توجه طريقة تطور في<em&gt; خميرة الخباز</em&gt;: المسخ مكتبة الخلق والفرز

Summary

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

التطور الموجه في خميرة الخباز يقدم العديد من المزايا الجذابة عند تصميم الانزيمات لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية، وهي عملية تنطوي على البناء، والاستنساخ والتعبير المكتبات متحولة، بالإضافة إلى ارتفاع وتيرة مثلي إعادة التركيب الحمض النووي في الجسم الحي. هنا، نقدم بروتوكول لإنشاء والمكتبات شاشة متحولة في الخميرة على أساس مثال على فطرية أريل الكحول أوكسيديز (AAO) لتعزيز نشاطها الكامل. تعرض جزأين البروتين لتطور ركزت توجيهها بواسطة الطفرات العشوائية وإعادة التركيب الحمض النووي في الجسم الحي. سمحت يتدلى من ~ 50 نقطة المرافقة كل قطعة إعادة التجميع الصحيح من الجين AAO الانصهار في ناقلات خطي مما أدى إلى كامل البلازميد تكرار مستقل. تم فحص المكتبات متحولة المخصب مع المتغيرات AAO الوظيفية في س. supernatants الخباز مع حساسية فحص عالية الإنتاجية بناء على رد فعل فنتون. عملية العامة للبناء المكتبة في س. وصف الخباز هنا يمكن تطبيقها بسهولة أن تتطور العديد من الجينات حقيقية النواة الأخرى، وتجنب ردود الفعل PCR إضافية، في المختبر إعادة التركيب الحمض النووي وربط الخطوات.

Introduction

التطور الجزيئي الموجه هو وسيلة قوية وسريعة وموثوق بها لتصميم الإنزيمات ^{1، 2،} ومن خلال جولات متكررة من الطفرات العشوائية، إعادة التركيب والفحص، إصدارات محسنة من الإنزيمات يمكن أن تتولد التي تعمل على ركائز جديدة، في تفاعلات جديدة، في غير طبيعي البيئات، أو حتى لمساعدة الخلية لتحقيق أهداف الأيض جديدة ^3-5. بين المضيفين استخدامها في التطور الموجه، والبيرة خميرة الخباز يوفر ذخيرة من الحلول للتعبير الوظيفي للبروتينات حقيقية النواة المعقدة التي لا تتوفر إلا في نظرائهم بدائية النواة ^6،7.

تستخدم شاملة في دراسات بيولوجيا الخلايا، وهذا النموذج حقيقية النواة الصغيرة لديها العديد من المزايا من حيث التعديلات بعد متعدية، وسهولة التلاعب والتحول الكفاءة، وكلها صفات هامة لهندسة الانزيمات التي كتبها التطور الموجه ^8. وعلاوة على ذلك، فإن ارتفاع وتيرةإعادة التركيب الحمض النووي مثلي في س. الخباز بالإضافة إلى جهاز فعال في تصحيح التجارب المطبعية يفتح مجموعة واسعة من الاحتمالات لإنشاء مكتبة والتجمع الجينات في الجسم الحي، وتعزيز تطور أنظمة مختلفة من الانزيمات واحدة لمسارات صناعية معقدة ^9-12. أنفقت مختبرنا العقد الماضي أدوات واستراتيجيات تصميم للتطور الجزيئي للligninases مختلفة في خميرة (إنزيم أكسدة-اختزال تشارك في تدهور اللجنين خلال تسوس الخشب) ^13-14. في هذه الاتصالات، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لإعداد والمكتبات شاشة متحولة في س. الخباز لنموذج flavooxidase، أوكسيديز -aryl من الكحول (AAO ¹⁵⁾ -، والتي يمكن ترجمتها بسهولة إلى العديد من الإنزيمات الأخرى. ويشمل البروتوكول طريقة التطور الموجه تركيزا (تحوير: الطفري المنظمة التوحد عملية كتبها مثلي في الجسم الحي التجمع) بمساعدة من جهاز خلية الخميرة ^16، لدا حساس جدا الفحص الفحص بناء على رد فعل فنتون من أجل الكشف عن النشاط AAO تفرز في مرق الثقافة ^17.

