Rat Kortikal Nöronlar Filamentli Aktin (F-aktin) puncta Niceleme

Özet

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

Özet

(F-aktin) İpliksi aktin proteini spinogenesis, sinaptik plastisite ve sinaptik stabilitesinde önemli bir rol oynar. dendritik F-aktin zengin yapılardaki değişiklikler sinaptik bütünlük ve bağlantı değişiklikleri göstermektedir. Burada F-aktin puncta ve sonraki ölçümü teknikleri için birincil sıçan kortikal nöronların, Phalloidin boyama kültürü için ayrıntılı bir protokol sağlar. İlk olarak, E18 fare embriyonlarının frontal korteks, daha sonra, düşük yoğunluklu, hücre kültürü içine en az 12-14 gün boyunca in vitro yetiştirilen nöronlar ayrışmış. Deneysel tedaviden sonra, kortikal nöronlar AlexaFluor 488 falloidinle boyanır ve mikrotübül-ilişkili protein 2 (dendritik F-aktin puncta etiket) (MAP2; nöronal hücreleri ve dendritik bütünlüğünü doğrulamak için). Son olarak, özel yazılım analiz ve rastgele seçilen nöronal dendrite ölçmek için kullanılır. F-aktin zengin yapılar ikinci mertebe dendritik dalları (uzunluk aralığı 25-75 ve tespit edilir# 181; sürekli map2 immünofloresan ile m). Burada sunulan protokol deneysel tedaviler sonrasında dendritik sinaps yapılarında değişiklikler araştırmak için faydalı bir yöntem olacaktır.

Giriş

Bu çalışmanın temel amacı, nöronal dendritik ağın sinaptik bütünlüğünün ölçümü (tahmini) güvenilir bir yöntem geliştirmektir. Burada Phalloidin boyama ve uzman (NIS-Elemanları) yazılımı kullanılarak takip eden analizi ile dendritler immunositokimyasal (ICC) taramadan oluşan bir kombinasyon kullanılarak primer fare kültürlenmiş nöronlar F-aktin puncta ölçülmesini açıklar.

Etiketli phallotoxins büyük ve küçük ipliklerin (F-aktin) için benzer bir yakınlığa sahip fakat bazı aktin antikor ¹ farklı olarak, monomerik küresel aktin (G-aktin) bağlanmaz. Phalloidin bağlayıcı Nonspesifik böylece hücresel görüntüleme sırasında en az bir arka plan sağlayarak, ihmal edilebilir düzeydedir. Phalloidin genellikle Phalloidin F-aktin çok daha yoğun etiketleme sağlar flüoresan mikroskopi için hücresel proteinleri etiketlemek için kullanılacak antikorlar çok daha küçüktür. Böylece, nöronlarda F-aktin lokalizasyonu detaylı görüntüler olabilirişaretlenmiş falloidinle kullanılması yoluyla elde edilmiştir.

Phalloidin nöronal dendritler (F-aktin) boyama olgun dikenleri olmayan dikenli sinaps ² ve olgunlaşmamış dikenler de dahil olmak üzere dendritik yapıların, çeşitli temsil eden ayrık "sıcak noktalar" ya da parlak "puncta" oluşturur. Olgunlaşmamış dikenleri ince filopodia ve yama morfolojisi bazı formları içerir ve spinogenesis ³ başlatılmasını temsil edebilir. Olgunlaşmamış dikenleri olan ve olmayan dikenli yamalar PSD95 ⁴ yoksundur. Sadece dikenler sonraki değişiklikler değil, aynı zamanda ek dendritik yapılara F-aktin kurşun üretiminde değişiklikler, böylece synaptodendritic bütünlüğünü ^5-7 araştırmak için önemli bir araç faloidin adrestir. Genel olarak, Phalloidin-pozitif (F-aktin) puncta sayısı bir aktif sinapsların arasında bir denge (eksitatör ve inhibitör), aktin dinamiklerini ve sinaps istikrar ⁸ yansıtmaktadır.

belirli t incelemek önemli olmasına rağmenBir tedavinin hedefi bilinmediğinde sinaps (yani, uyarıcı dikenleri) bir Dosya türleri, ilk dendritik yapıların çeşitli genel bütünlüğünü tahmin etmek için gereklidir. F-aktin önleyici sinaps bir synaptopathy gösterebilir F-aktin puncta bir değiştirilmiş sayısı dahil olmak üzere dendritik dikenler ve diğer yapıların, önemli bir bileşeni olduğu için. Bu synaptopathy daha sonra belirli değişiklikler için daha fazla araştırılması olabilir. Birden fazla sinaptik türleri / yapıların tespiti için bizim miktar yöntemi çeşitli deneysel tedaviler aşağıdaki dendritik sinaptik değişiklikler (artış ve azalışlar) genel bir tahmin verir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan protokolleri gözden geçirilmiş ve Güney Carolina Üniversitesi'nde Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (güvence numarası: A3049-01) tarafından onaylanmıştır.

