בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

Summary

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

אבולוציה מכוונת ב שמר אפייה מציעה יתרונות רבים אטרקטיביים בעת תכנון אנזימים עבור יישומים ביוטכנולוגיים, תהליך כרוך בבנייה, שיבוט וביטוי של ספריות מוטציה, מצמיד את רקומבינציה DNA בתדר גבוה ההומולוגית in vivo. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצור ספריות מוטציה מסך בשמרים המבוססת על הדוגמא של מונואמין aryl-אלכוהול פטרייתי (AAO) כדי לשפר את הפעילות הכוללת שלה. שני מקטעי חלבון היו נתונים האבולוציה ממוקד בבימויו של mutagenesis אקראי וב רקומבינציה DNA vivo. מסוכך של ~ 50 נ"ב איגוף בכל מגזר אפשר וההרכבה הנכונה של גן AAO-פיוז'ן וקטור לינארית והוליד פלסמיד משכפלים מלא באופן אוטונומי. ספריות Mutant מועשרות גרסות פונקציונליות AAO הוקרנו ס supernatants cerevisiae עם assay תפוקה גבוהה רגיש המבוססת על התגובה פנטון. התהליך הכללי שלבניית ספרייה ב ס cerevisiae המתואר כאן יכול בקלות להיות מיושם להתפתח גני האיקריוטים רבים אחרים, הימנעות PCR תגובות נוספות, ב- DNA במבחנת צעדי רקומבינציה קשירה.

Introduction

אבולוציה מולקולרית בימוי היא שיטה חזקה, מהירה ואמינה לעצב אנזימים ^{1, 2.} דרך סיבובים איטרטיבי של מוטציות אקראיות, רקומבינציה הקרנה, הגירסות משופרות של אנזימים יכולות להיוצר שפועלים על מצעים חדשים, בתגובות רומן, ב שאינו טבעי סביבות, או אפילו כדי לסייע התא כדי להשיג את המטרות מטבוליות חדשות ^3-5. בין המארחים המשמשים אבולוציה מכוונת, את cerevisiae Saccharomyces שמרי בירה מציע רפרטואר של פתרונות עבור הביטוי הפונקציונלי של חלבונים איקריוטיים מורכבים שאינם זמינים אחרת עמיתיהם פרוקריוטים ^6,7.

משומשים ממצה מחקרים בביולוגיה של התא, מודל אוקריוטים הקטן הזה יש יתרונות רבים מבחינת שלאחר translational שינויים, קלות ויעילות מניפולציה וטרנספורמציה, שכולן הן התכונות החשובות להנדס אנזימים על ידי אבולוציה מכוונת ^8. יתר על כן, תדירות גבוההשל רקומבינציה DNA ההומולוגית ס cerevisiae מצמיד את מנגנון הוכחת הקריאה היעיל בה פותח מגוון רחב של אפשרויות ליצירת ספרייה והרכבת גני in vivo, טיפוח האבולוציה של מערכות שונות אנזימים יחידים מסלולים מלאכותיים מורכבים ^9-12. המעבדה שלנו בילתה את העשור האחרון בעיצוב כלים ואסטראטגי עבור האבולוציה המולקולרית של ligninases השונה בשמרים (oxidoreductases מעורב השפלה של ליגנין במהלך דעיכת עץ טבעית) ^13-14. בתקשורת זו, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להכין וספריות מוטצית מסך ס cerevisiae עבור מודל flavooxidase, מונואמין -aryl-אלכוהול (AAO ¹⁵⁾ -, כי יכול להיות מתורגם בקלות אנזימים רבים אחרים. הפרוטוקול כרוך שיטת אבולוציה ממוקדת מכוון (Morphing: תהליך רקומבינציה מוטגנים מאורגן על ידי הומולוגי in vivo קיבוץ) נעזרה במנגנון שמרים תא ^16, גידולassay ההקרנה מאוד רגיש דה המבוססת על התגובה פנטון על מנת לזהות פעילות AAO מופרש לתוך המרק תרבות ^17.