Protocol

1. المسخ مكتبة البناء

1. اختيار مناطق يتعرضون لتتحول مع مساعدة من خوارزميات حسابية على أساس المتاحة التركيب البلوري أو التماثل نماذج ^18.
   1. هنا، استهداف منطقتين من AAO من محاري ايرنغي عن الطفرات العشوائية وإعادة التركيب (الأرصاد [α1] -Val109، Phe392-Gln566)، في حين أن تضخيم ما تبقى من الجينات (844 بي بي) عن ارتفاع الدقة PCR (الشكل 1).
      ملاحظة: عدة قطاعات يمكن دراستها عن طريق تتحول بطريقة مستقلة أو مجتمعة ^16.
2. تضخيم المناطق المستهدفة من قبل مطفرة PCR. إنشاء المناطق الواقعة بين شرائح (~ 50 نقطة لكل منهما) متداخلة عن طريق إضافة ردود الفعل PCR في مناطق محددة.
   1. إعداد مطفرة PCR من شرائح المستهدفة في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر التي تحتوي على قالب الحمض النووي (0.92 نانوغرام / ميكرولتر)، و 90 نانومتر بنسبة ضئيلة معنى (RMLN لقطاع MI وAAO-BP لشريحة M-II)، و 90 نانومتر لntisense التمهيدي (AAO-92C لقطاع MI وRMLC لشريحة M-II)، 0.3 ملي dNTPs (0.075 مم لكل منهما)، و 3٪ (ت / ت) ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، 1.5 ملي MgCl _2، 0.05 ملي MnCl ₂ و 0.05 U / ميكرولتر طق الحمض النووي بوليميريز. وترد تفاصيل الاشعال تسلسل في الشكل 1.
   2. استخدام البرنامج PCR التالية: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة (1 دورة)؛ 95 درجة مئوية لمدة 45 ثانية و 50 درجة مئوية لمدة 45 ثانية، 74 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (28 دورات)؛ و 74 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (1 دورة).
3. تضخيم المناطق غير مطفرة مع فائق البلمرة الإخلاص وتشمل المناطق المقابلة تداخل القطاعات تسبب الطفرات الوراثية و / أو يتدلى ناقلات خطي.
   1. تحضير مخاليط رد فعل في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر تحتوي على قالب الحمض النووي (0.2 نانوغرام / ميكرولتر)، 250 نانومتر بنسبة ضئيلة الشعور HFF، 250 نانومتر بنسبة ضئيلة العقاقير HFR، 0.8 ملي dNTPs (0.2 ملم لكل منهما)، و 3٪ (ت / ت) ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) و 0.02 U / ميكرولتر iproof البلمرة DNA. وترد تفاصيل الاشعال تسلسل في <قوي> الشكل 1.
   2. استخدام البرنامج PCR التالية: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (1 دورة)؛ 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 25 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (28 دورات)؛ و 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (1 دورة).
      ملاحظة: مع الشروط الموضحة في 1.2 و 1.3 التداخل من 43 سنة مضت (المنطقة البلازميد-M1)؛ 46 سنة مضت (M1 المنطقة منطقة HF)؛ 47 سنة مضت (HF المنطقة-M2 المنطقة) و61 سنة مضت (M2 البلازميد كل إقليم) مصممة (الشكل 1) لصالح في الربط المجراة في الخميرة.
   3. تنقية كافة شظايا PCR (مطفرة وغير مطفرة) مع مجموعة استخراج الهلام التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
4. خطي ناقلات بحيث مناطق ما يقرب من 50 نقطة المرافقة يتم إنشاؤها التي هي مثلي إلى 5'- و3'ينتهي من الجين المستهدف.
   1. إعداد خليط التفاعل الخطية التي تحتوي على 2 ميكروغرام الحمض النووي، 7.5 U بام مرحبا، 7.5 U Xho الأول، 20 ميكروغرام BSA و 2 ميكرولتر من الاحتياطي بام مرحبا 10X في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر.