1. Düşük yoğunluklu Embriyonik Nöronal Kültür

1. Primer kortikal nöron kültürü için hazırlık
   1. Çözümler:
      1. 10 ml borat tamponu Poli-L-Lizin 5 mg çözülmesiyle Poli-L-Lisin stok çözelti hazırlayın.
      2. 49 mi borat tamponu içinde 1 ml poli-L-lizin stok seyreltilmesi ile çalışma çözeltisi hazırlayın.
      3. 395 mi _DH 2 O ile başlayan ve daha sonra tüm maddeler (Boraks 1.24 g borik asit + 1.9 g) eklenerek borat tamponu, pH 8.4 hazırlanır. 1 M NaOH ile 8.4 pH ayarlayın. 400 ml ayarlayın ve kaputun altında 0.2 mikron naylon membran filtre ile filtre.
      4. 445 ml _dH 2 O ile başlayan ve diğer tüm maddeler ekleyerek HBSS çözüm, pH 7.2 hazırlayın (50 ml 10X HBSS Stok + 1.2 g HEPES). 1 N HCI, bri tarafından pH'ı 7.2'ye ayarlayınng 500 ml ve kaputun altında 0.2 mikron naylon membran filtre ile filtre.
      5. % 10 fetal bovin serumu içeren DMEM / F12: Kaplama orta hazırlayın. kaputun altında 0.2 mikron naylon membran filtre ile filtre.
      6. tam büyüme ortamı hazırlayın: 50 ml Neurobasal orta için, takviyeleri ekleyin (500 ul GlutaMAX (100X) + 500 ul Glukoz antibiyotik antimikotik çözüm (100X + 1 ml B-27 (50X) + 500 ul) + 100 ul% 7.5 sodyum Bikarbonat. kaputun altında 0.2 mikron naylon membran filtre ile filtre.
   2. İki gün kültür öncesi:
      1. 2 Poli-L-Lizin çalışma solüsyonu ve kaput O / N altında tutmak ile kaplayın oniki 35 mm cam alt yemekler.
   3. kültür bir gün önce:
      1. _GKD 2 O. ile boş kaplama yemekler ajan ve durulama Yemekler kaputun altında bir saat kurumaya bırakın.
      2. % 10 fetal sığır serumu (toplam çözeltinin% 10) ile kaplanmış ortamı (DMEM / F12 hazırlayın. Pipet 2 mi ortam içineher yemeğin ve 37 ^{o C,%} 5 _CO 2 O / N kuluçkaya yatmaktadır.
         Not: kültürlerken plastik kültür kaplarına önlemek için önemlidir. cam alt (ters Mikroskop) yemekleri ya da (dik mikroskoplar) cam lamelleri kullanılması keskin ve net görüntüler verir. Bir plastik alt tabak ile karşılaştırıldığında, cam alt çanak floresan mikroskopi sırasında istenmeyen tonları veya parlamayı önler.
2. Hücre kültürü protokolü:
   1. HBSS Buffer (100-150 ml), buzdolabında koymak 100 mm petri, forseps, makas, 50 ml tüpler ve kaputu UV ışık altında 15 ml tüpler.
   2. kültür odası dışında başlık altında% 5 sevofluran öldürücü inhalasyon ile gebe sıçan Euthanize.
   3. % 70 EtOH, çadır karın cavity.Open plasentayı maruz makas kullanarak rahim ortasında kuyruk yukarıya kesim sırasında forseps kullanarak alt karın derisi ile sterilize edin.
   4. 8-10 E18 fetus çıkarın. PlaHBSS çözeltisi ihtiva eden petri çanakları 8-10 fetus ce.
   5. forseps ile fetusun başının arkasını tutun, sonra vücuttan kafasını koparmaya makas kullanın. HBSS 5-7 ml ile dolu başka bir petri yerleştirin. kaput çanak aktarın.
   6. Soğuk HBSS ile iki ek 100 mm petri doldurun.
   7. Peel kenara kafatası ve HBSS ile dolu yeni bir petri içine beyin kepçe.
   8. sonra bunun soğuk HBSS ile yeni bir petri beyin transferi, beyinden gelen keskin kavisli bir forseps, ayrı beyincik ve beyin sapı kullanın.
   9. kavisli bir forseps ile hemisfer ayırmak, sabitlemek için cımbız kullanın. meninks çıkarın; İşaretli 15 ml santrifüj tüplerine frontal korteks ve transfer parçaları izole.
   10. Taze 2 mi HBSS ile 15 ml tüp doldurun ve her biri 15 ml'lik bir tüpe 20 ul tripsin EDTA (% 0.5 tripsin ve 5.3 mM EDTA. 10x konsantre edildi) ekleyin.
   11. Oda sıcaklığında 10-15 dakika kuluçkalayın. Yavaşça tüpü birkaç dakikada girdap, yerleşme izin vermez.
   12. After 10-15 dk, kullanım cam pipet eski HBSS kaldırmak ve yeni HBSS ile iki kez durulayın.
   13. (2 mi HBSS içinde 1 mg / ml, 2 mg tripsin inhibitörü) tripsin inhibitörü daldırın, iyice karıştırın ve 5 dakika bekletin. Taze HBSS ile iki kez yıkayın.
   14. Yine bir kalibre pipet ve çok yavaş homojen hale gelene kadar azaltılmış ucu çapı ile steril bir ucunu kullanarak bubbles.Triturate önleyecek şekilde çok yavaş çiğnemek beyin parçaları, lastik ampul 10-15 kez cam pipet kullanarak.
   15. Aktarım istenilen yoğunlukta hücreler çözülmüş kaplanmış kültür kaplarına (50 hücre / mm2) hazırlanmış ön. 37 ^{o C,%} 5 CO2 O / N inkübe edin.
   16. 24 saat sonra, taze tam büyüme serumsuz Neurobasal orta DMEM / F12 ortamı değiştirin.
   17. Deney için en az 12-14 gün% 5 CO _2/95% odada nemlendirilmiş kuluçka makinesi içinde her zaman hücreleri korumak. Taze Neurobasal orta yaşlı orta yaklaşık% 50 yerine her 5-6 gün hücreleri tamamlar.