Protocol

1. בניית ספריית Mutant

1. בחרו את האזורים להיות חשופים Morphing בעזרת אלגוריתמים חישוביים המבוססים על מודלי הומולוגית מבנה או קריסטל הזמין ^18.
   1. כאן, למקד שני אזורים של AAO מ Pleurotus eryngii עבור mutagenesis ו רקומבינציה אקראית (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), תוך הגברה והשאר של הגן (844 נ"ב) על ידי באיכות גבוהה PCR (איור 1).
      הערה: מקטעים אחדים ניתן ללמוד על ידי Morphing באופן עצמאי או בשילוב ^16.
2. הגבר את האזורים שהותקפו על ידי מוטגנים PCR. צור חפיפה בין אזורים ובין מגזרים (~ 50 נ"ב כל אחד) על ידי superimposing PCR תגובות של האזורים המוגדרים.
   1. כן PCR מוטגנים של מגזרים ממוקדים נפח סופי של 50 μl המכילים תבנית ה- DNA (0.92 ng / μl), 90 תחושת אוליגו ננומטר (RMLN עבור המגזר אמ"ן AAO-BP עבור המגזר M-II), 90 ננומטרפריימר ntisense (AAO-92C עבור מגזר אמ"ן RMLC עבור מגזר M-II), 0.3 מ"מ dNTPs (0.075 מ"מ כל אחד), 3% (v / v) dimethylsulfoxide (DMSO), 1.5 מ"מ ₂ MgCl, 0.05 מ"מ MnCl ₂ ו 0.05 U / μl פולימראז תקי DNA. רצפי Primers מפורטים באיור 1.
   2. השתמש תוכנית ה- PCR הבאה: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות (1 מחזור); 95 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, 50 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, 74 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות (28 מחזורים); ו -74 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות (1 מחזור).
3. הגבר את האזורים שאינם מוטגנים עם פולימראז נאמנות הגבוהה במיוחד וכולל אזורים המקבילים חופפי המגזרים מוטגנים / או סככות וקטור הוא לינארית.
   1. הכן תערובת התגובה בנפח סופי של 50 μl המכיל: תבנית ה- DNA (0.2 ng / μl), 250 ננומטר תחושה אוליגו HFF, 250 HFR antisense אוליגו ננומטר, 0.8 מ"מ dNTPs (0.2 מ"מ כל אחד), 3% (v / v) dimethylsulfoxide (DMSO) ו 0.02 U / μl iproof DNA פולימרז. רצפי Primers מפורטים איור 1.
   2. השתמש תוכנית ה- PCR הבאה: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (1 מחזור); 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 25 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות (28 מחזורים); ו -72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות (1 מחזור).
      הערה: עם התנאים המתוארים 1.2 ו -1.3 חפיפות של 43 נ"ב (אזור פלסמיד-M1); 46 נ"ב (אזור לאזור HF M1); 47 נ"ב (אזור-M2 HF באזור) ו -61 נ"ב (פלסמיד אזור- M2) נועדו (איור 1) להעדיף ב שחבור vivo בשמרים.
   3. לטהר את כל שברי PCR (מוטגנים הלא מוטגנים) עם ערכת חילוץ ג'ל מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן.
4. Linearize וקטור כך איגוף אזורים של כ -50 נ"ב נוצרים כי הם הומולוגיים אל 5'- ו 3'-הקצוות של גן המטרה.
   1. הכינו תערובת התגובה לינאריזציה המכיל 2 מיקרוגרם DNA, 7.5 U בם HI, 7.5 U Xho לי, 20 מיקרוגרם BSA ו -2 μl של הצפת Baמ HI 10x בנפח סופי של 20 μl.
