Diretto Evolution Metodo<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Creazione e screening

Riepilogo

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Evoluzione diretta in Saccharomyces cerevisiae offre molti vantaggi interessanti nella progettazione di enzimi per applicazioni biotecnologiche, un processo che prevede la realizzazione, la clonazione e l'espressione di biblioteche mutante, accoppiato ad alta frequenza omologa ricombinazione del DNA in vivo. Qui, vi presentiamo un protocollo per creare e biblioteche schermo mutanti di lievito in base l'esempio di un fungina aril-alcol ossidasi (AAO) per migliorare la sua attività totale. Due segmenti proteici sono stati sottoposti ad evoluzione focalizzata diretto mediante mutagenesi casuale e in vivo ricombinazione DNA. Le sporgenze di ~ 50 bp fiancheggianti ogni segmento ammessi corretto rimontaggio del gene AAO-fusione in un vettore linearizzato dando luogo ad una completa plasmide autonomamente replicare. Librerie Mutant arricchiti con varianti funzionali AAO sono stati proiettati in S. surnatanti cerevisiae con un saggio ad alta sensibilità basato sulla reazione di Fenton. Il processo generale dicostruzione della libreria a S. cerevisiae qui descritto può essere facilmente applicato ad evolversi molti altri geni eucarioti, evitando reazioni PCR in più, in vitro di ricombinazione del DNA e legatura passi.

Introduzione

Evoluzione molecolare diretto è un metodo affidabile, veloce e affidabile per progettare enzimi ^{1, 2.,} Attraverso cicli iterativi di casuali mutazioni, ricombinazione e lo screening, le versioni migliorate di enzimi possono essere generati che agiscono sui nuovi substrati, nelle reazioni romanzo, a non naturale ambienti, o anche per assistere alla cella di raggiungere nuovi obiettivi metabolici ^3-5. Tra i padroni di casa utilizzate in evoluzione diretta, di birra lievito Saccharomyces cerevisiae offre un repertorio di soluzioni per l'espressione funzionale di proteine ​​eucariotiche complesse che non sono altrimenti disponibili in controparti procarioti ^6,7.

Utilizzato esaustivamente in studi di biologia cellulare, questo piccolo modello eucariote ha molti vantaggi in termini di modificazioni post-traduzionali, la facilità di manipolazione e trasformazione di efficienza, che sono tutti tratti importanti per progettare enzimi dalla evoluzione diretta ^8. Inoltre, l'alta frequenzadi omologa ricombinazione del DNA a S. cerevisiae accoppiato al suo apparato a prova di lettura efficiente apre una vasta gamma di possibilità per la creazione di una biblioteca e di assemblaggio genica in vivo, favorendo l'evoluzione dei sistemi diversi da singoli enzimi per vie artificiali complessi ^9-12. Il nostro laboratorio ha trascorso gli ultimi dieci anni la progettazione di strumenti e strategie per l'evoluzione molecolare di diverse ligninases nel lievito (ossidoriduttasi coinvolti nella degradazione della lignina durante il decadimento legno naturale) ^13-14. In questa comunicazione, vi presentiamo un protocollo dettagliato per la preparazione e le librerie schermo mutanti in S. cerevisiae per un modello flavooxidase, arile-alcol ossidasi (AAO ¹⁵⁾ -, che può essere facilmente tradotto a molti altri enzimi. Il protocollo prevede un metodo di evoluzione mirata-diretto (MORPHING: mutageni organizzata ricombinazione omologa processo da in vivo raggruppamento) assistito dall'apparato cellula di lievito ^16, unda test di screening molto sensibile basato sulla reazione di Fenton per rilevare l'attività all'AAO secreta nel brodo di coltura ^17.