2. Floresan Etiketleme ve İmmünositokimya

Not: Birincil kortikal hücre kültürleri immünofloresan markalama 1 ml'lik bir çalışma hacmine sahip cam alt 35 mm'lik bir hücre kültür tabaklarında gerçekleştirilmiştir.

1. fosfat tamponlu tuzlu su pH 7.4 (PBS) ile iki defa cam alt bulaşık yıkama.
2. Oda sıcaklığında 15 dakika süreyle% 4 paraformaldehid hücreleri saptamak.
3. PBS ile iki kez yıkanır hücreler, 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ile geçirgenliği.
4. F-aktine özel leke ile oda sıcaklığında 20 dakika için hücreleri tedavi, AlexaFluor 488 Phalloidin (1:40, 1 ml PBS içinde Phalloidin 25 ul).
5. PBS ile iki kez hücreleri durulanır ve 1-2 saat boyunca oda sıcaklığında% 10 normal keçi serumu ile bloke eder.
6. % 2 normal keçi serumu ile PBS içinde 4 ^O ° C'de O / N inkübe: Tavuk poliklonal anti-MAP2 antikoru (2.500 1) ile seyreltilir
7. inkübasyondan sonra, iki kez PBS ile durulayın.
8. ikincil antikor (Alexa R sulandırmakEd 594-konjuge keçi anti-tavşan IgG'si (1: 500)% 2 normal keçi serumu ve 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
9. PBS ile durulayın ve 10 ul / Hoescht boya çanak ekleyin.
10. Oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkalayın ve iki kez PBS ile yıkayın.
    Not: Adım 3 (F-aktin puncta sayma) için artık etiketli hücreler hazır.
11. Bir Lamel Kapatma ajan olarak antifade reaktif 100 ul ile hücre örneği korumak ve uzun süreli depolama için karanlıkta 4 ^{o C'de} tutun.
    Not: Phalloidin antifade Lamel reaktifleri ile korunabilir 1 hafta ve floresan kadar karanlıkta 4 ° C'de PBS içinde nispeten kararlıdır. Phalloidin uzatılmış depolama ile difüze başlayabilir Bununla birlikte, uygun resim boyama sonrası 1-3 gün elde edilir.