   2. דגירת תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ו -40 דקות. לאחר מכן, להמשיך עם איון על 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
5. לטהר את הווקטור לינארית על ידי מיצוי ג'ל agarose כדי למנוע זיהום עם הפלסמיד העגול שיורית (איור 2).
   1. טען את תערובת התגובה העיכול אל-היטב מגה של ג'ל agarose נקודת התכה נמוכה חצי preparative (0.75%, w: נ) וכן aliquot (5 μl) של תערובת התגובה ב הסמוך גם ככתב.
   2. הפעלה אלקטרופורזה DNA (5 V / ס"מ בין האלקטרודות, 4 ᵒC) ולהפריד את הג'ל agarose המתאים היטב מגה ולאחסן אותו ב 4 ᵒC ב 1x טה.
   3. כתם השביל עם סולם המשקל המולקולרי ואת הכתב. דמיינו את הלהקות תחת אור UV. ניק במצב שבו מקומות הווקטור לינארית.
      הערה: ככל איכות הווקטור לינארית המטוהר היא critiגורם cal עבור רקומבינציה והרכבה מוצלחת בשמרים, להימנע מכתים ג'ל אלקטרופורזה DNA חצי preparative. השימוש של צבעים וחשיפת UV להפקת ג'ל עשוי להשפיע על היציבות של וקטור DNA, להתפשר על יעילות רקומבינציה vivo. כפי אלטרנטיבת צבעי EtBr רעילים, ג'ל אדום וצבעי SYBR משמשים עבור מכתים ג'ל.
   4. בהיעדר אור UV, לזהות את הווקטור לינארית ב שהבר מגה-גם באמצעות הדרכתו של ניקס בנתיב הכתב המוכתם כך שהוא יכול להיות מבודד.
   5. חלץ את הווקטור לינארית מ agarose ולטהר אותו עם ערכת חילוץ ג'ל מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן.
      הערה: וקטורים הסעות episomal גבוהה עותק השתמש בטושים אנטיביוטיקה auxotrophy: בדוגמה זו שיישמנו אורציל עצמאית אמפיצילין התנגדות וקטור pJRoC30, תחת שליטה של האמרגן שמרים GAL1.
6. הכן מיל equimolarxture של שברי PCR ומערבב אותו עם הווקטור לינארית ב יחס של 2: 1, עם לא פחות מ -100 ננוגרם של פלסמיד לינארית (יחסים שונים במבחן וקטור equimolar ספרייה / פתוח להשיג תשואות טרנספורמציה טובות).
   1. מדוד את הספיגה של שברי PCR ו הווקטור לינארית ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר כדי לקבוע הריכוז והטוהר שלהם.
7. Transform בתאי שמרים מוסמך בתערובת DNA באמצעות ערכת טרנספורמציה שמרים מסחרית (ראה טבלה עבור אספקה) על פי הוראות היצרן.
   1. הנה, להשתמש פרוטאז לקוי URA3 ^- תלוי ס זן cerevisiae, BJ5465. להפוך את התאים עם וקטור circularized הורית כסטנדרט פנימי במהלך ההקרנה (ראה להלן). בנוסף, לבדוק את הרקע על ידי הפיכת הווקטור לינארית בהעדר שבר PCR.
      הערה: במקרה של התגלה רמות הפרשה נמוכות ראשוניות, השתמש סcerevisiae פרוטאז זנים לקוי כמו BJ5465 לטפח הצטברות של חלבון פעיל supernatants תרבות. אם אנזים היעד עובר hyperglycosylation, שימוש זני glycosylation מחסר (למשל, Δ kre2 כי הוא מסוגל רק הצמדת oligomers מנוז הקטן) יכול להיות אופציה מתאימה.
8. פלייט תאי טרנספורמציה על צלחות נשירת SC הדגירה אותם ב 30 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים. פלייט (על צלחות הנשירה SC בתוספת אורציל) URA3 ^- ס תאי cerevisiae חסרי פלסמיד כביקורת שלילית להקרנה (ראה להלן).