   2. احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة و 40 دقيقة. بعد ذلك، انتقل مع تعطيل في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
5. تنقية ناقلات خطي عن طريق استخراج هلام الاغاروز لتجنب التلوث مع البلازميد دائري المتبقية (الشكل 2).
   1. تحميل مزيج رد فعل الهضم في ميجا جيدا من شبه إعدادي انخفاض درجة انصهار agarose هلام (0.75٪، ث: •)، فضلا عن قسامة (5 ميكرولتر) من مزيج رد فعل في المتاخمة كذلك المراسل.
   2. تشغيل الحمض النووي الكهربائي (5 فولت / سم بين الأقطاب، 4 ᵒC) وفصل agarose هلام الموافق الضخمة جيدا وتخزينها في 4 ᵒC في 1X تاي.
   3. وصمة عار على حارة مع سلم الوزن الجزيئي والصحفي. تصور العصابات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. نيك الموقف حيث متجه الأماكن خطي.
      ملاحظة: كما أن نوعية ناقلات خطي تنقيته هو critiعامل كال لإعادة التركيب الناجح والتجمع في الخميرة، وتجنب تلطيخ هلام لالكهربي الحمض النووي شبه إعدادي. استخدام الأصباغ والتعرض للأشعة فوق البنفسجية لاستخراج الهلام قد تؤثر على استقرار ناقلات الحمض النووي، والمساس في الجسم الحي كفاءة إعادة التركيب. كبديل لالأصباغ EtBr السامة، يتم استخدام جل الأحمر والأصباغ SYBR عادة لتلطيخ هلام.
   4. في حالة عدم وجود ضوء الأشعة فوق البنفسجية، وتحديد ناقلات خطي في جزء الضخمة جيدا باستخدام بتوجيه من النكات في حارة مراسل الملون بحيث يمكن أن تكون معزولة.
   5. استخراج ناقلات خطي من الاغاروز وتطهيره مع مجموعة استخراج الهلام التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      ملاحظة: استخدام نسخة عالية-ناقلات المكوك episomal مع علامات المضادات الحيوية وauxotrophy: في هذا المثال قمنا باستخدام اليوراسيل مستقل والأمبيسلين المقاومة pJRoC30 ناقلات تحت سيطرة المروج الخميرة GAL1.
6. إعداد ميل متساوي الموليةxture من شظايا PCR ومزجها مع ناقلات خطي في نسبة 2: 1، مع ما لا يقل عن 100 نانوغرام البلازميد خطي (اختبار نسب مختلفة من مكتبة متساوي المولية / ناقلات مفتوحة لتحقيق عوائد التحول جيدة).
   1. قياس الامتصاصية من شظايا PCR وناقلات خطي في 260 نانومتر و 280 نانومتر لتحديد تركيز والنقاء.
7. تحويل خلايا المختصة الخميرة مع الخليط الحمض النووي باستخدام عدة خميرة التحول التجاري (أنظر الجدول لوازم) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   1. هنا، استخدام البروتيني ناقصة وURA3 ^- S. تعتمد الخباز السلالة، BJ5465. تحويل الخلايا مع ناقلات circularized الوالدين كمعيار داخلي أثناء الفرز (أنظر أدناه). بالإضافة إلى ذلك، تحقق الخلفية من خلال تحويل ناقلات خطي في حالة عدم وجود شظايا PCR.
      ملاحظة: في حالة اكتشاف مستويات إفراز منخفضة الأولية، استخدم س.الخباز البروتيني سلالات ناقصة مثل BJ5465 لتعزيز تراكم البروتينات النشطة في supernatants الثقافة. إذا كان انزيم الهدف يخضع hyperglycosylation، واستخدام سلالات بالغليكوزيل ناقصة (على سبيل المثال، Δ kre2 التي هي قادرة على ربط الأوليغومرات المانوز أصغر فقط) يمكن أن يكون خيارا مناسبا.
8. لوحة الخلايا تحولت على لوحات SC التسرب واحتضان لهم عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. لوحة (على SC التسرب لوحات تستكمل مع اليوراسيل) URA3 ^- S. خلايا خميرة تفتقر البلازميد كعنصر تحكم السلبية للفحص (أنظر أدناه).

