Dirigido Método Evolução<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Criação e Triagem

Resumo

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Resumo

Evolução dirigida em Saccharomyces cerevisiae oferece muitas vantagens atraentes no projecto enzimas para aplicações biotecnológicas, um processo que envolve a construção, clonagem e expressão de bibliotecas de mutantes, acoplada a alta frequência de recombinação homóloga de ADN in vivo. Aqui, apresentamos um protocolo para criar e bibliotecas mutantes tela em leveduras com base no exemplo de um fúngica oxidase aril-álcool (AAO) para melhorar a sua actividade total. Dois segmentos de proteína foram sujeitos a evolução focalizado dirigido por mutagénese aleatória de ADN e na recombinação in vivo. Saliências de ~ 50 pb que flanqueia cada segmento permitiu a remontagem correcta do gene AAO-fusão num vector linearizado dando origem a um total de plasmídeo de replicação autónoma. Bibliotecas mutantes enriquecidos com variantes funcionais da AAO foram rastreados em S. cerevisiae sobrenadantes com um ensaio de elevado débito sensível com base na reacção de Fenton. O processo geral dea construção da biblioteca em S. cerevisiae aqui descrito pode ser facilmente aplicado a evoluir muitos outros genes eucarióticos, evitando reacções adicionais de PCR in vitro de recombinação de DNA e ligação etapas.

Introdução

Evolução molecular dirigida é um método robusto, rápido e fiável para conceber enzimas ^{1, 2.} Através de ciclos iterativos de aleatória mutação, recombinação e selecção, versões melhoradas das enzimas pode ser gerado que actuam sobre novos substratos, em novas reacções, em não-naturais ambientes, ou até mesmo para ajudar a célula de atingir novos objectivos metabólicas ^3-5. Entre os anfitriões utilizados na evolução dirigida, levedura Saccharomyces cerevisiae da cervejaria oferece um repertório de soluções para a expressão funcional de proteínas eucarióticas complexas que não estejam disponíveis em vias procariotas ^6,7.

Utilizado exaustivamente em estudos de biologia celular, este pequeno modelo eucariótico tem muitas vantagens em termos de modificações pós-traducionais, a facilidade de manipulação e transformação eficiência, todos os quais são características importantes de engenheiro enzimas por evolução dirigida ^8. Por outro lado, a alta frequênciarecombinação homóloga de ADN em S. cerevisiae acoplado ao seu aparelho à prova de leitura eficiente abre um vasto leque de possibilidades para a criação de biblioteca e montagem de gene in vivo, promovendo a evolução de diferentes sistemas de enzimas individuais para vias artificiais complexos ^9-12. Nosso laboratório passou a última década projetando ferramentas e estratégias para a evolução molecular de diferentes ligninases em levedura (Oxirredutases envolvidas na degradação da lignina durante o decaimento de madeira natural) ^13-14. Nesta comunicação, nós apresentamos um protocolo detalhado para preparar e bibliotecas mutantes tela em S. cerevisiae para um modelo flavooxidase, -aril-oxidase de álcool (AAO ¹⁵⁾ -, que podem ser facilmente convertidos para muitas outras enzimas. O protocolo envolve um método evolução focada-dirigida (MORPHING: Processo mutagênicos Organizado recombinação homóloga in vivo pelo Agrupamento) assistida pelo aparelho celular de levedura ^16, umda ensaio de rastreio muito sensível com base na reacção de Fenton, a fim de detectar a actividade AAO secretado para o caldo de cultura ^17.

