Dirigida Método Evolución en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Creación y Proyección

Resumen

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Resumen

La evolución dirigida en Saccharomyces cerevisiae ofrece muchas ventajas atractivas en el diseño de enzimas para aplicaciones biotecnológicas, un proceso que consiste en la construcción, la clonación y la expresión de bibliotecas de mutantes, junto a la alta frecuencia de recombinación homóloga de ADN in vivo. A continuación, se presenta un protocolo para crear y bibliotecas mutantes de levadura en pantalla basado en el ejemplo de un fungicida aril-alcohol oxidasa (AAO) para mejorar su actividad total. Dos segmentos de proteínas se sometieron a la evolución dirigida-centrado por mutagénesis aleatoria y recombinación de ADN in vivo. Voladizos de ~ 50 pb que flanquean cada segmento permite el correcto montaje del gen AAO-fusión en un vector linealizado que da lugar a un plásmido de replicación autónoma completa. Bibliotecas mutantes enriquecidos con variantes funcionales AAO se rastrearon en S. sobrenadantes cerevisiae con un ensayo de alto rendimiento sensible basado en la reacción de Fenton. El proceso general deconstrucción de la biblioteca en S. cerevisiae se describe aquí se puede aplicar fácilmente a evolucionar muchos otros genes eucarióticos, evitando reacciones adicionales de PCR, en la recombinación de ADN y la ligadura pasos in vitro.

Introducción

Evolución molecular dirigida es un método robusto, rápido y fiable para diseñar enzimas ^{1, 2.} A través de rondas iterativas de mutación al azar, recombinación y análisis, versiones mejoradas de las enzimas se pueden generar que actúan sobre los nuevos sustratos, en las reacciones novedosas, en no natural ambientes, o incluso para ayudar a la célula para alcanzar nuevos objetivos metabólicos ^3-5. Entre los anfitriones utilizados en la evolución dirigida, levadura Saccharomyces cerevisiae de cerveza ofrece un repertorio de soluciones para la expresión funcional de las proteínas eucariotas complejos que no son de otra manera disponible en homólogos procariotas ^6,7.

Se utiliza exhaustivamente en estudios de biología celular, este pequeño modelo eucariota tiene muchas ventajas en términos de las modificaciones post-traduccionales, la facilidad de manipulación y la eficiencia de transformación, todos los cuales son rasgos importantes para diseñar enzimas por evolución dirigida ^8. Por otra parte, la alta frecuenciade la recombinación del ADN homólogo en S. cerevisiae acoplado a su aparato de prueba de lectura eficiente abre una amplia gama de posibilidades para la creación de la biblioteca y el conjunto de genes in vivo, el fomento de la evolución de los diferentes sistemas de enzimas individuales a vías artificiales complejos ^9-12. Nuestro laboratorio ha pasado la última década el diseño de herramientas y estrategias para la evolución molecular de diferentes ligninasas en la levadura (oxidorreductasas implicadas en la degradación de la lignina durante la descomposición de la madera natural) ^13-14. En esta comunicación, presentamos un protocolo detallado para preparar y bibliotecas mutantes pantalla en S. cerevisiae para un modelo flavooxidase, alcohol-oxidasa-arilo (AAO ¹⁵⁾ -, que se puede traducir fácilmente a muchas otras enzimas. El protocolo consiste en un método de evolución dirigida centrado (MORPHING: Proceso mutagénico Organizada recombinación homóloga in vivo por la Agrupación), asistido por el aparato de célula de levadura ^16, unada ensayo de cribado muy sensible basado en la reacción de Fenton con el fin de detectar la actividad de AAO secretada en el caldo de cultivo ^17.

