진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

요약

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

초록

생체 내 고주파 DNA 상동 재조합에 결합 구성, 복제 및 돌연변이 라이브러리의 발현을 수반하는 처리를위한 응용 바이오 효소를 설계 할 때 사카 cerevisiae를 향하고 진화 매력적인 많은 장점을 제공한다. 여기서는 총 활성을 향상시키는 진균 아릴 알코올 산화 효소 (AAO)의 예에 기초하여 효모 및 화면 변이체 라이브러리를 제작하는 프로토콜을 제시한다. 두 단백질 세그먼트는 무작위 돌연변이에 의해 생체 내 DNA 재조합에 초점을 맞춘 지시 진화 하였다. 각 세그먼트의 측면에 50 ~ BP의 오버행 전체 자율적으로 복제하는 플라스미드에 초래하는 선형화 된 벡터에 AAO 융합 유전자의 정확한 재결합을 허용했다. 기능 AAO 변형 풍부 돌연변이 라이브러리는 S.에서 상영되었다 펜톤 반응을 이용한 고감도 높은 처리량으로 분석 cerevisiae의 상층 액. 의 일반적인 과정S.에서 라이브러리 건설 cerevisiae에 여분의 PCR 반응, 시험 관내 재조합 DNA 및 결찰 단계를 피하고, 여기에 설명 쉽게 많은 다른 진핵 유전자 발전에 적용될 수있다.

서문

감독 분자 진화는 효소 ^{1, 2를} 설계 할 수있는 강력하고 빠르고 안정적인 방법입니다. 비 자연에서 새로운 반응에, 새로운 기판에 작용 무작위 돌연변이, 재조합 및 검사, 효소의 개선 된 버전을 생성 할 수의 반복 라운드를 통해 환경, 또는 새로운 대사 ^{3-5 목표를} 달성하기 위해 셀을 지원한다. 직접 진화에 사용 된 호스트 사이에서, 맥주의 효모 사카로 마이 세스 세레 비지는 원핵 생물의 대응 ^6,7에서, 그렇지 않으면 사용할 수없는 복잡한 진핵 세포 단백질의 기능 발현을위한 솔루션의 레퍼토리를 제공합니다.

세포 생물학 연구에 철저 사용,이 작은 진핵 모델은 직접 진화 ^(8)에 의해 효소를 엔지니어링하는 중요한 특성입니다 모두 번역 후 변형, 조작 및 변환 효율의 용이성 측면에서 많은 장점을 가지고있다. 또한, 고주파S.에서 상동 DNA 재조합의 효율적인 증명 판독 장치에 연결 cerevisiae의 복잡한 인공 경로 ^9-12에 하나의 효소는 다른 시스템의 진화를 촉진, 생체 내에서 라이브러리 생성 및 유전자 조립을위한 가능성의 다양한 열립니다. 우리 연구소는 효모에서 다른 ligninases의 분자 진화 (천연 나무 붕괴시 리그닌의 분해에 관여하는 산화 환원 효소) ^{13 ~ 14를위한} 도구와 전략을 설계 지난 십을 보냈다. 이 통신에서 우리는 준비 S.에서 화면 돌연변이 라이브러리에 대한 자세한 프로토콜을 제시 모델 flavooxidase, 아릴 알코올 산화 효소 세레 비지에 (AAO ¹⁵⁾ -, 즉 쉽게 많은 다른 효소로 번역 할 수있다. 효모 전지 장치 ^(16), 도움을 (상동 생체 그룹화에 의한 돌연변이 유발 조직 된 재조합 과정 모핑) 프로토콜은 초점 지시 진화 방법을 포함한다배양액 ⁽¹⁷⁾ 내로 분비 AAO 활성을 검출하기 위해 펜톤 반응을 이용한 다 민감 스크리닝 분석법.