3. F-aktin puncta Sayma

1. floresan mikroskop açın ve 20 × amacı geçmek. Açık mikroskop yazılımı ve 1280 × 960 piksel görüntü boyutunda program kurmak, ve 0.11 × zum 7 mikron / piksel görüntü çözünürlüğü.
2. Kırmızı yeşil (495 nm) / (613 nm) floresan kanal altında eş etiketli F-aktin / map2 nöronların görüntüler elde.
3. 5 Yeşil (F-aktin) / Kırmızı (map2) immunolabeled / Mavi (Hoescht) açıkça tanımlanmış dendritik milleri ile bireysel nöronun floresan görüntüleri seçin.
4. Sürekli map2 immünofloresan ile ikinci dereceden dendritik segmentte (uzunluk aralığı 25-75 mikron) F-aktin zengin yapıları belirleyin.
5. yatay bir seviyeye görüntüleri seçili bölgeyi döndürün. yeni bir resim olarak Kopyala ve yapıştır.
6. Her yemeğin tutarlı ayarlamalar kullanarak, görüntülerin arka planını çıkarın.
7. Parlak yeşil F-aktin puncta saymak ve elle eğitimli bağımsız gözlemciler tarafından seçilen dendritik parçasının uzunluğunu iz. Bir tablo dosyasına veri verir.
8. Map2 dendrit etiketli uzunluğu (L) toplam F-aktin etiketli puncta (N) bölünmesi ile yoğunluğunu hesaplayınız. F-ac sayısı Express verilerinidendrit 10 mikron başına kalay puncta
   Not: puncta dendritik mili boyanma ortalama yoğunluğu en az 50% bir tepe şiddetine sahip F-aktin floresans (boyut ≤1.5 um), seçilen her bir dendritik bölümüne dahil edilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Mevcut yöntemlerle, biz ilk kültür sıçan bizi bireysel nöronların dendrit belirlemenizi sağlar 35 mm cam alt yemekleri düşük yoğunlukta, kortikal nöronlar. Şekil 1 'de, diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve görüntüler gün 4, 6, 10, in vitro olarak 14, 21 ve 27 fetal sıçan kortikal nöronlar geliştirmek morfolojik değişiklikleri gösterir. uzunluk ve Dentritlerin sayısı kültürlü sıçan primer nöronlar olgunlaşması ile artış...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol, bize bireysel nöronların dendrit belirlemenizi sağlar 35 mm cam alt yemekleri düşük yoğunlukta sıçan kortikal nöronların kültürleme açıklar. Sonra, dendritik değişiklikleri tespit etmek faloidin ve map2 boyama kullanın. Sonra, F-aktin puncta değişiklikleri ölçmek için özel yazılım kullanılır.

F-aktin puncta bireysel nöronun tüm nöronal ağ açıkça görünür olmalıdır değişiklikleri belirlemek için, bu tek bir nörondan uygun ikinci derecede...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 medium	Life Technologies	10565-018
Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054
Poly-L-Lysine	Sigma	P9155
Boric acid	Sigma	B0252
Borax	Sigma	B9876
GlutaMax	Life Technologies	35050-061	100X
Glucose	VWR	101174Y
HBSS	Sigma	H4641	10X
Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049
B-27 supplement	Life Technologies	17504-044	50X
Antibiotic-Antimycotic solution	Cellgro	30004CI	100X
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080
Vannas Scissors	World Precision Instruments	500086
Iris Scissors	World Precision Instruments	500216
Iris Forceps	World Precision Instruments	15914
Dumont #7 Forceps	World Precision Instruments	14097
Dumont #5 Forceps	World Precision Instruments	14095
ProLong Gold	Life Technologies	P36930
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Cover glass	VWR	631-0137
AlexaFluor 488 Phalloidin	Life Technologies	A12379
Normal horse serum	Life Technologies	26050-070
Chicken polyclonal anti-MAP2	abcam	Ab92434
Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG	Life Technologies	A11042
NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342	Life Technologies	R37605
NIS-Elements software package	Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope	Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene nylon membrane filter	Fishersci	151-4020