Protocolo

1. Mutante de construcción de biblioteca

1. Elegir las regiones para ser sometidos al de transformación con la ayuda de algoritmos de cálculo en base a la estructura cristalina o de homología de ¹⁸ modelos disponibles.
   1. Aquí, el objetivo de dos regiones de AAO de Pleurotus eryngii para la mutagénesis al azar y la recombinación (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), mientras que la amplificación de la resto del gen (844 bp) por PCR de alta fidelidad (Figura 1).
      Nota: Varios segmentos pueden ser estudiados por MORPHING de manera independiente o combinada ^16.
2. Amplificar las zonas seleccionadas por PCR mutagénica. Crear áreas entre segmentos (~ 50 pb cada uno) se superponen mediante la superposición de las reacciones de PCR de las regiones definidas.
   1. Preparar PCR mutagénica de los segmentos objetivo en un volumen final de 50 l que contenía ADN molde (0.92 ng / l), 90 nM sentido oligo (RMLN para el segmento de MI y AAO-BP para el segmento M-II), 90 nM unacebador ntisense (AAO-92C para el segmento de MI y RMLC para el segmento M-II), dNTPs 0,3 mM (0,075 mM cada uno), 3% (v / v) sulfóxido de dimetilo (DMSO), 1,5 mM MgCl _2, MnCl 0,05 mM ₂ y 0,05 U / l de Taq ADN polimerasa. Secuencias de cebadores se detalla en la Figura 1.
   2. Utiliza el siguiente programa de PCR: 95ºC durante 2 min (1 ciclo); 95 ° C durante 45 s, 50ºC durante 45 s, 74ºC durante 45 segundos (28 ciclos); y 74 ° C durante 10 min (1 ciclo).
3. Amplificar las regiones no mutagénicos con ultra alta fidelidad de la polimerasa e incluyen las áreas correspondientes se solapan los segmentos mutagénicos y / o salientes vector linealizado.
   1. Preparar las mezclas de reacción en un volumen final de 50 l que contenía: plantilla de ADN (0,2 ng / l), 250 nM sentido oligo HFF, 250 nM HFR oligo antisentido, mM dNTPs 0,8 (0,2 mM cada uno), 3% (v / v) de dimetilsulfóxido (DMSO) y 0,02 U / l iproof ADN polimerasa. secuencias de los cebadores se detallan en Figura 1.
   2. Utiliza el siguiente programa de PCR: 98 ° C durante 30 segundos (1 ciclo); 98 ° C durante 10 seg, 55 ° C durante 25 seg, 72 ° C durante 45 seg (28 ciclos); y 72 ° C durante 10 min (1 ciclo).
      Nota: Con las condiciones descritas en el punto 1.2 y 1.3 solapamientos de 43 pb (región de plásmido-M1); 46 pb (M1 región por región HF); 47 pb (región-región M2 HF) y 61 pb (M2 plásmido región) se han diseñado (Figura 1) para favorecer el empalme en vivo en la levadura.
   3. Purificar todos los fragmentos de PCR (mutagénicos y no mutagénicos) con un kit de extracción de gel comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante.
4. Linealizar el vector de modo que se crean regiones de aproximadamente 50 pares de bases que flanquean que son homólogos a los extremos 5 'y 3' extremos del gen diana.
   1. Preparar una mezcla de reacción que contiene linealización 2 g de ADN, 7,5 U Bam HI, 7,5 U XhoI, 20 g de BSA y 2 l de tampón de Bam HI 10x en un volumen final de 20 l.
   2. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 2 horas y 40 min. A continuación, proceder a la inactivación a 80 ° C durante 20 minutos.
5. Se purifica el vector linealizado mediante extracción en gel de agarosa para evitar la contaminación con el plásmido circular residual (Figura 2).