프로토콜

1. 돌연변이 라이브러리 생성

1. 선택 영역은 가능한 결정 구조 또는 상 동성 모델 ^(18)에 기초하여 계산 알고리즘의 도움으로 모핑을하여야한다.
   1. 여기에, 임의의 돌연변이와 재조합 (메트로 [α1] -Val109, Phe392 - Gln566), 고성능 PCR에 의한 유전자 (844 bp의)의 나머지를 증폭하는 동안 (그림 1)에 대한 새송이에서 AAO의 두 지역을 대상으로.
      참고 : 여러 세그먼트가 독립 또는 결합 방식으로 ¹⁶ 모핑으로 공부하실 수 있습니다.
2. 돌연변이 유발 PCR에 의해 대상 영역을 증폭. 정의 된 영역의 PCR 반응을 중첩하여 세그먼트 사이의 영역 (~ 50 bp의 각)를 중복 작성합니다.
   1. DNA 템플릿을 포함하는 50 μL (0.92 NG / μL), 90 나노 올리고 감각 (세그먼트 MI 세그먼트 M-II에 대한 AAO-BP에 대한 RMLN)의 최종 볼륨에서 대상 세그먼트의 돌연변이 PCR을 준비, 90 nM의 a를ntisense 프라이머 (세그먼트 M-II에 대한 세그먼트 MI 및 RMLC에 대한 AAO-92C), 0.3 밀리미터의 dNTPs (0.075 mM의 각), 3 % (v / v)의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO), 1.5 밀리미터의 MgCl _2, 0.05 mM의 MnCl _2, 0.05 이 U / μL의 Taq DNA 폴리머 라제. 프라이머 서열은 그림 1에 자세히 설명되어 있습니다.
   2. 다음 PCR 프로그램을 사용하여 2 분 (1주기) 95 ° C를; 45 초, 45 초 동안 50 ° C, 45 초 동안 74 ° C (28 회) 95 ° C; 10 분 (1주기) 74 ° C.
3. 초고 충실도 중합 효소와 비 돌연변이 영역을 증폭 및 돌연변이 세그먼트 및 / 또는 선형화 벡터 오버행 중복 해당 지역을 포함한다.
   1. 포함 된 50 μL의 최종 부피에 반응 혼합물을 준비 : DNA 템플릿 (0.2 NG / μL), 250 nM의 올리고 의미 HFF, 250 nm의 올리고 안티센스 HFR, 0.8 밀리미터의 dNTPs (0.2 mM의 각), 3 % (v / v)의 디메틸 설폭 (DMSO)와 DNA 중합 효소 iproof 0.02 U / μL. 프라이머 서열에 자세히 설명되어 <강한> 그림 1.
   2. 다음 PCR 프로그램을 사용하여 30 초 (1주기) 98 ° C를; 10 초, 25 초 동안 55 ° C, 45 초 동안 72 ° C (28 회) 98 ° C; 10 분 (1주기) 72 ° C.
      참고 : 1.2에 설명 된 조건 (43) BP (플라스미드-M1 영역)의 1.3 중복으로; 46 BP (M1 지역-HF 영역); 47 BP (HF 영역-M2 영역) 61 BP (M2 인 지역 플라스미드) 효모에서 생체 접합에서 선호하는 (그림 1) 설계되었습니다.
   3. 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 겔 추출 키트 (돌연변이 및 비 돌연변이) 모든 PCR 단편을 정제 하였다.
4. 약 50 염기쌍의 영역을 플 랭킹하는 것은 표적 유전자의 5'- 및 3'- 말단에 상동이 생성되도록 상기 벡터 선형화.
   1. 2 μg의 DNA, 7.5 U의 BamHI, 7.5 U을 XhoI, 버퍼 바 20 μg의 BSA 2 μl를 함유하는 선형 반응 혼합물을 제조20 μL의 최종 부피 m HI 배.