Protocolo

1. Construção do mutante Biblioteca

1. Escolher as regiões a ser submetido à transição com a ajuda de algoritmos computacionais com base na estrutura de cristal ou homologia modelos disponíveis ^18.
   1. Aqui, como alvo duas regiões de AAO de Pleurotus eryngii de mutagénese aleatória e recombinação (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), enquanto amplifica o restante do gene (844 pb) por PCR de alta fidelidade (Figura 1).
      Nota: Vários segmentos podem ser estudados por MORPHING de forma independente ou combinada ^16.
2. Ampliar as áreas visadas por PCR mutagênico. Criar áreas entre os segmentos (~ 50 pb cada) sobreposto por sobreposição de reacções de PCR das regiões definidas.
   1. Prepare PCR mutagénica de segmentos-alvo num volume final de 50 uL contendo uma cadeia molde de ADN (0,92 ng / uL), 90 nM de senso de oligo (RMLN para o segmento de MI e AAO-PA para o segmento M-II), 90 nM de uminiciador ntisense (AAO-92C para o segmento de MI e rMLC para segmento H-II), dNTPs 0,3 mM (0,075 mM de cada), 3% (v / v) de dimetilsulfóxido (DMSO), MgCl 1,5 mM, _MnCl2 0,05 mM de ₂ e 0,05 U / ul de polimerase de ADN de Taq. Sequências de iniciadores são detalhadas na Figura 1.
   2. Usar o seguinte programa de PCR: 95 ° C durante 2 min (1 ciclo); 95 ° C durante 45 seg, 50 ° C durante 45 seg, 74 ° C durante 45 segundos (28 ciclos); e 74 ° C durante 10 min (1 ciclo).
3. Amplificar as regiões não-mutagénicos com ultra-alta polimerase fidelidade e incluem as áreas correspondentes que se sobrepõem os segmentos mutagénicos e / ou saliências vector linearizado.
   1. Prepare misturas reaccionais num volume final de 50 ul contendo: molde de ADN (de 0,2 ng / uL), 250 nM de oligo sentido HFF, 250 nM de oligo anti-sentido de HFR, dNTPs 0,8 mM (0,2 mM cada), 3% (v / v) de dimetilsulfóxido (DMSO) e 0,02 U / ul de polimerase de ADN iproof. sequências de iniciadores são detalhados em Figura 1.
   2. Usar o seguinte programa de PCR: 98 ° C durante 30 seg (1 ciclo); 98 ° C durante 10 seg, 55 ° C durante 25 seg, 72 ° C durante 45 segundos (28 ciclos); e 72 ° C durante 10 min (1 ciclo).
      Nota: Com condições descritas no 1.2 e 1.3 sobreposições de 43 bp (região plasmídeo-M1); 46 bp (região de região-HF M1); 47 pb (região-M2 região HF) e 61 pb (M2 região plasmídeo) são concebidos (Figura 1) para favorecer no splicing in vivo em leveduras.
   3. Purifica-se todos os fragmentos de PCR (mutagénicos e não mutagénicos) com um kit de extracção de gel comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
4. Linearizar o vector de modo a que as regiões de cerca de 50 pb que flanqueia são criados que são homólogas às 5'- e 3'- extremidades do gene alvo.
   1. Prepara-se uma mistura de reacção contendo linearização 2 ug de ADN, 7,5 U de BamHI, 7,5 L Xho I, 20 ug de BSA e 2 ul de tampão Bam HI 10x num volume final de 20 ul.
   2. Incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante 2 h e 40 min. Posteriormente, proceder a inactivação a 80 ° C durante 20 min.
5. Purifica-se o vector linearizado por extracção em gel de agarose a fim de evitar a contaminação com o plasmídeo circular residual (Figura 2).