Protocollo

1. Mutant Biblioteca Edilizia

1. Visita le regioni da sottoporre a MORPHING con l'aiuto di algoritmi di calcolo basati sui modelli di struttura di cristallo o di omologia disponibili ^18.
   1. Qui, indirizzare due regioni di AAO da Pleurotus eryngii per mutagenesi casuale e ricombinazione (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), mentre amplificando il resto del gene (844 bp) di alta fedeltà PCR (Figura 1).
      Nota: Diversi segmenti possono essere studiati morphing in modo indipendente o combinata ^16.
2. Amplificare le zone interessate dal mutageno PCR. Creare zone tra i segmenti (~ 50 bp ciascuno) si sovrappongono sovrapponendo reazioni PCR delle regioni definite.
   1. Preparare mutageno PCR di segmenti target in un volume finale di 50 ml contenenti DNA stampo (0,92 ng / mL), 90 nM oligo senso (RMLN per segmento MI e AAO-BP per il segmento M-II), 90 nM di unntisense Primer (AAO-92C per il segmento MI e RMLC per il segmento M-II), 0,3 mM dNTP (0,075 mM ciascuno), 3% (v / v) dimetilsolfossido (DMSO), 1,5 mM MgCl _2, 0,05 mM MnCl ₂ e 0,05 U / ml Taq DNA polimerasi. Primer sequenze sono descritti in Figura 1.
   2. Utilizzare il seguente programma PCR: 95 ° C per 2 min (1 ciclo); 95 ° C per 45 sec, 50 ° C per 45 sec, 74 ° C per 45 sec (28 cicli); e 74 ° C per 10 min (1 ciclo).
3. Amplificare le regioni non mutageni con ultra-alto polimerasi fedeltà e comprende anche le zone di sovrapposizione corrispondenti segmenti mutageni e / o sbalzi vettore linearizzati.
   1. Preparare miscele di reazione in un volume finale di 50 ml contenente: template DNA (0,2 ng / ml), 250 nM oligo senso HFF, 250 nM oligo antisenso HFR, 0,8 mM dNTP (0,2 mM ciascuno), 3% (v / v) dimetilsolfossido (DMSO) e 0,02 U / ml iProof DNA polimerasi. Primer sequenze sono descritti in Figura 1.
   2. Utilizzare il seguente programma PCR: 98 ° C per 30 sec (1 ciclo); 98 ° C per 10 sec, 55 ° C per 25 sec, 72 ° C per 45 sec (28 cicli); e 72 ° C per 10 min (1 ciclo).
      Nota: Con le condizioni descritte in 1.2 e 1.3 sovrapposizioni di 43 bp (regione plasmide-M1); 46 bp (M1 regione regione-HF); 47 bp (HF regione-M2 regione) e 61 bp (M2 plasmide regione-) sono progettate (Figura 1) per favorire in vivo splicing nel lievito.
   3. Purificare tutti i frammenti di PCR (mutageni e non mutageni) con un kit di estrazione gel commerciale secondo il protocollo del produttore.
4. Linearizzare il vettore tale che regioni fiancheggianti di circa 50 bp sono creati che sono omologhi ai 5'- e 3'-estremità del gene bersaglio.
   1. Preparare una miscela di reazione linearizzazione contenente 2 mg di DNA, 7.5 U Bam HI, 7.5 U Xho I, 20 mg BSA e 2 ml di tampone Bam HI 10x in un volume finale di 20 ul.
   2. Incubare la miscela di reazione a 37 ° C per 2 ore e 40 min. Successivamente, procedere con inattivazione a 80 ° C per 20 min.
5. Purificare il vettore linearizzato mediante estrazione gel di agarosio per evitare la contaminazione con il plasmide circolare residua (Figura 2).