   2. 2 시간 40 분 동안 37 ℃에서 반응 혼합물을 인큐베이션. 그 후, 20 분 동안 80 ℃에서 불 활성화를 진행합니다.
5. 잔류 원형 플라스미드 (도 2)의 오염을 방지하기 위해, 아가 로스 겔 추출에 의해 선형화 된 벡터를 정제.
   1. 잘 기자로 인접에 반응 믹스의뿐만 아니라 나누어지는 (5 μL) : (V 승, 0.75 %) 세미 예비 저 융점 아가로 오스 겔의 메가 우물에 소화 반응 혼합물을로드합니다.
   2. 실행 DNA 전기 영동 (전극 사이에 5 V / cm, 4 ᵒC)과 메가 웰에 해당하는 아가 로스 겔을 분리하고 1X TAE 4 ᵒC에 저장합니다.
   3. 분자량 사다리 기자와 차선 얼룩. UV 빛 아래 밴드를 시각화합니다. 닉 위치 선형화 된 벡터 곳.
      주 : 정제 선형화 된 벡터의 품질이 criti이므로칼 요인은 효모에서 성공 재조합 및 조립, 반 예비 DNA 전기 영동 젤 염색을 피하십시오. 염료 및 겔 추출 UV 노광의 사용은 생체 내 재조합 효율 저하의 DNA 벡터의 안정성에 영향을 미칠 수있다. 독성 EtBr이 염료에 대한 대안으로, 젤 빨간색과 SYBR 염료는 일반적으로 겔 염색에 사용된다.
   4. UV 광이없는 경우,이 분리 될 수 있도록 염색 리포터 레인 닉의지도를 사용하여 메가 아니라 단편의 선형 벡터를 식별한다.
   5. 아가로 오스에서 선형화 된 벡터를 추출하고 제조 업체의 프로토콜에 따른 상업 겔 추출 키트를 정화.
      참고 : 항생제와 영양 요 마커를 사용하여 높은 복사 에피 솜 셔틀 벡터 : 우리는 효모 GAL1 프로모터의 제어하에, 우라실 독립적 인 암피실린 내성 pJRoC30 벡터를 사용이 예에서.
6. 같은 몰 마일을 준비PCR을 조각의 xture과 2에서 선형화 된 벡터와 함께 혼합 : 선형화 된 플라스미드없이 100 개 미만 NG로, 1 비율 (몰 라이브러리 / 오픈 벡터의 테스트 다른 비율은 좋은 형질 전환 수율을 달성하기 위해).
   1. 그 농도 및 순도를 결정하기 위하여 PCR 단편을 260 nm 내지 280 nm에서 선형화 된 벡터의 흡광도를 측정한다.
7. 상업적 효모 형질 전환 키트를 사용하여 DNA 혼합물로 효모 세포를 형질 전환 능력 제조업체의 지시에 따라 (공급 표 참조).
   1. 종속 S. ^- 여기서, 결핍 된 단백질 분해 효소와 URA3을 사용 cerevisiae의 변형, BJ5465. (아래 참조) 심사 중 내부 표준으로 부모의 고리 화 벡터와 세포를 변형. 또한, PCR 단편의 부재에서 선형화 된 벡터를 변환함으로써 배경을 확인한다.
      주 : 저 초기 분비 수준을 검출하는 경우, S.을 사용BJ5465 같은 cerevisiae의 단백질 분해 효소 결핍 균주 배양 상층 액에서 활성 단백질의 축적을 촉진합니다. 표적 효소를 과당 질화, 글리코 실화가 결핍 된 균주의 사용을 겪는 경우 (예, 오직 작은 만노스 올리고머 부착 할 Δ의 kre2)는 적절한 선택 될 수있다.
8. 접시 변환 SC 탈락 플레이트상에서 세포 및 3 일 동안 30 ° C에서 그들을 부화. 플레이트 (우라실 보충 SC 드롭 아웃 접시에) URA3 ^- S. 선별 음성 대조군으로 플라스미드가없는 cerevisiae의 세포 (아래 참조).

