. Entfernen 8-10 E18 Föten. Place 8-10 Föten in Petrischalen mit HBSS-Lösung.
   5. Halten Sie die Rückseite des Kopfes des Fötus mit einer Pinzette, dann mit einer Schere den Kopf vom Körper zu trennen. Legen Sie sie in eine andere Petrischale gefüllt mit 7.5 ml HBSS. Übertragen Gericht Kapuze.
   6. Füllen Sie zwei weitere 100-mm-Petrischale mit kaltem HBSS.
   7. Peel beiseite Schädel, und Schaufel Gehirn in eine neue Petrischale mit HBSS gefüllt.
   8. Scharfe gebogenen Pinzette, separater Kleinhirn und Hirnstamm aus Gehirn, dann übertragen Gehirn auf eine neue Petrischale mit kaltem HBSS darin.
   9. Verwenden einer Pinzette zu sichern, trennen Sie die Halbkugeln mit einer gebogenen Pinzette. Entfernen Hirnhaut; isolieren frontalen Kortex und Transfer Stücke in markierte 15 ml Zentrifugenröhrchen.
   10. Füllen Sie die 15-ml-Röhrchen mit frischem 2 ml HBSS und fügen Sie 20 ul Trypsin-EDTA (10x konzentrierte Mischung mit 0,5% Trypsin und 5,3 mM EDTA.) Zu jedem 15-ml-Tube.
   11. Inkubieren 10-15 Minuten bei Raumtemperatur. Sanft Rohr alle paar Minuten wirbeln, erlauben nicht nieder.
   12. After 10-15 min, Pipette Verwendung Glas alt HBSS und spülen Sie zweimal mit neuen HBSS zu entfernen.
   13. Tauchen Sie ein in Trypsin-Inhibitor (1 mg / ml, 2 mg Trypsin-Hemmstoff in 2 ml HBSS), gut mischen und lassen Sie es 5 Minuten sitzen. Zweimal waschen mit frischem HBSS.
   14. Mit Glaspipette mit Gummiball, verreiben Gehirn Stücke 10-15 mal sehr langsam, so dass bubbles.Triturate wieder mit einem kalibrierten Pipette und eine sterile Spitze mit einer reduzierten Spitzendurchmesser sehr langsam, bis sie homogen zu vermeiden.
   15. Transfer dissoziierten Zellen auf gewünschte Dichte vorzunehmen vorbereitet beschichteten Kulturschalen (50 Zellen / mm 2). O / N ^{bei 37 °} C, 5% CO2 inkubiert.
   16. Nach 24 Stunden DMEM / F12-Medium mit frisch zubereiteten kompletten Wachstum Serum-freien Neurobasalmedium ersetzen.
   17. Pflegen der Zellen zu allen Zeiten in einem _{5% CO 2/95%} Raumluft befeuchteten Inkubator für mindestens 12-14 Tage vor dem Experiment. Ergänzen Sie die Zellen alle 5-6 Tage mit frischem Neurobasalmedium etwa 50% der alten Medium zu ersetzen.

2. Fluoreszenzmarkierung und Immunzytochemie

Hinweis: Die Immunfluoreszenz-Markierung von primären kortikalen Zellkulturen wurden in Glasboden 35 mm Zellkulturschalen mit einem Arbeitsvolumen von 1 ml durchgeführt.

1. Waschen Sie die Glasbodenschale zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 (PBS).
2. Fix Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 15 min bei RT.
3. Wasche die Zellen zweimal mit PBS und permeabilisieren mit 0,1% Triton X-100 in PBS für 5 min.
4. Behandlung von Zellen für 20 min bei RT mit einem F-Actin-spezifischen Farbstoffs, AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40 25 ul Phalloidin in 1 ml PBS).
5. Spülen Sie die Zellen zweimal mit PBS und Blockieren mit 10% normalem Ziegenserum bei RT für 1-2 Std.
6. Verdünnen Sie das Huhn polyklonalen anti-MAP2 Antikörper (1: 2500) in PBS mit 2% normalem Ziegenserum und Inkubation O / N bei 4 ^o C
7. Nach der Inkubation spülen zweimal in PBS.
8. Verdünnen Sie die Sekundär-Antikörper (Alexa Red 594-konjugiertem Ziege-anti-Huhn-IgG (1: 500) mit 2% normalem Ziegenserum und 2 h bei RT inkubiert.
9. Spülen mit PBS und fügen Sie 10 ul / Schale von Hoechst-Farbstoff.
10. Inkubieren 3 min bei RT und waschen mit PBS zweimal.
    Hinweis: Die jetzt markierten Zellen bereit für Schritt 3 (F-Actin puncta Zählung).
11. Preserve Zellprobe mit 100 ul Antifade-Reagenz als Eindeckmittel und halten bei 4 ^{° C} im Dunkeln für langfristige Lagerung.
    Anmerkung: Phalloidin ist relativ stabil in PBS bei +4 ° C im Dunkeln für bis zu 1 Woche und Fluoreszenz kann mit Antifade Eindecken Reagenzien konserviert werden. Allerdings sind optimale Bilder von 1-3 Tagen nach der Färbung erhalten seit Phalloidin kann mit längerer Lagerung zu diffundieren beginnen.