   1. Caricare la miscela di reazione di digestione nel mega-well di un basso punto di fusione gel semi-preparativa (0,75%, w: v) e un'aliquota (5 ml) della miscela di reazione nella adiacente e reporter.
   2. Run DNA elettroforesi (5 V / cm tra gli elettrodi, 4 ᵒC) e separare il gel corrispondente al mega-bene e conservarlo a 4 ᵒC in 1x TAE.
   3. Macchia la corsia con la scala peso molecolare e il giornalista. Visualizzare le bande sotto la luce UV. Nick la posizione in cui i luoghi linearizzate vettore.
      Nota: Poiché la qualità del vettore linearizzato purificato è un critiFattore cal per ricombinazione di successo e di assemblaggio nel lievito, evitare di macchiare il gel per semi-preparativa elettroforesi del DNA. L'uso di coloranti e raggi UV per l'estrazione gel può influenzare la stabilità del vettore di DNA, compromettere l'efficienza vivo ricombinazione in. In alternativa ai coloranti EtBr tossici, Gel Rosso e coloranti SYBR sono comunemente usati per il gel di colorazione.
   4. In assenza di luce UV, di individuare il vettore linearizzato nel frammento mega-pozzetto utilizzando la guida dei nick nella corsia giornalista macchiato in modo che possa essere isolato.
   5. Estrarre il vettore linearizzato da agarosio e purificarla con un kit di estrazione gel commerciale secondo il protocollo del produttore.
      Nota: utilizzare ad alta copia vettori navetta episomiale con marcatori di antibiotici e auxotrofia: In questo esempio abbiamo impiegato il uracile indipendente e ampicillina resistenza pJRoC30 vettore, sotto il controllo del promotore di lievito GAL1.
6. Preparare un mi equimolarexture dei frammenti PCR e mescolare con il vettore linearizzato in un rapporto 2: 1, con non meno di 100 ng di plasmide linearizzato (prova differenti rapporti di biblioteca equimolare / vettore aperta per ottenere buone rese di trasformazione).
   1. Misurare l'assorbanza dei frammenti di PCR e vettore linearizzato a 260 nm e 280 nm per determinare la loro concentrazione e purezza.
7. Trasformare cellule competenti di lievito con la miscela di DNA utilizzando un kit di lievito di trasformazione commerciale (vedi tabella per le forniture) in base alle istruzioni del produttore.
   1. Qui, usare una proteasi carente e URA3 ^- dipendente S. ceppo cerevisiae, BJ5465. Trasformare le cellule con il vettore circolarizzato parentale come standard interno durante lo screening (vedi sotto). Inoltre, controllare il fondo trasformando il vettore linearizzato in assenza di frammenti di PCR.
      Nota: In caso di rilevamento di livelli iniziali di secrezione bassi, usare S.cerevisiae proteasi ceppi carenti come BJ5465 per favorire l'accumulo di proteina attiva in sovranatanti. Se l'enzima bersaglio subisce hyperglycosylation, l'uso di ceppi glicosilazione-deficienti (ad esempio, Δ kre2 che è solo in grado di associare piccoli oligomeri mannosio) potrebbe essere una scelta adatta.
8. Piastra le cellule trasformate su SC piastre di abbandono e incubare a 30 ° C per tre giorni. Piastra (su SC piastre di abbandono integrato con uracile) URA3 ^- S. cellule cerevisiae prive plasmide come controllo negativo per lo screening (vedi sotto).