   1. Cargar la mezcla de reacción de digestión en el mega-pocillo de una bajo punto de fusión en gel de agarosa semi-preparativa (0,75%, w: v), así como una parte alícuota (5 l) de la mezcla de reacción en el adyacente así como un reportero.
   2. Ejecutar electroforesis de ADN (5 V / cm entre los electrodos, 4 ᵒC) y separar el gel de agarosa correspondiente a la mega bien y que lo conserve en 4 ᵒC en 1x TAE.
   3. Manchar el carril con la escala de peso molecular y el reportero. Visualizar las bandas bajo luz UV. Nick la posición en los lugares vector linealizado.
      Nota: Como la calidad del vector linealizado purificado es un critifactor de cal para la recombinación exitosa y montaje en la levadura, para evitar mancharse gel de electroforesis de ADN semi-preparativa. El uso de colorantes y la exposición UV para la extracción de gel puede afectar a la estabilidad del vector de ADN, comprometer la eficacia de recombinación in vivo en. Como alternativa a los colorantes EtBr tóxicos, colorantes SYBR Gel Red y se utilizan comúnmente para la tinción de gel.
   4. En la ausencia de luz UV, identificar el vector linealizado en el fragmento de mega-bien utilizando la guía de las muescas en el carril de reportero manchado de modo que pueda ser aislado.
   5. Extraer el vector linealizado a partir de agarosa y se purifica con un kit de extracción de gel comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante.
      Nota: Use vectores lanzadera episomal de alta copia con marcadores de antibióticos y auxotrofía: En este ejemplo se empleó el uracilo independiente y ampicilina resistencia pJRoC30 vector, bajo el control del promotor de levadura GAL1.
6. Preparar un IM equimolarxture de los fragmentos de PCR y se mezcla con el vector linealizado en una proporción de 2: 1, con no menos de 100 ng de plásmido linealizado (prueba de diferentes proporciones de biblioteca equimolar / vector abierta para lograr buenos rendimientos de transformación).
   1. Medir la absorbancia de los fragmentos de PCR y el vector linealizado en 260 nm y 280 nm para determinar su concentración y pureza.
7. Transformar células competentes de levadura con la mezcla de ADN utilizando un kit de transformación de levadura comercial (véase la Tabla de suministros) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   1. A continuación, utilice una proteasa deficiente y URA3 ^- S. dependientes cerevisiae cepa, BJ5465. Transformar las células con el vector parental circularizado como un estándar interno durante la selección (véase a continuación). Además, compruebe el fondo mediante la transformación del vector linealizado en ausencia de fragmentos de PCR.
      Nota: En caso de detectar niveles iniciales bajos de secreción, use S.cerevisiae cepas deficientes en proteasa como BJ5465 de favorecer la acumulación de proteína activa en sobrenadantes de cultivo. Si la enzima diana se somete a hiperglicosilación, el uso de cepas deficiente en glicosilación (por ejemplo, Δ kre2 que sólo es capaz de fijar oligómeros de manosa más pequeñas) podría ser una opción adecuada.
8. Placa de las células transformadas en placas de deserción SC y los incuban a 30 ° C durante tres días. Placa (en placas de deserción SC suplementado con uracilo) URA3 ^- S. células cerevisiae que carecen de plásmido como control negativo para la detección (ver abajo).