2. عالية الإنتاجية الفحص الفحص (الشكل 3)

1. ملء عدد مناسب من لوحات 96-جيدا العقيمة (23 وحات لتحليل مكتبة من 2000 استنساخ) مع 50 ميكرولتر الحد الأدنى من المتوسط ​​لكل بئر بمساعدة الروبوت pipetting ل.
2. اختيار المستعمرات الفردية من SC التسرب لوحات وتحويلها إلى لوحات 96-جيدا.
   1. في كل لوحة، تطعيم العمود رقم 6 مع نوع الوالدين كمعيار داخلي وH1 بشكل جيد مع URA3 ^- S. خلايا خميرة (في المتوسط ​​SC تستكمل مع اليوراسيل) مع عدم وجود البلازميد كعنصر تحكم السلبية.
      ملاحظة: شغل حسنا H1 تحديدا مع وسائل الاعلام التسرب تستكمل مع اليوراسيل. وفارغة تحتوي كذلك وسائل الإعلام دون الخلايا يمكن أن تكون مستعدة أيضا كعنصر تحكم العقم إضافية.
3. تغطية لوحات مع أغطية والتفاف عليها في بارافيلم. احتضان لوحات لمدة 48 ساعة على 30 درجة مئوية، 225 دورة في الدقيقة والرطوبة النسبية 80٪ في شاكر رطب.
4. إزالة بارافيلم، إضافة 160 ميكرولتر من المتوسط ​​التعبير إلى كل بئر بمساعدة الروبوت pipetting ل، ختم لوحات واحتضان لهم لمدة 24 ساعة أخرى.
   ملاحظة: يتم إعداد المتوسطة الحد الأدنى والمتوسط ​​التعبير كما ذكرت في مكان آخر ^(19). قد تختلف مستويات إفراز اعتمادا على الجينات قيد الدراسة وفقا لذلك، رانه الحضانة يجب أن يكون الأمثل مرات في كل حالة لمزامنة نمو الخلايا في جميع الآبار.
5. أجهزة الطرد المركزي لوحات (لوحات رئيسية) في 2800 ز س لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
6. نقل 20 ميكرولتر من طاف من الآبار في لوحة الرئيسي إلى لوحة المتماثلة باستخدام السائل التعامل مع multistation الروبوتية.
   ملاحظة: لصالح إفراز انزيم فإنه من المستحسن أن تحل محل الببتيد إشارة الأصلي من البروتين الهدف من الببتيدات إشارة تستخدم عادة للتعبير مغاير في الخميرة (على سبيل المثال، فإن العامل α prepro زعيم، زعيم K ₁ القاتل السم من س. الخباز، أو حتى إصدارات خيالية من كلا الببتيدات ^13). بدلا من ذلك، إشارة الببتيد الأصلي ويمكن أن تتطور بشكل حصري لإفراز في الخميرة.
7. إضافة 20 ميكرولتر من 2 مم ص -methoxybenzylalcohol في 100 ملي فوسفات الصوديوم العازلة درجة الحموضة 6.0 بمساعدة الروبوت pipetting ل. تحريك لوحات لفترة وجيزة مع 96-نحنليرة لبنانية لوحة خلاط واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في RT.
8. مع الروبوت pipetting ل، إضافة 160 ميكرولتر من كاشف FOX إلى كل لوحة نسخة ويقلب لفترة وجيزة مع الخلاط (تركيز النهائي من FOX الخليط في البئر: 100 ميكرومتر زايلينول البرتقال، و 250 ميكرومتر الحديد (NH _{4) 2} (SO _{4) 2} و25 مم H ₂ SO _4).
   1. إضافة عدة إضافات إلى كاشف لتعزيز حساسية، مثل العضوية المشارك المذيبات ([دمس، والإيثانول والميثانول) أو السوربيتول ^17. هنا، تضخيم الاستجابة عن طريق إضافة السوربيتول إلى تركيز النهائي من 100 ملي (الشكل 4).
9. قراءة لوحات (وضع نقطة النهاية، ر ₀₎ في 560 نانومتر على قارئ لوحة.
10. احتضان لوحات في RT حتى يتطور لون وقياس امتصاص مرة أخرى (ر _1).
    1. حساب النشاط النسبي من الفرق بين القيمة المطلقة بعد الحضانة، وأنه من القياس المبدئي تطبيع لحلجنوع ntal لكل لوحة (Δt ₁ - ر _0).
11. تعرض يضرب أفضل متحولة إلى مرتين متتاليتين إعادة الفحوصات لاستبعاد ايجابيات كاذبة.
    ملاحظة: عادة، تتضمن إعادة الفحص والعزل البلازميد من الخميرة، والتضخيم والتنقية في كولاي، تليها التحول من خلايا الخميرة الطازجة مع البلازميد ^19. يعاد فحص-كل استنساخ مختارة في pentaplicate.

النتائج

AAO من P. eryngii هو flavooxidase خارج الخلية التي تزود مستخلصات الفطرية مع H ₂ O ₂ لبدء الهجوم على اللجنين. تعرض اثنين من شرائح AAO إلى التطور الموجه تركز على أيدي تتحول من أجل تعزيز نشاطها والتعبير في س. الخباز ^19. بغض النظر عن الانزيمات ا?...

Discussion

في هذه المقالة، نحن لخصت معظم النصائح والحيل المستخدمة في المختبر لدينا لهندسة الانزيمات التي كتبها التطور الموجه في س. الخباز (باستخدام AAO كمثال) بحيث يمكن تكييفها للاستخدام مع العديد من أنظمة انزيم حقيقية النواة الأخرى ببساطة عن طريق اتباع النهج المشترك هو مو?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Culture media
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Yeast Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	For error prone PCR
Name	Company	Catalog Number	Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9001S
XhoI restriction enzyme	New England Biolabs	R0146S
Not I restriction enzyme	New England Biolabs	R0189S
Gel Red	Biotium	41003	For staining DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name	Company	Catalog Number	Comments
5. Agarose gel stuff
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA analysis dye
GeneRuler 1kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Low-melting temperature agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
6. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465	LGC Promochem	ATTC 208289	Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells	Agilent genomics	200150	For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmid extraction from yeast
Name	Company	Catalog Number	Comments
7. Plates
96-well plates	Greiner Bio-One	655101	Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)
96-well plates	Greiner Bio-One	655161	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid	Greiner Bio-One	656171	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)