2. תפוקה גבוהה הקרנת Assay (איור 3)

1. מלאו מספר מתאים של 96-גם צלחות סטרילי (23 צלחות לנתח ספרייה של 2,000 שיבוטים) עם 50 μl בינוניים מינימאלי לכל טוב בעזרת רובוט pipetting.
2. פיק מושבות בודדות מתוך SC-נושרים צלחות ולהעבירם צלחות 96-היטב.
   1. בכל צלחת, לחסן מספר העמודה 6 עם סוג הורית כסטנדרט פנימי היטב H1 עם URA3 ^- ס תאים cerevisiae (במדיום SC בתוספת אורציל) ללא פלסמיד כביקורת שלילית.
      הערה: ובכן H1 מלא במיוחד עם התקשורת הנשירה בתוספת אורציל. מדיה ריק היטב המכיל ללא תאים ניתן להכין גם כפקד עקרות נוספים.
3. מכסים את הצלחות עם העפעפיים שלהם ועוטפים אותם Parafilm. דגירת צלחות עבור 48 שעות ב 30 מעלות צלזיוס, 225 סל"ד ולחות יחסית 80% שייקרו ולח.
4. הסר את Parafilm, להוסיף 160 μl של מדיום ביטוי היטב כל בעזרת רובוט pipetting, לאטום את צלחות דגירה אותם במשך שעות 24 נוספות.
   הערה: בינוני מינימל ובינוני ביטוי ערוך כפי שדווחו במקומות אחרים ^19. רמות ההפרשה עשויות להשתנות תלויים הגן נחקר ובהתאם, tהוא הדגירה פעמים חייבות להיות מותאמות בכל מקרה לסנכרן את צמיחת תאים בכל הבארות.
5. צנטריפוגה צלחות (צלחות אב) ב 2,800 x ז במשך 10 דקות ב 4 ° C.
6. העברת 20 μl של supernatant מבארות בצלחת המאסטר לצלחת העתק באמצעות נוזל טיפול multistation רובוטית.
   הערה: כדי להעדיף הפרשת אנזים רצוי להחליף את הפפטיד אות יליד חלבון המטרה על ידי פפטידים אות נפוצים ביטוי Heterologous בשמרים (למשל, גורם α prepro-המנהיג, המנהיג של הרעלן Killer ₁ K מ ס cerevisiae, או גרסאות כימרי אפילו של שני פפטידים ^13). לחלופין, הפפטיד אות היליד ניתן התפתח באופן בלעדי עבור הפרשה בשמרים.
7. הוסף 20 μl של 2 מ"מ p -methoxybenzylalcohol ב- pH חיץ פוספט נתרן 100 מ"מ 6.0 בעזרת הרובוט pipetting. מערבבים את צלחות בקצרה עם 96-אנחנוll מערבל צלחת דגירה אותם במשך 30 דקות ב RT.
8. עם רובוט pipetting, להוסיף 160 μl של מגיב FOX על כל צלחת העתק ומערבבים בקצרה עם מערבל (הריכוז הסופי של תערובת FOX בבאר: 100 מיקרומטר xylenol כתום, 250 מיקרומטר Fe (NH _{4) 2} (SO _{4) 2} ו 25 מ"מ H ₂ SO _4).
   1. הוסף מספר ותוספות מגיבים כדי לשפר את הרגישות, כגון ממסי שיתוף אורגניים (DMSO, אתנול, מתנול) או סורביטול ^17. הנה, להגביר את התגובה על ידי הוספת סורביטול לריכוז סופי של 100 מ"מ (איור 4).
9. קראו את הצלחות (מצב נקודת סיום, _t0) ב 560 ננומטר על קורא צלחת.
10. דגירת הצלחות ב RT עד שצבע מפתחת מדידת הבליעה שוב (t _1).
    1. חשבתי את הפעילות היחסית מהפער בין שווי Abs לאחר דגירה וכי המדידה הראשונית מנורמל פאךקסוג פתיחות opening סגירות closures עבור כל צלחת (Δt ₁ - _t0).
11. נושא להיטי המוטציה הטובים ביותר לשני מחדש הקרנות רצופות כדי לשלול תוצאות חיוביות שגויות.
    הערה: בדרך כלל, מחדש הקרנות כוללות בידוד פלסמיד מן השמרים, הגברה וטיהור Escherichia coli, ואחריו טרנספורמציה של תאי שמרים טריים עם הפלסמיד ^19. כל כפיל שנבחר מחדש הוקרן pentaplicate.

תוצאות

AAO מ פ eryngii הוא flavooxidase תאי המספק peroxidases פטרייתי עם H ₂ O ₂ כדי להתחיל לתקוף ליגנין. שני קטעים של AAO היו נתוני אבולוציה ממוקדת בבימויו של Morphing כדי לשפר את פעילותה וביטויו ס cerevisiae ^19. בלא קשר עם אנזימים חוץ שטיפחו ס cerevisiae, הנוש?...

Discussion

במאמר זה, יש לנו סכמתי רוב הטיפים והטריקים המועסקים במעבדה שלנו להנדס אנזימים על ידי אבולוציה מכוונת ס cerevisiae (באמצעות AAO כדוגמא), כך שהם יכולים להיות מותאמים לשימוש עם מערכות אנזימים האיקריוטים רבות אחרות על ידי ביצוע הגישה הנפוצה פשוט המתואר כאן.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Culture media
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Yeast Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	For error prone PCR
Name	Company	Catalog Number	Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9001S
XhoI restriction enzyme	New England Biolabs	R0146S
Not I restriction enzyme	New England Biolabs	R0189S
Gel Red	Biotium	41003	For staining DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name	Company	Catalog Number	Comments
5. Agarose gel stuff
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA analysis dye
GeneRuler 1kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Low-melting temperature agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
6. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465	LGC Promochem	ATTC 208289	Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells	Agilent genomics	200150	For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmid extraction from yeast
Name	Company	Catalog Number	Comments
7. Plates
96-well plates	Greiner Bio-One	655101	Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)
96-well plates	Greiner Bio-One	655161	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid	Greiner Bio-One	656171	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)