2. Alta-Throughput Screening de ensayo (Figura 3)

1. Llenar un número apropiado de placas de 96 pocillos estériles (23 placas para analizar una biblioteca de 2.000 clones) con 50 l de medio mínimo por pocillo con la ayuda de un robot de pipeteado.
2. Recoger las colonias individuales de la SC-abandono placas y transferirlos a las placas de 96 pocillos.
   1. En cada placa, inocular número de columna 6 con el tipo parental como patrón interno y así H1 con URA3 ^- S. células cerevisiae (en medio SC suplementado con uracilo) sin plásmido como control negativo.
      Nota: Bueno H1 está llena específicamente con los medios de deserción suplementado con uracilo. Un medio bien contiene en blanco sin células también puede prepararse como un control de esterilidad adicional.
3. Se cubren las placas con sus tapas y envolverlos en Parafilm. Incubar las placas durante 48 horas a 30 ° C, 225 rpm y 80% de humedad relativa en un agitador húmedo.
4. Retire el Parafilm, añadir 160 l de medio de expresión a cada pocillo con la ayuda del robot de pipeteado, vuelva a sellar las placas y se incuban durante 24 horas.
   Nota: medio mínimo y medio de expresión se preparan como informado en otras partes ^19. los niveles de secreción pueden variar en función del gen bajo estudio y, en consecuencia, tél incubación veces deben ser optimizados en cada caso para sincronizar el crecimiento de las células en todos los pocillos.
5. Centrifugar las placas (placas maestras) a 2800 x g durante 10 min a 4 ° C.
6. Transferencia de 20 l del sobrenadante de los pocillos de la placa principal a la placa de réplica usando un manejo multiestación robótico líquido.
   Nota: Para favorecer la secreción de enzimas, es aconsejable sustituir el péptido señal nativa de la proteína diana mediante péptidos señal comúnmente utilizados para la expresión heteróloga en la levadura (por ejemplo, el factor α prepro-líder, el líder de la K ₁ Killer toxina de S. cerevisiae, o incluso versiones quiméricas de ambos péptidos ^13). Alternativamente, el péptido señal nativo puede ser desarrollado exclusivamente para la secreción en la levadura.
7. Añadir 20 l de p -methoxybenzylalcohol 2 mM en tampón de fosfato de sodio 100 mM pH 6,0 con la ayuda del robot de pipeteado. Agitar las placas brevemente con un 96-nosll mezclador de placas y se incuba durante 30 min a TA.
8. Con el robot de pipeteado, añadir 160 l de reactivo FOX a cada placa de réplica y agitar brevemente con el mezclador (concentración final de la mezcla de FOX en el pozo: 100 M xilenol naranja, 250 M Fe _{(NH4) 2 (SO4) 2} y 25 mm de H ₂ SO _4).
   1. Añadir varios aditivos al reactivo para mejorar la sensibilidad, tales como co-disolventes orgánicos (DMSO, etanol, metanol) o sorbitol ^17. Aquí, amplificar la respuesta mediante la adición de sorbitol a una concentración final de 100 mM (Figura 4).
9. Leer las placas (modo de punto final, t ₀₎ a 560 nm en un lector de placas.
10. Incubar las placas a temperatura ambiente hasta que se desarrolle el color y medir la absorción de nuevo (t _1).
    1. Calcular la actividad relativa de la diferencia entre el valor Abs después de la incubación y el de la medición inicial normalizado a la pareTipo ntal para cada placa (Dt ₁ - t _0).
11. Someter los mejores éxitos mutantes a dos re-exámenes consecutivos para descartar falsos positivos.
    Nota: Por lo general, re-proyecciones incluyen el aislamiento del plásmido de la levadura, la amplificación y purificación en Escherichia coli, seguido de la transformación de células de levadura fresca con el plásmido ^19. Cada clon seleccionado se vuelve a proyectará en pentaplicate.

Resultados

AAO de P. Eryngii es un flavooxidase extracelular que suministra peroxidasas fúngicas con H ₂ O ₂ a empezar a atacar la lignina. Dos segmentos de AAO se sometieron a la evolución dirigida centrado-morphing con el fin de mejorar su actividad y su expresión en S. ¹⁹ cerevisiae. Independientemente de las enzimas extranjeros albergadas por S. cerevisiae, el problema más crítico en la construcción de bibliotecas de mut...

Discusión

En este artículo, hemos resumido la mayor parte de los consejos y trucos empleados en nuestro laboratorio para diseñar enzimas por evolución dirigida en S. cerevisiae (usando AAO como ejemplo) para que puedan ser adaptados para su uso con muchos otros sistemas de enzimas eucariotas simplemente siguiendo el enfoque común se describe aquí.

En cuanto a la creación de la biblioteca, el morphing es un método rápido de un solo recipiente para introducir y recombinar las mutaciones...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Culture media
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Yeast Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	For error prone PCR
Name	Company	Catalog Number	Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9001S
XhoI restriction enzyme	New England Biolabs	R0146S
Not I restriction enzyme	New England Biolabs	R0189S
Gel Red	Biotium	41003	For staining DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name	Company	Catalog Number	Comments
5. Agarose gel stuff
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA analysis dye
GeneRuler 1kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Low-melting temperature agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
6. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465	LGC Promochem	ATTC 208289	Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells	Agilent genomics	200150	For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmid extraction from yeast
Name	Company	Catalog Number	Comments
7. Plates
96-well plates	Greiner Bio-One	655101	Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)
96-well plates	Greiner Bio-One	655161	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid	Greiner Bio-One	656171	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)