3. F-Aktin Puncta Zählen

1. Schalten Sie Fluoreszenzmikroskop und wechseln Sie in 20 × Ziel. Offene Mikroskop-Software und Programm bei 1280 × 960 Pixel Bildgröße einrichten und 0,17 um / Pixel Bildauflösung bei 1-facher Zoom.
2. Erwerben Sie Bilder von Co-markierten F-Actin / MAP2 Neuronen unter Grün (495 nm) / Rot (613 nm) Fluoreszenz-Kanäle.
3. Wählen Sie 5 Green (F-Actin) / Rot (MAP2) immun / Blue (Hoechst) Fluoreszenzbilder der einzelnen Neuron mit klar definierten dendritischen Dornen.
4. Identifizieren Sie die F-Actin reichen Strukturen in zweiter Ordnung dendritischen Segment (Längenbereich von 25 bis 75 & mgr; m) mit kontinuierlicher MAP2 Immunfluoreszenz.
5. Drehen Sie den ausgewählten Bereich der Bilder auf einer horizontalen Ebene. Kopieren und Einfügen als neues Bild.
6. Ziehen Sie den Hintergrund der Bilder, eine konsistente Einstellungen für jedes Gericht verwenden.
7. Zählen Sie die hellgrüne F-Actin puncta und Spuren die Länge der ausgewählten dendritischen Segment manuell durch geschultes unabhängige Beobachter. Exportieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsdatei.
8. Berechnen der Dichte durch Dividieren Gesamt F-Aktin gekennzeichnet puncta (N) durch die Länge (L) der MAP2 Dendriten bezeichnet. Express-Daten als Anzahl von F-acZinn puncta pro 10 & mgr; m von Dendriten
   Anmerkung: Puncta (Größe ≤1.5 um) von F-Actin-Fluoreszenz mit einer Spitzenintensität von mindestens 50% über dem durchschnittlichen Intensität der Färbung in den dendritischen Welle wurden in jedem ausgewählten dendritischen Segment enthalten.

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Ergebnisse

In den vorliegenden Verfahren haben wir zunächst Kultur Ratte kortikalen Neuronen bei geringer Dichte in 35 mm Glasboden-Gerichte, die uns die Dendriten der einzelnen Neuronen zu identifizieren. In 1 zeigt das Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Bilder, um die morphologischen Veränderungen an den Tagen fötalen Ratte kortikalen Neuronen Entwicklungs 4, 6, 10, 14, 21 und 27 in vitro. Beachten Sie, dass die Länge und Anzahl der Dendriten erhöhen mit der Re...

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Diskussion

In diesem Protokoll beschreiben Züchten wir Ratte kortikalen Neuronen bei geringer Dichte in 35 mm Glasboden-Gerichte, die uns Dendriten von einzelnen Neuronen zu identifizieren. Als nächstes benutzen wir Phalloidin und MAP2 Färbung zu dendritischen Änderungen erkennen. Dann haben wir spezialisierte Software-Änderungen in F-Actin puncta zu quantifizieren.

Um Änderungen in F-Aktin puncta bestimmen, muss das gesamte neuronale Netzwerk eines einzelnen Neurons deutlich sichtbar, ermöglich...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium	Life Technologies	10565-018
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054
Poly-L-Lysine	Sigma	P9155
Boric acid	Sigma	B0252
Borax	Sigma	B9876
GlutaMax	Life Technologies	35050-061	100X
Glucose	VWR	101174Y
HBSS	Sigma	H4641	10X
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
B-27 supplement	Life Technologies	17504-044	50X
Antibiotic-Antimycotic solution	Cellgro	30004CI	100X
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080
Vannas Scissors	World Precision Instruments	500086
Iris Scissors	World Precision Instruments	500216
Iris Forceps	World Precision Instruments	15914
Dumont #7 Forceps	World Precision Instruments	14097
Dumont #5 Forceps	World Precision Instruments	14095
ProLong Gold	Life Technologies	P36930
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Cover glass	VWR	631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin	Life Technologies	A12379
Normal horse serum	Life Technologies	26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2	abcam	Ab92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG	Life Technologies	A11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342	Life Technologies	R37605
NIS-Elements software package	Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope	Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene nylon membrane filter	Fishersci	151-4020