   1. Carregar a mistura reaccional para a digestão mega-poço de um baixo ponto de fusão do gel de agarose semi-preparativa (0,75%, w: v), bem como uma alíquota (5 pi) da mistura de reacção na adjacentes bem como um repórter.
   2. eletroforese Run DNA (5 V / cm entre os eletrodos, 4 ᵒC) e separar o gel de agarose correspondente ao mega-bem e armazená-lo em 4 ᵒC em 1x TAE.
   3. Manchar a faixa com a escada de peso molecular e o repórter. Visualizar as bandas sob a luz UV. Nick a posição onde os linearizadas lugares vetor.
      Observação: Como a qualidade do vector linearizado purificado é um critifator de cal para a recombinação de sucesso e montagem em levedura, evitar manchas gel para eletroforese de DNA semi-preparativa. O uso de corantes e exposição aos raios UV para a extração de gel pode afectar a estabilidade do vector de ADN, comprometer a eficiência de recombinação in vivo. Como alternativa aos corantes EtBr tóxicos, Gel corantes SYBR vermelha e são comumente usados ​​para a coloração do gel.
   4. Na ausência de luz UV, identificar o vector linearizado no fragmento mega poço utilizando a orientação dos entalhes na pista repórter coradas de modo que ele pode ser isolado.
   5. Extrair o vector linearizado a partir de agarose e purificá-lo com um gel extraction kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
      Nota: O uso de altas cópia vectores vaivém epissomal com marcadores de antibióticos e de auxotrofia: Neste exemplo, aplicou-se o uracilo independente e resistência à ampicilina pJRoC30 vector, sob o controlo do promotor de levedura GAL1.
6. Preparar um mi equimolarxture dos fragmentos de PCR e misturá-lo com o vector linearizado numa proporção de 2: 1, com não menos do que 100 ng do plasmídeo linearizado (teste diferentes rácios de biblioteca equimolar / vector aberto para conseguir bons rendimentos de transformação).
   1. Medir a absorvância dos fragmentos de PCR e o vector linearizado a 260 nm e 280 nm para determinar a concentração e pureza.
7. Transformar células competentes de levedura com a mistura de ADN utilizando um kit de transformação de levedura comercial (ver Tabela para o abastecimento) de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Aqui, use uma protease deficiente e URA3 ^- S. dependentes cerevisiae, BJ5465. Transformar as células com o vector parental circularizado como um padrão interno durante o rastreio (ver abaixo). Além disso, o fundo vá transformando o vector linearizado na ausência de fragmentos de PCR.
      Nota: Em caso de detecção de níveis iniciais de secreção baixos, use S.cerevisiae protease estirpes deficientes como BJ5465 para promover o acúmulo de proteína ativa em sobrenadantes de cultura. Se a enzima alvo é submetido a hiperglicosilação, a utilização de estirpes de glicosilação-deficiente (por exemplo, Δ Kre2 que só é capaz de prender pequenas oligómeros de manose) poderia ser uma opção adequada.
8. Placa as células transformadas em SC placas de abandono e incubar-los a 30 ° C durante três dias. Plate (em SC drop-out placas suplementadas com uracil) URA3 ^- S. cerevisiae células com falta do plasmídeo como um controlo negativo para o rastreio (ver abaixo).