분석을 심사 2. 높은 처리량 (그림 3)

1. 피펫 로봇의 도움으로 잘 당 50 μl의 최소한의 매체 (2,000 클론의 라이브러리를 분석하기 위해 23 판) 멸균 96 웰 플레이트의 적절한 수를 입력합니다.
2. 판 밖으로 SC-드롭에서 개별 식민지를 선택하고 96 웰 플레이트로 전송.
   1. 각 플레이트에서, 부모의 내부 표준 타입과 잘 URA3와 H1에서와 열 번호 6 접종 ^- S.을 음성 대조군으로 더 플라스미드 (우라실 보충 SC 매체에서) cerevisiae의 세포.
      참고 : 음 H1은 우라실 보충 드롭 아웃 미디어 구체적으로 가득합니다. 세포가없는 웰 빈 함유 배지는 추가로 멸균 대조군으로서 제조 될 수있다.
3. 자신의 뚜껑 접시를 덮고 파라 필름에서 그들을 포장. 습기 통에서 30 ° C에서 48 시간, 225 rpm으로 80 %의 상대 습도에 대한 번호판을 품어.
4. 는 파라 필름을 제거 피펫 로봇의 도움으로 각 웰에 표현 매체의 160 μl를 추가, 번호판을 봉인하고 추가로 24 시간 동안 그들을 품어.
   참고 : ¹⁹ 다른보고 된 최소 배지 표현 매체가 제조된다. 분비 수준 t, 따라서 연구중인 유전자에 따라 달라질 수있다그 시간은 모든 웰에서 세포 성장을 동기화 각 경우에 최적화되어야 인큐베이션.
5. 원심 분리기 4 ° C에서 10 분 동안 2,800 X g에서 판 (마스터 판).
6. 이송 로봇 멀티 스테이션 처리 액을 사용하여 레플리카 플레이트 마스터 플레이트 웰로부터 상층 액 20 μL.
   참고 : 효소 분비를 선호하는 것이 일반적으로 효모에서 이종 발현 (에 사용되는 신호 펩타이드에 의해 표적 단백질의 기본 신호 펩타이드를 교체하는 것이 좋습니다 예를 들면, α 계수 prepro 리더, S.에서 K ₁ 킬러 독소의 지도자 세레 비지 또는 둘 펩티드 ^13)이라도 키메라 버전. 대안 적으로, 천연 신호 펩티드 독점적 효모 분비를 위해 전개 될 수있다.
7. 피펫 로봇의 도움으로 100 mM의 인산 나트륨 완충액 pH 6.0에서 2 mM의 P는 -methoxybenzylalcohol의 20 μl를 추가합니다. 96 우리 짧게 접시를 저어접시 믹서 LL RT에서 30 분 동안이를 부화.
8. 피펫 로봇으로, 각 복제 판에 FOX 시약 160 μl를 추가하고 잘 FOX 혼합물의 믹서 (최종 농도 짧게 저어 : 100 μM 크 실레 놀 오렌지, 250 μM 철 (NH _{4) 2} (SO _{4) 2} 25 mM의 H ₂ SO _4).
   1. 유기 공동 용매 (DMSO, 에탄올, 메탄올) 또는 소르비톨 ^(17)의 감도를 향상시키기 위해 시약에 여러 가지 첨가제를 추가합니다. 여기서, 100 밀리미터 (도 4)의 최종 농도 소르비톨을 첨가하여 반응을 증폭한다.
9. 접시 리더에서 560 nm에서 플레이트 (엔드 포인트 모드, t _0)를 참조하십시오.
10. 색상이 개발 될 때까지 RT에서 접시를 품어 다시 (t ₁₎ 흡수를 측정한다.
    1. 배양 후 애비 값의 차이에서 상대 활성을 계산하고 초기 측정의는 PARE에 정상화각 플레이트에 대한 ntal 유형 (의 Δt ₁ - t _0).
11. 오탐 (false positive)을 배제하기 위해 두 개의 연속 재 상영에 최적의 돌연변이 안타 대상으로 할 수 없다.
    주 : 일반적으로 재 스크리닝 플라스미드 ¹⁹ 신선한 효모 세포를 형질 전환 한 다음, 대장균의 효모, 증폭 및 정제로부터 분리 된 플라스미드를 포함한다. 선택한 각 클론 pentaplicate에서 다시 상영된다.

결과

P.에서 AAO 속 eryngii는 리그닌을 공격 시작 H ₂ O _2와 곰팡이 퍼 옥시다아제를 공급하는 세포 외 flavooxidase입니다. AAO의 두 세그먼트는 활성 및 S.에서의 발현을 향상시키기 위해서 모핑에 의해 집광 지향 진화 하였다 cerevisiae의 ^19. S.에 의해 숨겨 외국 효소에 관계없이 cerevisiae의 효모에서 돌연변이 라이브러리?...

토론

이 글에서, 우리는 팁과 트릭의 대부분은 S.의 감독 진화에 의해 효소를 엔지니어링하는 우리의 실험실에서 사용 요약 한 세레 비지에 (예를 들어 AAO 사용)들은 단순히 여기에 기술 된 일반적인 방법에 따라 많은 다른 진핵 효소 시스템과 함께 사용하도록 적응 될 수 있도록.

라이브러리 생성의 측면에서, 모핑 소개 ⁽¹⁶⁾ 변경되지 않은 단백질의 나머지 영...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Culture media
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Yeast Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	For error prone PCR
Name	Company	Catalog Number	Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9001S
XhoI restriction enzyme	New England Biolabs	R0146S
Not I restriction enzyme	New England Biolabs	R0189S
Gel Red	Biotium	41003	For staining DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name	Company	Catalog Number	Comments
5. Agarose gel stuff
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA analysis dye
GeneRuler 1kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Low-melting temperature agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
6. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465	LGC Promochem	ATTC 208289	Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells	Agilent genomics	200150	For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmid extraction from yeast
Name	Company	Catalog Number	Comments
7. Plates
96-well plates	Greiner Bio-One	655101	Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)
96-well plates	Greiner Bio-One	655161	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid	Greiner Bio-One	656171	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)