2. Alta-Throughput Screening Assay (Figura 3)

1. Riempire un numero appropriato di sterili piastre da 96 pozzetti (23 piastre per analizzare una libreria di cloni 2.000) con 50 microlitri terreno minimo per pozzetto con l'aiuto di un robot pipettamento.
2. Scegli singole colonie dalla SC-drop out piatti e trasferirli alle piastre a 96 pozzetti.
   1. In ogni piatto, inoculare numero di colonna 6 con il tipo parentale come standard interno e ben H1 con URA3 ^- S. cellule cerevisiae (in media SC supplementato con uracile) senza plasmide come controllo negativo.
      Nota: Beh H1 è riempito in particolare con i media di abbandono integrati con uracile. Un supporto vuoto pozzetto contenente senza cellule può essere preparata anche come controllo di sterilità aggiuntivo.
3. Coprire le piastre con i loro coperchi e avvolgerli in Parafilm. Incubare le piastre per 48 ore a 30 ° C, 225 rpm e 80% di umidità relativa in un agitatore umido.
4. Rimuovere il Parafilm, aggiungere 160 ml di mezzo di espressione ad ogni pozzetto con l'aiuto del robot pipettaggio, sigillare le piastre e incubare per altre 24 ore.
   Nota: terreno minimo e medio espressione sono preparati come riportato altrove ^19. livelli di secrezione possono variare a seconda del gene in esame e, di conseguenza, tha incubazione devono essere ottimizzati in ogni caso a sincronizzare la crescita cellulare in tutti i pozzetti.
5. Centrifuga i piatti (master) a 2.800 x g per 10 minuti a 4 ° C.
6. Trasferire 20 ml di surnatante dai pozzetti della piastra master piastra replica utilizzando una movimentazione multistazione robotico liquido.
   Nota: Per favorire la secrezione di enzimi si consiglia di sostituire il segnale peptide nativo della proteina bersaglio da peptidi segnali comunemente utilizzati per l'espressione eterologa in lievito (ad esempio, il fattore α prepro-leader, il leader del K ₁ Killer tossina da S. cerevisiae, o anche versioni chimeriche di entrambi i peptidi ^13). In alternativa, il peptide segnale nativo può essere evoluto esclusivamente per la secrezione nel lievito.
7. Aggiungere 20 ml di 2 mM p -methoxybenzylalcohol a 100 mM sodio fosfato tampone pH 6.0 con l'aiuto del robot pipettamento. Mescolare le piastre brevemente con un 96-noill mixer piastra e incubare per 30 minuti a RT.
8. Con il robot pipettaggio, aggiungere 160 ml di reagente FOX per ciascuna piastra replica e mescolare brevemente con il mixer (concentrazione finale di miscela FOX nel pozzo: 100 mM xilenolo arancio, 250 mM Fe (NH _{4) 2} (SO _{4) 2} e 25 mM H ₂ SO _4).
   1. Aggiungere più additivi al reagente per migliorare la sensibilità, come co-solventi organici (DMSO, etanolo, metanolo) o sorbitolo ^17. Qui, amplificare la risposta con l'aggiunta di sorbitolo ad una concentrazione finale di 100 mM (Figura 4).
9. Leggere le piastre (modalità end-point, t ₀₎ a 560 nm su un lettore di piastre.
10. Incubare le piastre a temperatura ambiente fino a quando il colore si sviluppa e misurare nuovamente l'assorbimento (t _1).
    1. Calcolare l'attività relativa dalla differenza tra il valore Abs dopo incubazione e quella della misurazione iniziale normalizzati al pareTipo ntale per ogni piastra (Dt ₁ - t _0).
11. Sottoporre i migliori successi mutanti a due ri-proiezioni consecutive per escludere falsi positivi.
    Nota: Tipicamente, ri-proiezioni includono isolamento plasmidico dal lievito, amplificazione e purificazione in Escherichia coli, seguita da trasformazione di cellule di lievito fresco con il plasmide ^19. Ogni clone selezionato è ri-proiettato in pentaplicate.

Risultati

AAO da P. eryngii è un flavooxidase extracellulare che fornisce perossidasi fungine con H ₂ O ₂ per iniziare attaccare lignina. Due segmenti di AAO stati sottoposti a evoluzione focalizzata-diretto da MORPHING al fine di migliorare la sua attività e la sua espressione in S. cerevisiae ^19. Indipendentemente dalle enzimi stranieri nutriti da S. cerevisiae, la questione più critica quando la costruzione di librerie di mutanti ne...

Discussione

In questo articolo, abbiamo riassunto la maggior parte dei suggerimenti e trucchi impiegati nel nostro laboratorio per progettare enzimi dalla evoluzione diretta a S. cerevisiae (utilizzando AAO come esempio) in modo che possano essere adattati per l'uso con molti altri sistemi enzimatici eucariotica semplicemente seguendo l'approccio comune descritti qui.

In termini di creazione di biblioteca, Morphing è un metodo rapido one-pot di introdurre e ricombinare le mutazioni cas...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Culture media
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Yeast Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	For error prone PCR
Name	Company	Catalog Number	Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9001S
XhoI restriction enzyme	New England Biolabs	R0146S
Not I restriction enzyme	New England Biolabs	R0189S
Gel Red	Biotium	41003	For staining DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name	Company	Catalog Number	Comments
5. Agarose gel stuff
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA analysis dye
GeneRuler 1kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Low-melting temperature agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
6. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465	LGC Promochem	ATTC 208289	Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells	Agilent genomics	200150	For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmid extraction from yeast
Name	Company	Catalog Number	Comments
7. Plates
96-well plates	Greiner Bio-One	655101	Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)
96-well plates	Greiner Bio-One	655161	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid	Greiner Bio-One	656171	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)