2. Alto Throughput Screening Assay (Figura 3)

1. Encher um número apropriado de placas de 96 poços estéreis (23 placas para analisar uma biblioteca de 2.000 clones) com 50 ul de meio mínimo por cavidade com a ajuda de um robot de pipetagem.
2. Escolha das colónias individuais a partir do SC-gota a placas e transferi-los para as placas de 96 poços.
   1. Em cada prato, inocular número da coluna 6 com o tipo parental como padrão interno e bem H1 com URA3 ^- S. cerevisiae (células em meio SC suplementado com uracilo) sem plasmídeo como um controlo negativo.
      Nota: Bem H1 é preenchido especificamente com os meios de abandono suplementadas com uracil. Um meio contendo bem em branco sem células também pode ser preparado como um controle adicional esterilidade.
3. Cubra as placas com suas tampas e envolvê-los em Parafilm. Incubar as placas durante 48 h a 30 ° C, 225 rpm e 80% de humidade relativa num agitador húmido.
4. Remover o Parafilm, adicionar 160 uL de meio de expressão para cada cavidade com a ajuda do robot de pipetagem, voltar a selar as placas e incubar durante mais 24 h.
   Nota: Minimal médio e médio expressão são preparados como relatado em outros ^19. níveis de secreção podem variar em função do gene em estudo e, consequentemente, tele incubação vezes tem de ser optimizada em cada caso, para sincronizar o crescimento celular em todas as cavidades.
5. Centrifugar as placas (placas mestres) a 2800 x g durante 10 min a 4 ° C.
6. Transferir 20 uL do sobrenadante dos poços na placa mestra para a placa réplica, utilizando um líquido de manuseamento de múltiplas robótico.
   Nota: Para favorecer a secreção de enzima é aconselhável substituir o péptido de sinal nativa da proteína alvo por péptidos de sinal vulgarmente utilizados para expressão heteróloga em levedura (por exemplo, o factor de prepro-α líder, o líder do K ₁ da toxina assassina de S. cerevisiae, ou mesmo versões quiméricas de ambos os péptidos ^13). Alternativamente, o péptido sinal nativo pode ser evoluído exclusivamente para a secreção em levedura.
7. Adicionar 20 ul de p -methoxybenzylalcohol 2 mM em 100 mM de tampão fosfato de sódio pH 6,0, com a ajuda do robot de pipetagem. Agitar as placas brevemente com uma de 96 nósLL misturador de placas e incubar durante 30 min à TA.
8. Com o robot de pipetagem, adicionar 160 ul do reagente FOX para cada placa de réplica e agita-se brevemente com o misturador (concentração final de mistura FOX no poço: 100 uM de xilenol laranja, 250 ^ M de Fe (NH _{4) 2} (SO _{4) 2} e mm H 25 ₂ SO _4).
   1. Adicionar vários aditivos para o reagente para aumentar a sensibilidade, tais como co-solventes orgânicos (DMSO, etanol, metanol) ou sorbitol ^17. Aqui, amplificar a resposta por adição de sorbitol a uma concentração final de 100 mM (figura 4).
9. Ler as placas (modo de ponto final, t ₀₎ a 560 nm num leitor de placas.
10. Incubar as placas à temperatura ambiente até a cor se desenvolve e medir novamente a absorção (T _1).
    1. Calcula-se a actividade relativa da diferença entre o valor Abs após a incubação e a da medição inicial normalizada com base na pareTipo ntal para cada placa (Dt ₁ - t _0).
11. Sujeitar os melhores hits mutantes para dois re-exames consecutivos para excluir falsos positivos.
    Nota: Tipicamente, re-rastreios incluem isolamento de plasmídeos a partir de levedura, amplificação e purificação em Escherichia coli, seguido de transformação de células de levedura fresca com o plasmídeo ^19. Cada clone seleccionado é re-exibido em pentaplicate.

Resultados

AAO de P. eryngii é um flavooxidase extracelular que abastece as peroxidases fúngicas com H ₂ O ₂ para começar a atacar a lignina. Dois segmentos de AAO foram submetidos a evolução focada-dirigido por MORPHING, a fim de melhorar a sua actividade e a sua expressão em S. cerevisiae ^19. Independentemente das enzimas estrangeiras abrigadas por S. cerevisiae, o problema mais crítico, quando a construção de bibliotecas de mut...

Discussão

Neste artigo, nós resumimos a maioria das dicas e truques empregados no nosso laboratório para projetar enzimas por evolução dirigida em S. cerevisiae (AAO utilizando como exemplo) de modo que eles podem ser adaptados para utilização com muitos outros sistemas enzima eucariótica, simplesmente seguindo a abordagem comum descrito aqui.

Em termos de criação de biblioteca, Metamorfose é um método one-pot rápido para introduzir e recombinar mutações aleatórias em trechos d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Culture media
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Yeast Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	For error prone PCR
Name	Company	Catalog Number	Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9001S
XhoI restriction enzyme	New England Biolabs	R0146S
Not I restriction enzyme	New England Biolabs	R0189S
Gel Red	Biotium	41003	For staining DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name	Company	Catalog Number	Comments
5. Agarose gel stuff
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA analysis dye
GeneRuler 1kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Low-melting temperature agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
6. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465	LGC Promochem	ATTC 208289	Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells	Agilent genomics	200150	For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmid extraction from yeast
Name	Company	Catalog Number	Comments
7. Plates
96-well plates	Greiner Bio-One	655101	Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)
96-well plates	Greiner Bio-One	655161	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid	Greiner Bio-One	656171	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)